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Medicine

Murine Spinotrapezius Modell, um die Auswirkungen der Arteriolen Ligation auf mikrovaskuläre Funktion und Remodeling beurteilen

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Wir demonstrieren eine neuartige arteriellen Ligation Modell in murinen spinotrapezius Muskel, einschließlich eines Schritt-für-Schritt-Verfahren und der Beschreibung der erforderlichen Instrumente. Wir beschreiben die Chirurgie und relevante Outcome-Messungen in Bezug auf Gefäßnetz Umbau und funktionalen Gefäßerweiterung mittels intravitaler und konfokale Mikroskopie.

Abstract

Das murine spinotrapezius ist eine dünne, oberflächliche Stützende Muskel, der von T3 bis L4 erstreckt, und ist bequem über dorsalen Hautschnitt. Seine einzigartige Anatomie macht die spinotrapezius nützlich für die Untersuchung von ischämischen Schädigung und anschließende mikrovaskuläre Remodeling. Hier zeigen wir eine arteriolar Ligation Modell in der Maus spinotrapezius Muskel, der von unserem Forschungsteam entwickelt wurde und bereits veröffentlichten 1-3. Für bestimmte gefährdete Mausstämmen, wie der Balb / c-Maus, diese Ligation Operation zuverlässig erstellt Skelettmuskulatur Ischämie und dient als Plattform für die Untersuchung von Therapien, die Revaskularisierung zu stimulieren. Methoden der Bewertung werden auch gezeigt, einschließlich der Verwendung von intravital und konfokale Mikroskopie. Die spinotrapezius ist gut, solche bildgebenden Untersuchungen wegen seiner guten Erreichbarkeit (oberflächliche dorsale Anatomie) und der relativen Dünne (60-200 um) geeignet. Die spinotrapezius Muskel en face montiert werden, wodurchBildgebung von ganzen Muskeln mikrovaskulären Netzwerken ohne histologische Schnitte. Wir beschreiben die Verwendung von Intravitalmikroskopie Metriken nach einer funktionellen Vasodilatation Verfahrens zu erfassen; Insbesondere die Zunahme arterilar Durchmesser als Ergebnis der Muskelkontraktion. Wir zeigen auch die Verfahren zum Ernten und Festsetzung der Gewebe, ein notwendiger Vorläufer für Immunfärbung Studien und die Verwendung von Konfokalmikroskopie.

Introduction

Tiermodelle der chronischen Ischämie sind wertvolle Hilfsmittel zum Untersuchen der Pathophysiologie von ischämischen Erkrankungen, wie der peripheren arteriellen Erkrankungen, Koronararterienerkrankung und zerebrovaskuläre Erkrankung. Bei Nagetieren, wie beim Menschen, führt Arterienverschluss strukturelle Umbau des vaskulären Netzes, einschließlich der Arteriogenese und Angiogenese. Bei gesunden und jüngeren Patienten, kann dies Umbau ausreichend sein, um Gewebe von Ischämie-induzierten Verletzungen retten, aber Komorbiditäten wie Diabetes kann ernsthaft gefährden Umbau und Erholung. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Gefäßumbau Veranstaltungen ist essentiell für die Entwicklung von Therapien, die diese endogenen Revaskularisation zu stimulieren.

Derzeit ist Oberschenkelarterie Ligation oder Resektion im Hinterlauf das Standardverfahren zur Untersuchung chronischer Ischämie-induzierten vaskulären Remodeling bei Kleintieren 4,5. Analyse des Durchmessers, Konnektivität und Reaktivitätdie Mikrogefäße denen sich die Gefäßnetz stromabwärts des ligierten Oberschenkelarterie ist jedoch schwierig, aufgrund der Dicke der Muskeln. Einseitige Unterbindung der seitlichen Zuführung Arterie in dieser stabilisierenden Rückenmuskel 1: Wir haben eine arteriolar Ligation Modell in der Maus spinotrapezius Muskeln entwickelt. Die relativ dünnen spinotrapezius (60-200 um) zugänglich ist en face Immunfärbung für die Beurteilung der gesamten Netztopologie mit Single-Cell-Auflösung, so dass eine eingehende Prüfung der Gefäßumbau Ereignisse über das gesamte Gewebe. Die spinotrapezius ist auch oberflächlich und zugänglich, und damit seine Schiffe werden leicht durch Intravitalmikroskopie beobachtbar, zur effizienten Charakterisierung der Auswirkungen der Umbau und arteriolar Ligation auf die vaskuläre Reaktivität.

