Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Spinotrapezius نموذج الفئران لتقييم أثر ربط شريني ظيفة الاوعية الدموية الدقيقة وعلى إعادة عرض

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

ونحن يبرهن على وجود رواية نموذج ربط الشرايين في العضلات spinotrapezius الفئران، بما في ذلك إجراء خطوة بخطوة ووصف الأجهزة المطلوبة. وصفنا الجراحة وقياسات النتائج ذات الصلة المتعلقة إعادة عرض شبكة الأوعية الدموية وتوسع الأوعية الوظيفية باستخدام المجهر متحد البؤر intravital و.

Abstract

وspinotrapezius الفئران هو، وسطحية رقيقة العضلات الهيكلية الدعم الذي يمتد من T3 إلى L4، ويمكن الوصول إليه بسهولة عن طريق شق الجلد الظهرية. التشريح الفريد يجعل spinotrapezius مفيدة للتحقيق في الإصابة الدماغية وإعادة عرض الاوعية الدموية الدقيقة لاحقة. هنا، علينا أن نبرهن نموذج ربط تصلب في العضلات وspinotrapezius الفئران التي تم تطويرها من قبل فريق البحث ونشرت سابقا 1-3. لبعض سلالات الفئران الضعيفة، مثل الماوس BALB / ج، وهذا يخلق جراحة ربط موثوق الهيكل العظمي نقص تروية العضلات ويخدم كمنصة للتحقيق في العلاجات التي تحفز عودة التوعي. وأظهرت أيضا أساليب التقييم، بما في ذلك استخدام المجهر متحد البؤر intravital و. هي مناسبة تماما لspinotrapezius لدراسات التصوير بسبب هذه سهولة الوصول إليها (التشريح الظهرية السطحية) وركاكة النسبي (60-200 ميكرون). يمكن تركيبه عضلات الوجه spinotrapezius EN، وتيسيرتصوير كامل العضلات شبكات الاوعية الدموية الدقيقة دون باجتزاء النسيجية. وصفنا استخدام المجهر intravital للحصول على قياسات بعد إجراء توسع الأوعية الوظيفية، على وجه التحديد، فإن الزيادة في القطر arterilar نتيجة لتقلص العضلات. علينا أن نبرهن أيضا إجراءات الحصاد وإصلاح الأنسجة، تمهيدا المناعية اللازمة لدراسات واستخدام المجهر متحد البؤر.

Introduction

النماذج الحيوانية من نقص التروية المزمن هي أدوات قيمة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض الدماغية، مثل مرض الشريان المحيطي، مرض الشريان التاجي، والأمراض الدماغية الوعائية. في القوارض، كما هو الحال في البشر، وانسداد الشرايين يؤدي إلى إعادة عرض الهيكلي للشبكة الأوعية الدموية، بما في ذلك تخلق الشرايين والأوعية الدموية. في المرضى الأصحاء والشباب، وهذا يمكن أن يكون كافيا لإعادة عرض الأنسجة إنقاذ من الاصابة التي يسببها نقص التروية، ولكن شارك في حالة مرضية مثل السكري يمكن أن تضر بشدة إعادة عرض والانتعاش. فهم الآليات الكامنة والأحداث الأوعية الدموية إعادة عرض أمر ضروري لتطوير علاجات التي تحفز هذه العمليات عودة التوعي الذاتية.

حاليا، ربط الشريان الفخذي أو استئصال في hindlimb هو الأسلوب القياسي لدراسة نقص التروية المزمن الناجم عن إعادة عرض الأوعية الدموية في الحيوانات الصغيرة 4،5. تحليل القطر، والربط، وتفاعليةو microvessels التي تشكل شبكة الأوعية الدموية المصب من الشريان الفخذي ligated أمر صعب، ولكن نظرا لسمك العضلات. وقد وضعنا نموذجا ربط تصلب في العضلات الماوس spinotrapezius: ربط جانب واحد من الشريان الجانبي تغذية العضلات في هذه الظهرية استقرار 1. وspinotrapezius رقيقة نسبيا (60-200 ميكرون) وهي قابلة للالمناعية وجه EN لتقييم طوبولوجيا شبكة كاملة مع قرار وحيد الخلية، مما يسمح بإجراء فحص مفصل للأحداث إعادة عرض الأوعية الدموية في جميع أنحاء الأنسجة بالكامل. وspinotrapezius أيضا سطحية ويمكن الوصول إليها، وبالتالي يمكن ملاحظتها بسهولة سفنها بواسطة المجهر intravital، لتوصيف الفعال للتأثير إعادة عرض وربط تصلب الأوعية الدموية على التفاعل.