In diesem Bericht beschreiben wir im Detail und zeigen Sie die Maus spinotrapezius arteriolar Ligation Modell. Sowohl in vivo und ex vivo michthoden der Beurteilung nach einer Operation beschrieben werden, einschließlich der Messung von funktionellen Vasodilatation, die gezeigt wurde, unter ischämischen Bedingungen 6 beeinträchtigt werden, und Immunofluoreszenz Bildgebung von ganzem Muskel mikrovaskulären Netzwerke. Wir berücksichtigen auch Ergebnisse von zwei getrennten Pilotstudien um die Nützlichkeit des Modells zu demonstrieren. Ersten, verwendeten wir den arteriellen Ligation Modell, um eine statistisch signifikante Erhöhung der Behälter Tortuosität in C57BL / 6 Mäuse (2B) induzieren. Tortuosität steigt während Arteriogenese in Arteriole Sicherheiten. In anderen Mausstämmen, das anfälliger für Ischämie aufgrund der Abwesenheit von Sicherheiten Arteriolen (zB Balb / c), wird Kapillare Arterialisierung 10 beobachtet. Kapillare Arterialisierung wird durch erhöhte Durchmessern und der Entwicklung von α-Aktin des glatten Muskels Reaktivität nachgewiesen. Zweitens führt funktionale elektrische Stimulation des Muskels zur Vasodilatation im Terminal Arteriolen der spinotrapezius (3B).

Protocol

Ein. Spinotrapezius-Feed Artery Ligation Surgery

  1. Anästhesieren Maus durch intraperitoneale Injektion. In einer 0,5 ml-Spritze, formulieren: 0,06 ml 100 mg / ml Ketamin
    0,03 ml 20,0 mg / ml Xylazin
    0,01 ml von 0,4 mg / ml Atropin
    0,30 ml einer 0,9% igen Kochsalzlösung.
    Dosis: 0,01 ml je Gramm * Körpergewicht, ip

* Dose variable nach Mausstamm und Lager, entsprechend anzupassen, so Maus Erholung ist innerhalb einer Stunde nach Induktion.

  1. Übernehmen Standard-Augensalbe zur Hornhaut Austrocknung zu verhindern.
  2. Entfernen Sie Haare aus dem Rücken mit Trimmen Klipper, durch kurzzeitiges Anlegen Enthaarungscreme gefolgt.
  3. Desinfizieren Sie die OP-Feld mit Chlorhexidin oder PVP-Jod. Mögliche Povidonjod mit Ethanol dreimal, endend mit Povidon-Iod.
  4. Übertragen die Maus an den zuvor hergestellten chirurgischen Arbeitsfläche, mit Heizkissen und sterile Abdecktuchan Ort und Stelle.
  5. Erstellen Sie eine lineare Inzision (3-5 mm) durch die Rückenhaut ca. 5 mm kaudal der Knochenvorsprung des Schulterblattes mit Iris Schere und Standard-Muster Pinzette (zB FST, 11271-30) durch Zeltplanen das Gewebe und Schneiden parallel zur Wirbelsäule. Das Ziel Inzisionsstelle kann durch transdermale Visualisierung der dorsalen Fettpolster, wenn die Pigmentierung der Haut Genehmigungen identifiziert werden; geschnitten am kaudalen Rand der Fettpolster. Erweitern Sie den Schnitt nach Bedarf und erstrecken sich durch sekundäre Hautschichten durch Federkraft Schere.
    1. Anatomische note - Die spinotrapezius Muskel liegt dorsal und erstreckt sich von T4 bis L3 auf beiden Seiten entlang der Wirbelsäule. Der vordere Rand seitlich in etwa dem Schulterblatt. Der Muskel verjüngt im kaudalen Richtung, so dass die hinteren Rand medial liegt bis zum vorderen Rand und können vorsehen bündig mit der Wirbelsäule. Zwei fette Pads sind auch wichtig zu beachten, Verlegung direkt dorsalen und ventralen den spinotrapeziusMuskeln nach kranial Hälfte.
    2. Entzündung durch den Einschnitt hat sich gezeigt, keinen Einfluß auf die Reaktion haben Gefäßumbau als Schein Ligation Operation zeigte keine Änderung der Umbau des spinotrapezius Gefäßsystem. Zwei räumliche Faktoren tragen zu diesem Ergebnis. Zuerst wird durch den Einschnitt 5 mm in der kranialen Richtung von der interessierenden Region, wo die vaskuläre Reaktion im Muskel typischerweise untersucht wird entfernt. Zusätzlich wird die Einschnittstelle auf der Rückenhaut von dem Gefäß durch eine Ligationsstelle ventralen Fettpolster, die oben auf der kranialen Drittel des spinotrapezius Muskel liegt getrennt.
  6. Spülen Sie den Schnitt mit erwärmten Ringer-Lösung, um Muskeln Austrocknung zu verhindern. Anwendung Vasodilatatoren wie Papaverin in Visualisieren der Ziel-Arterie zur Ligation unterstützen.
  7. Unter einem Binokular, verwenden Pinzette stumpf sezieren und zu trennen (aber nicht entfernen) die dorsale weiß-Fettpolster aus dem zugrunde liegenden muscdere Gewebes, um die Vaskulatur visualisieren, wie es und gelangt verläßt den spinotrapezius auf seiner seitlichen Kante.
  8. Lokalisieren der Ziel-Arterie, die zusammen mit einer oder zwei gepaarten Venen, durchläuft die Fettpolster, die zu den ventralen spinotrapezius auf seinem Weg in dem seitlichen Rand des Muskels ist. Diese Arterie speist einen wesentlichen Teil des kaudalen Hälfte des Muskels, der durch Reflektieren und Ersetzen des Muskels, um den Pfad der Arterie innerhalb des Muskels zu beobachten bestätigt werden kann. Die Zielstelle für die Ligation ist das Segment der die Arterie Verlassen des ventralen Fettpolster und Eingabe des Muskels, und ist durchaus zugänglich in dieser Region. Die Arterie-Vene Paares müssen vorsichtig aus dem ventralen Fettpolster werden in diesem Bereich getrennt. Man beachte, dass die durch mehrere spinotrapezius Arterie-Vene-Paare gespeist wird, einschließlich der Schiffe, dass quer entweder die dorsalen und ventralen Fettpolster. Achten Sie darauf, diese Schiffe zu stören.
    1. Mehrere Indikatoren verwendet werden, um Arterien zu unterscheidenaus der Vene. Eine der besten Methoden ist, um sanft zu behindern den Blutfluss mit der Mikrosonde und bewegen Upstream vom Muskel; Förderstrom wird nicht in der Arterie wieder, bis das Hindernis freigegeben wird. Farbe kann auch verwendet werden, wie Venenwände eine weißliche Hülle aus Bindegewebe, Arterien fehlt enthalten. Ferner kann man den Durchmesser vor dem Auftragen von Vasodilator betrachten als Adern sind typischerweise größer.
  9. Die Arterie ist typischerweise in unmittelbarer Nähe zu seinem gepaarten Vene; verwenden stumpf mit einer Mikrosonde und # 5 Zange zu einer etwa 5 mm Segment zu isolieren, indem die Mikrosonde hinter der Arterie und mit der Spitze, um einen breiteren Spalt im natürlichen Make Kluft zwischen der Arterie und Vene. Dies ist der Spalt, durch den der Faden gefädelt werden.
  10. Verwendung 10-0 Single-Thread-Naht und Nadelhalter erfolgt eine Ligation um den Vorschub Arterie (~ 70 um Durchmesser) in Richtung des proximalen Endes des seziert Segment unter Verwendung eines Chirurgen Knoten. Place ein zusätzlicher Ligation zum distalen Ende des eingeschnittenen Arteriensegment mit ausreichender Trennung zwischen Ligaturen um Durchtrennung der Arterie zu ermöglichen.
    1. Die Kleinen mit der spinotrapezius Feed Arterie verbunden führt zu einer erhöhten operativen Schwierigkeiten, im Vergleich zu Ligation von einem größeren Schiff wie die Oberschenkelarterie. Unerfahrene Chirurgen besonders haben hohe Abriss, unbeabsichtigte Blutungen und andere chirurgische Komplikationen. Von besonderer Bedeutung ist die Schwierigkeit der Identifizierung und Schneiden des farblosen Arterie nach Flow hat gerade vor dem Schneiden behindert. Aus diesen Gründen wird Platzieren 2 Ligaturen für die ungewohnte dem Verfahren zu empfehlen, da der Chirurg eine visuelle Anleitung bei der Suche, wo die Arterie sowie eine Bestätigung der Schnitt mit dem leicht beobachtbar Trennung der 2 Ligaturen durchschneiden zu können. Jedoch kann ein erfahrener Chirurg finden eine einzige Ligatur ausreicht, solange sie in der Lage, eindeutigidentifizieren und schneiden die Arterie hinter der Ligatur. Während diese Technik reduziert das Risiko, ungewollt Nicking einen nahegelegenen Gefäßes mit der scharfen Ligation Nahtmaterial, ist es nicht ohne Nachteile, einschließlich der erhöhten Schwierigkeit bei der Bestätigung die Arterie durchtrennt wurde.
  11. Überprüfen Ligation durch Beobachten Verminderung der Durchblutung (RBC behindert Spalte) stromabwärts der Ligationsstelle (dh in Richtung des Muskel).
  12. Verwendung Präparierschere durchschneiden die ligierte Arterie, zwischen den zwei Ligaturen. Wenn nur eine Ligatur gelegt wurde (11a), mit äußerster Vorsicht in der stromabwärtigen Richtung zu schneiden.
  13. Wirkstoffbeladenen plain-Folie (1 mm) kann stromabwärts platziert werden (kaudal) als Teil des experimentellen Verfahrens.
  14. Positionieren Sie den Vertriebenen Faszie und Fettgewebe zu ihrer ursprünglichen Ausrichtung.
  15. Schließen Sie den Hautschnitt mit 8-0 nicht resorbierbaren Nahtmaterial. Dann legen Sie die Maus in eine vorbereitete beheizten Recovery Käfig unter Beobachtung und Verwaltung eines apchenden Analgetikum wie Bupivacain, 0,02-0,05 ml 0,25% lokale Infiltration.