في هذا التقرير، ونحن تصف بالتفصيل وشرح ربط الماوس شريني spinotrapezius النموذج. سواء في الجسم الحي وخارج الجسم الحي ليويرد وصف لعملية جراحية تقييم thods التالية، بما في ذلك قياس توسع الأوعية الوظيفية، وهو ما ثبت قد انخفضت في ظل ظروف نقص تروية والتصوير مناعي شبكات الاوعية الدموية الدقيقة كامل العضلات. نحن تشمل أيضا نتائج دراستين منفصلتين رائدة للتدليل على فائدة هذا النموذج. أولا، نحن تستخدم نموذج ربط الشرايين للحث على زيادة ذات دلالة إحصائية في تعرج السفن في C57BL / 6 الفئران (الشكل 2B). زيادات تعرج أثناء تخلق الشرايين في الضمانات شرين. في سلالات الفئران الأخرى، والتي هي أكثر عرضة للنقص التروية بسبب غياب ضمانات الشرايين (على سبيل المثال BALB / ج)، ويلاحظ arterialization الشعرية 10. تم الكشف عن arterialization الشعرية بأقطار زيادة وتنمية العضلات على نحو سلس α تفاعل أكتين. الثاني، التحفيز الكهربائي للعضلات الوظيفية يؤدي إلى توسع الأوعية في الشرايين الطرفية للspinotrapeziلنا (الشكل 3B).

Protocol

1. Spinotrapezius ربط الشريان تغذية جراحة

  1. تخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق الماوس. في حقنة مل 0.5، وضع: 0.06 مل من 100 ملغ / مل الكيتامين
    0،03 مل من 20،0 ملغ / مل زيلازين
    0،01 مل من 0.4 ملغ / مل الأتروبين
    0،30 مل من المياه المالحة 0.9٪.
    الجرعة: 0.01 مل * وزن الجسم في غرام، والملكية الفكرية

* الجرعة متغير على سلالة الماوس والأوراق المالية، وذلك وفقا لضبط الانتعاش الماوس في غضون ساعة من الحث.