2. Spinotrapezius Intravital Mikroskopie, in situ

  1. Anästhesieren die Maus in einer Ansaugkammer mit 3-4% Isofluran mit einer Flussrate von 3-4 L · min -1 von 100% Sauerstoff verdampft.
    1. Die Verwendung von Inhalat Anästhesie ist bevorzugt funktionelle Messungen, weil es weniger als kardiovaskuläre Depression mit injizierbaren Anästhetika. Wenn Inhalationstor Anästhesie in nicht verfügbar ist, langwirkende injizierbare Anästhetika, wie Natrium-Pentobarbital sind bevorzugt, um wiederholte Injektionen vermeiden wenn das Tier positioniert worden ist.
  2. Einmal betäubt, kontinuierlich zu liefern durch eine Narkosemaske (aka Bugspitze) Isofluran bei Wartung Konzentrationen (in der Regel ca. 2%) und Durchfluss von 0.5-1 L · min -1.
    1. Mäuse überwiegend durch ihre Nasengänge lüften, so ist es nur angEssary ihre Nase mit dem Narkosemaske Membran abdecken.
  3. Wenn nötig, entfernen Haare von hinten mit Trimmen Klipper und Enthaarungscreme.
  4. Transportieren Sie das Tier zum Heizkissen.
    1. Es ist wichtig, Mäuse in einem Zustand zu halten, um euthermic kälteinduzierten Vasokonstriktion zu verhindern, dies kann durch Lampen erreicht werden, zirkulierende Wasser Heizkissen, heizt Mikrowellentauglicher Pads usw.
  5. Legen Sie die rektale Temperatursonde und setzen Thermo-Controller bis 35 ° C.
  6. Machen Sie einen Hautschnitt am kaudalen Ende der spinotrapezius mit Iris Schere und Standard-Muster Pinzette.
  7. Erweitern Inzision kranial der Fettpolster, die Schaffung eines Hufeisens Einschnitt, und decken die Hautlappen mit Plastikfolie, um ein Austrocknen zu verhindern.
  8. Blunt sezieren die subkutane Bindegewebe mit einer Pinzette und Feder Schere, um die Sichtbarkeit zu maximieren.
  9. Zeigen stimulierenden Elektroden so nah together wie möglich, zur Minimierung der Größe des aktuellen Feldes und positionieren sie am kaudalen Ende des freiliegenden Muskel nur seitlich der Wirbelsäule.
  10. Führen Sie einen Test Stimulation Platzierung der Elektroden bestätigen Sie mit einer Elektrode Datenerfassungssystem, Elektrode Stimulus Isolator und Computer-Steuerung, mit quadratischen Wellen eines 200 usec Dauer, 2 mA Amplitude, bei 1 Hz geliefert.
  11. Zeigen Plastikfolie über dem freigelegten Muskel, um ein Austrocknen zu verhindern.
  12. Beginnen mit der Zeitmessung eine 30 min, während der Gefäßdurchmesser wird äquilibrieren.
  13. Positionieren Sie den intravital Mikroskop über dem spinotrapezius Muskel, um die vaskuläre Architektur zu sehen.
    1. Bei Verwendung eines Immersionslinse, einen Tropfen PBS zwischen der objektiven und der Plastikverpackung.
  14. Ausgehend oberhalb des Haupt Arteriole (der größte Behälter sichtbar), Manipulation der Stufe in der XY-Ebene, um das Gefäß von Interesse zu lokalisieren.
    1. Visualisierung kleinen arterioles mit Auflichtmikroskopie erfordert mehr Kontrast als von der rot-Zell-Säule vorgesehen. Verwendet werden vor allem ein Seitenstrom Dunkelfeld-Abbildungsvorrichtung Mikroskop mikrovaskulären Kontrast zu verbessern, aber Kontrast kann auch mit einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop nach der intravenösen Injektion eines hochmolekularen fluoreszierenden Dextran verbessert werden.
  15. Nach dem 30-min Äquilibrierung Aufnehmen eines Bildes / Video des Schiffes von Interesse.
  16. Stimulieren den Muskel mit Rechteckwellen von 200 us Dauer, 2 mA Amplitude, bei 8 Hz, für 90 sec. geliefert, wie oben beschrieben.
  17. Nehmen Sie ein anderes Bild / Video unmittelbar nach Stimulation und weiterhin jede Minute zu erfassen, bis Schiff in den Ruhezustand Durchmesser zurückgekehrt ist, ~ 10 min.
  18. Wiederholen Sie die Schritte 6-18 mit dem kontralateralen Muskel.
  19. Datenanalyse in Echtzeit mit Video Bremssättel oder off-line mit Bildanalyse-Software durchgeführt werden.
  20. Euthanize die Maus folgenten IACUC Protokoll.

3. Spinotrapezius Tissue Ernte und Fixation

  1. Anästhesieren Mäusen durch intraperitoneale Injektion; Formulierung nach Spinotrapezius Vorschub Arterienligation Schritt 1.
  2. Einen Einschnitt mehrere Millimeter kranial des Knochenvorsprung der Maus Schulterblatt mit Iris Schere und Standard-Muster Pinzette. Erweitern Sie den Schnitt seitlich und dann kaudal auf beiden Seiten.
  3. Lassen Sie die Haut von dorsal Oberkörper, indem Sie vorsichtig was die Haut und Schneiden der oberflächlichen Faszie.
  4. Verwenden stumpf nach dorsal Fettgewebe mit Standard-Pinzette entfernen, und dann spiegeln die Muskeln und ähnlich sezieren ventral Fettgewebe.
  5. Entfernen Faszie über dem Muskel mit einer Pinzette und Feder Schere. Dieser Schritt kann schwierig und zeitraubend sein, aber ist wichtig, Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung zu verbessern. Halten Sie das Gewebe hydratisiert kann zu erleichtern Entfernung der Faszie.
  6. Lokalisierender laterale Rand des Muskels, und verwenden Sie stumpfe den spinotrapezius Muskel von der Fettpolster, die ventral liegt es trennen.
  7. Fahren Sie mit der stumpfen Dissektion in einem kranial nach kaudal. Beachten Sie, dass mehrere Blutgefäße betreten und verlassen diese ventralen Oberfläche des Muskels, wenn Perfusion erforderlich ist, sollte es vor dem Durchschneiden diese Gefäße durchgeführt werden. Man beachte auch, dass in der kaudalen Hälfte des Muskels, seinen seitlichen Rand Einsätze in den Muskel liegenden ventralen darauf. Einige Schneiden kann entlang dieser Grenze benötigt werden, um vollständig zu definieren und befreien den Rand.
  8. Excise die spinotrapezius Muskel. Um dies zu tun:
    1. Die seitliche freie Rand des Muskels, wie oben beschrieben.
    2. Schneiden quer über des Muskels am weitesten kranial Umfang.
    3. Geschnitten entlang der medialen Rand (entlang der Wirbelsäule), in der Sagittalebene.
  9. Wiederholen Sie den Vorgang Schritte 4-9 auf der kontralateralen Muskel, und dann einschläfern die mouse von einem IACUC zugelassenen Methode.
  10. Fix die Gewebe auf mit Gelatine beschichteten Objektträger durch Eintauchen in Methanol gekühlt (4 ° C) oder in einer 4% Paraformaldehyd / deionisiertem Wasser-Lösung bei RT für 20 min.
    1. Alternativ kann Perfusionsfixierung eingesetzt werden. Vor Schritt 2, führen eine Thorakotomie, einen Einschnitt in den rechten Vorhof und perfuse Gefäßsystem mit 5 ml 1 × Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 mM CaCl 2 und 2% Heparin über die linke Herzkammer, gefolgt von 5 ml 4 % Paraformaldehyd Gefäß Fixierung, und schließlich 5 ml 1 × Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 mM CaCl 2 7.
  11. Unmittelbar nach Fixierung, Waschen Muster viermal für jeweils 20 min mit 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1% Saponin.

Representative Results

Ein chirurgischer Sicht der Hauptschlagader Zuführung des spinotrapezius Muskel, Ligation unterzogen ist in Abbildung 1 dargestellt, deren Kennzeichnung Bereiche von Interesse. Ein Beispiel konfokalen Bildes des geerntet und immungefärbt Bereich Muskel direkt stromabwärts von der Arterie ligiert eine Woche nach Ligation in 2A gezeigt befindet. Vergrößerten Sicherheiten Arteriolen enthaltenden glatten Muskulatur alpha-Aktin exprimieren glatten Muskelzellen (rot) anzuzeigen charakteristischen Tortuosität nach Ligation. Gefäß Tortuosität als das Verhältnis zwischen dem Gefäß Weglänge und Kordabstand (dh die Linie, die sich in den gleichen Gefäß Pfad Endpunkte) berichtet, in dem ligierten Muskel (rechts) relativ zu unligierten kontralateralen Muskeln (2B, n = 8) erhöht . Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse einer Pilotstudie, in der Klemme Arteriole funktionale Vasodilatation gemessen mit Intravitalmikroskopie wurde. Wie erwartet, arteriolären di messer deutlich erhöht nach elektrischer Stimulation induzierte Muskelkontraktion.

Abbildung 1
Abbildung 1. Operationsfeld reflektierten spinotrapezius Muskel-und Futtermittel Arterie. Das Futter Arterie wird an den beiden Stellen durch A0 angedeutet ligiert. Zwischen diesen Ligaturen und nach Obstruktion Blutströmung, wird die Arterie an der Stelle durch A angedeutet Die gezielte Segment der Arterie Übergänge vom ventralen Fettpolster, durch C umrissen durchtrennt, in die Muskulatur spinotrapezius skizzierte durch D, an der Stelle angedeutet mit Pfeil B. Durchflussrichtung ist durch den gestrichelten Pfeil E. angegeben

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Abbildung 2. Konfokalen Bild spinotrapezius Muskel mikrovaskulären Netzwerk für Pilotstudie Tortuosität. (A) geerntet und ganze montiert Muskel wurde für glatte Muskelzellen alpha-Aktin und abgebildeten mit der konfokalen Mikroskopie immungefärbt. Das Sichtfeld zeigt der Bereich des Muskels angeordnet unmittelbar stromabwärts von dem ligierten Arteriole 1 Woche nach der Ligation. Gewundene Gefäße sind in den Muskel offensichtlich als Folge der Ligation (B) Pilotstudie Ergebnisse zeigen signifikant (p = 0,035; ein angebundenes Student-t-Test). Tortuosität ausgestellt von Mikrogefäßen in der ligierten Muskels durch Gefäßes Weglänge zu messenden Kordabstand Verhältnis für eine Studie von C57BL / 6 Mäusen (n = 8) im Vergleich zur kontralateralen Kontrolle.

Abbildung 3
FiguRE 3. Intravital Mikroskopie von funktionalen Vasodilatation in spinotrapezius Arteriolen, in vivo. (A) Repräsentative Aufnahmen der spinotrapezius Terminal Arteriolen in Ruhe (links) und unmittelbar nach der Beendigung der 8 Hz Muskelkontraktion (rechts). (B) Terminal Arteriole Durchmesser im Ruhestand ( 8,5 ± 0,5 um, links) und unmittelbar nach (11 ± 1 um, mitten) 90 sec der Muskelkontraktion, die deutlich erhöht arteriolar Durchmesser (p = 0,032; 1-tailed gepaarter t-Test) in Balb / C-Mäuse (n = 6). Prozentuale Veränderung angegeben (rechts).

Discussion

Das murine spinotrapezius Ligation hier vorgestellte Modell ist ein wirksames kleinen Tiermodell, um die funktionellen und strukturellen Anpassungen, die sich aus einer arteriellen Verschlusskrankheit untersuchen. Dieses Modell ist komplementär zu der weit verbreiteten Hinterlauf Ischämie-Modell 4, dass es bietet eine ganze-Muskel Blick intakt mikrovaskulären Netzwerken mit hoher räumlicher Auflösung. Da außerdem dieser Muskel direkt unter die Rückenhaut entfernt wird, ist es zugänglich seriellen Bildgebung mit Intravitalmikroskopie und lokale Arzneimittelabgabe über Superfusion oder Dünnfilm Implantation 2. Diese Eigenschaften machen es zu einem ansprechenden Kleintiermodell in denen die Auswirkungen der neue therapeutische Targets auf Gefäßumbau und funktionelle Vasodilatation nach Arterienverschluss studieren.

Beachten Sie, dass Vorsicht verwendet werden soll, wenn in dem Vergleich von Daten spinotrapezius Ligation Modell und die Daten in der hinteren Gliedmaßen Ligation Modells aufgrund mehrerer Schlüssel d erworbenen erwerbendenifferences. Zunächst werden die spinotrapezius Muskeln stabilisierenden Muskeln, und sie unterscheiden sich von den Beinmuskeln in Bezug auf Funktion und Fasertyp Verteilung. Unsere Gruppe hat bisher gezeigt, dass die arteriolar Ligation in spinotrapezius Muskeln weniger oder vernachlässigbar Hypoxie in Stämmen mit gut entwickelten Sicherheiten arteriolar Netze gemäß der Hypoxie in der Hinterpfote nach der Oberschenkelarterie Ligation in den Hinterlauf Modell 1,8 beobachtet Vergleich schafft - 10. Wir haben auch gezeigt, dass die spinotrapezius Ligation Modell eine andere Umgestaltung Antwort in Balb / c Mäusen zu C57BL / 6 Mäusen verglichen mit Balb / c Mäusen Netze Umbau durch Kapillarwirkung Besicherung und C57BL / 6 Umbau durch die Erweiterung der bestehenden arteriolären Verbindungen 3 erzeugt. Es gibt eine interessante Parallele zwischen diesen Beobachtungen und den in Hinterlauf Ligation Modellen, erleben bei Balb / c Mäusen eine längere Perfusion Erholung nach Ligation Vergleich zu C57BL / 6 Mäusen 9,11,12 </ Sup>. In anderen Modellen Gewebeischämie, Maus 13 Jahre alt Geschlecht 14 und das Vorhandensein der Krankheit 15 auch Auswirkungen auf die Gewebe "Antworten auf arteriolar Okklusion, obwohl wir noch nicht diese Prädiktoren im spinotrapezius Ligation Modell getestet.

Zweitens ist die Größe der Arterie, die in dem Modell spinotrapezius ligiert ist wesentlich kleiner als die Oberschenkelarterie, und daher wirkt die Ligaturabdeckung einen kleineren Gewebevolumen, der weiter stromabwärts ist, dh auf einer niedrigeren Ebene des Kreislaufsystems Baum, im spinotrapezius verglichen mit dem Hinterlauf 3. Daher sollte der Unterschied in der anatomischen Lage der Ligation in diesen beiden Modellen als beim Vergleich der jeweiligen physiologischen Reaktionen (z. B. Gefäßumbau) auf diese Intervention sein.

Drittens kann die Dünne der spinotrapezius ermöglichen Sauerstoff, um die unperfused Teil des Gewebes aus benachbarten erreichenGewebe, im Vergleich zu der kombinierten Ischämie und Hypoxie im Hinterbein Modell wie oben angemerkt 3. Viertens ist die Rückgewinnung von Durchfluss zu dem Abschnitt der spinotrapezius stromabwärts der Ligation schneller als in der hinteren Gliedmaßen Ligation. Die Ligation spinotrapezius Modell ist ein einzigartiges chronischen Modell und nicht mit anderen Modellen von transienten Arterienverschluss oder Modellen von Ischämie Reperfusionsverletzung verwechselt werden. Wir halten es für möglich, dieses Modell anzupassen, um diese Arten von Bedingungen gerecht zu werden, aber das ist außerhalb des Geltungsbereichs der Arbeit ist ausgeschlossen. Schließlich raten wir gegen die in unmittelbarem Zusammenhang pre-klinischen Beobachtungen in diesem Modell zu klinischen Manifestationen von ischämischen Erkrankungen beim Menschen, insbesondere bei der Verwendung von jungen und ansonsten gesunden Mäusen und aufgrund der inhärenten physiologischen Grenzen wie höhere Herzfrequenz 5. Dennoch halten wir dieses neue Modell als ein wertvolles Instrument für die Aufdeckung grundlegenden Mechanismen von Gewebe Reaktionen auf Ligation und Identifizierung potenzieller dierapeutic Targets in einer in vivo-Umgebung.

Neben den chirurgischen Hinweise im spinotrapezius Feed Arterienligation Verfahren (anatomischen beachten (6a), die Unterscheidung der Arterie aus der Vene (9a), und die Verwendung eines einzigen Ligatur (11a)) vorgesehen, ein paar andere Aspekte des Verfahrens profitieren von Diskussion.

Zuerst wird der anfängliche Einschnitt über die dorsale Fettpolster Grenze (oder mehrere mm kaudal des Schulterblatts, wenn transdermalen Visualisierung nicht möglich ist) hergestellt idealerweise so klein gemacht, wie der Chirurg ist bequem mit, und expandiert während des Verfahrens, wenn nötig. Diese Praxis minimiert die Naht erforderlich, um den Einschnitt, der nahe bei den Chirurgen ist zu schließen, reduziert Verfahrenszeit, und ist auch weniger reizend auf dem Tier während der Wiederherstellung. Alternativ kann ein größerer Hautschnitt angemessen nach Chirurg bevorzugt, da der Muskel kann leichter sein, mit einem erweiterten Bereich zu lokalisieren. In diesem Fall kann die Inzisionprofitieren Sie von einem Hufeisen-Form mit einem medialen offenes Gesicht, damit Falten in Richtung Wirbelsäule. Während der Arbeit an den Hautschnitt und sich durch den sekundären Hautschichten, wenn eine Oberfläche Schiffes beschädigt und führt zu Blutungen, mit leichtem Druck mit steriler Gaze und bieten Zeit für Hämostase.

Ebenfalls bemerkenswert ist es wichtig, um das Gewebe mit der minimal erforderliche Kraft zu behandeln, und möglichst mit einer Pinzette halten näher an der Muskeln lateralen Rand und weg von der beabsichtigten ischämischen Zone. Diese Praxis hilft, Quetschverletzung, was zu zusätzlichen vermittelten entzündlichen Gewebe Reaktionen, die das Gefäßumbau Reaktion der Ligation arteriellen evozierten verwechseln kann führen können, vermieden.

Zusammenfassend haben wir die Verwendung des murinen spinotrapezius Muskel als chirurgisches Modell zur Untersuchung vaskulären und Gewebereaktionen auf arteriolären Ligation demonstriert. Dieses Modell eignet sich für intravitale Beurteilung der Gefäßveränderungen (fürBeispiel funktionelle Vasodilatation) und für die ex vivo Beurteilung der Gefäßveränderungen (beispielsweise Immunofluoreszenz-Bildgebung und Quantifizierung von Gefäßnetze). Beide präklinische und klinische Studien haben gezeigt, dass eine individuelle Reaktion auf arteriolar Hindernis (zB über Ligation in Mäusen oder atherosklerotischen Plaques beim Menschen) abhängig von ihrem Alter ist das Vorhandensein oder Fehlen von Krankheit (zB Diabetes mellitus) der Durchmesser des verdeckt Arterie , das Erbgut des Menschen, und der metabolischen Bedarf des Gewebes 11-15. Murine Modelle, wie das hier vorgestellte, nützen die Forscher der Stamm-spezifische anatomische und genetische Unterschiede und krankheitsspezifische Phänotypen, die Ermittlungen erleichtert in diesen komplexen Beziehungen.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Wir erkennen Kevin Macleod für den Einsatz seiner creative commons lizenzierte Musik im zugehörigen Video, einschließlich (in der Reihenfolge ihres Auftretens) seine Spuren "Airport Lounge", "Wallpaper" und "Evening Melodrama." Wir würden auch gerne Ndubisi Okeke und Frederick Torstrick für ihre Unterstützung bestätigen Sie mit der Operation Video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Murine Spinotrapezius Modell, um die Auswirkungen der Arteriolen Ligation auf mikrovaskuläre Funktion und Remodeling beurteilen
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Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

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