  1. تطبيق معيار مرهم لمنع جفاف العيون القرنية.
  2. إزالة الشعر من الخلف باستخدام كليبرز تقليم، ثم طلب من كريم مزيل الشعر وجيزة.
  3. تطهير الجراحي الميداني مع الكلورهيكسيدين أو البوفيدون اليود. البديل بوفيدون مع الإيثانول ثلاث مرات، وتنتهي مع اليود البوفيدون.
  4. نقل الماوس على سطح العمل الجراحي أعدت سابقا، مع سادة التدفئة وثنى العقيمةفي المكان.
  5. إنشاء شق طولي (3-5 ملم) من خلال الجلد الظهرية حوالي 5 مم الذيلية إلى بروز عظمي من الكتف باستخدام مقص وملقط القزحية نمط القياسية (مثل FST، 11271-30) من خيام النسيج والقطع موازية لل العمود الفقري. ويمكن تحديد موقع الهدف من خلال شق الجلد من التصور منصة الدهون الظهرية إذا سمح تصبغ الجلد، قطع على الحدود الذيلية لوحة الدهون. توسيع شق حسب الحاجة، من خلال توسيع نطاق وطبقات الجلد الثانوية باستخدام مقص الربيع.
    1. ملاحظة التشريحية - والعضلات spinotrapezius تقع ظهريا ويمتد من T4 إلى L3 على طول جانبي العمود الفقري. الحدود الأمامية يمتد أفقيا إلى ما يقرب من شفرة الكتف. التناقص التدريجي في العضلات في الاتجاه الذيلية حتى الحدود الأكثر الإنسي الخلفي تقع على الحدود الأمامية، ووضع قد تدفق مع العمود الفقري. اثنين منصات الدهون هي المهم أيضا أن نلاحظ، ووضع ظهري بطني ومباشرة إلى spinotrapeziusالعضلات نحو النصف في الجمجمة.
    2. وقد تبين نتيجة لالتهاب الجرح ليكون له تأثير على استجابة الأوعية الدموية إعادة عرض، والشام جراحة ربط أظهرت أي تغيير في إعادة تشكيل الأوعية الدموية spinotrapezius. اثنين من العوامل المكانية تساهم في هذه النتيجة. الأولى تتم إزالة شق بنسبة 5 ملم باتجاه الجمجمة من المنطقة ذات الاهتمام حيث يتم فحص الأوعية الدموية عادة الاستجابة في العضلات. بالإضافة إلى ذلك، يتم فصل موقع شق الجلد على ظهري من السفينة عن طريق ربط موقع سادة من الدهون البطنية التي تقع على قمة الجمجمة الثالث من العضلات spinotrapezius.
  6. ري مع شق حل قارع الأجراس حرارة لمنع جفاف العضلات. سوف تطبيق موسعات مثل بابافيرين مساعدة في وضع الرؤية والهدف لربط الشريان.
  7. تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط تشريح لحد من تأثير وفصل (ولكن ليس إزالة) الظهرية أبيض سادة من الدهون الأساسية من MUSCجزيئية الأنسجة من أجل رؤية الأوعية الدموية كما يدخل ويترك spinotrapezius على حافته الجانبية.
  8. تحديد موقع الشريان الهدف، الذي جنبا إلى جنب مع واحد أو اثنين الأوردة مقترن، يمر عبر لوحة الدهون التي هي بطني إلى spinotrapezius في طريقها إلى حافة الجانبية للعضلة. هذا الشريان يغذي جزء كبير من النصف الذيلية من العضلات، والتي يمكن التأكد من ويعكس استبدال العضلات لمراقبة مسار الشريان داخل العضلات. موقع الهدف للربط هو جزء من الشريان البطني الخروج من منصة الدهون ودخول العضلات، ويمكن الوصول إليها تماما في هذه المنطقة. قد الزوج الشريان الوريد، يجب أن يتم فصل بلطف من منصة الدهون البطنية في هذه المنطقة. لاحظ أن يتم تغذية spinotrapezius من أزواج الشريان الوريد، متعددة، بما في ذلك السفن التي إما عرضية منصات الظهرية والبطنية الدهون. والحرص على عدم تعطيل هذه السفن.
    1. ويمكن استخدام مؤشرات متعددة للتمييز الشريانمن الوريد. واحدة من أفضل الطرق هو عرقلة تدفق الدم برفق مع المسبار الميكروي ونقل المنبع بعيدا عن العضلات؛ لن تستأنف تدفق في الشريان حتى يتم تحرير العرقلة. ويمكن أيضا أن تستخدم اللون، وتحتوي على جدران الوريد غمد بيضاء من النسيج الضام الذي تفتقر الشرايين. علاوة على ذلك، يمكن للمرء أن ينظر في قطر قبل تطبيق عائي والأوردة عادة ما تكون أكبر في الحجم.
  9. الشريان هو عادة على مقربة من الوريد في الاقتران، واستخدام تشريح حادة مع المسبار الميكروي و# 5 ملقط لعزل شريحة مم تقريبا 5، وذلك بتمرير المسبار الميكروي وراء الشريان، واستخدام تلميح لجعل الفجوة أوسع في الطبيعية الشق بين الشريان والوريد. هذه هي الفجوة التي سيتم من خلالها الخيوط الخيط.
  10. 10-0 استخدام واحد وإبرة خياطة خيط مكان حامل لربط الشريان حول تغذية (~ قطر ميكرون 70) في نهاية الجزء القريب من تشريح باستخدام عقدة الجراح. جيش التحرير الشعبى الصينىم لربط إضافية في نهاية البعيدة للجزء الشريان تشريح، مع الفصل بين الحروف المركبة كافية للسماح لtransection من الشريان.
    1. صغر حجم المرتبطة الشريان تغذية spinotrapezius يؤدي إلى صعوبة زيادة الجراحية، مقارنة مع ربط من أكبر سفينة مثل الشريان الفخذي. الجراحين سيكون عديم الخبرة ولا سيما ارتفاع معدلات قلعي، نزيف غير مقصود، وغيرها من المضاعفات الجراحية. ذات أهمية خاصة هو صعوبة تحديد وقطع الشريان عديم اللون بعد إعاقة تدفق قبل القطع. لهذه الأسباب، ووضع اربطة 2 من المستحسن بالنسبة لأولئك غير معتادين على هذا الإجراء، كما الجراح لديه دليل البصرية في تحديد مكان القطع من أين الشريان وكذلك تأكيد لقطع مع فصل ملاحظتها بسهولة من الحروف المركبة 2. ومع ذلك، قد الجراح أكثر خبرة العثور على ربطة واحدة كافية، طالما أنها قادرة على اضحتحديد وخفض الشريان المصب من ضمد. في حين أن هذا الأسلوب يقلل من خطر الخدش غير قصد سفينة قريب مع خياطة ربط حادة، فإنه لا يخلو من العيوب، بما في ذلك زيادة صعوبة في تأكيد ومقطوع الشريان.
  11. تحقق من ربط من خلال مراقبة تناقص تدفق الدم (RBC عرقلت عمود) المصب لموقع ربط (أي نحو العضلات).
  12. باستخدام مقص تشريح الشريان ligated القطع، بين الحروف المركبة اثنين. إذا وضعت ربطة واحدة فقط (11A)، وقطع بعناية فائقة في اتجاه المصب.
  13. ويمكن وضع المخدرات تحميل فيلم عادي (1 مم) المصب (نحو caudally) كجزء من إجراء التجارب.
  14. إعادة وضع لفافة المشردين والأنسجة الدهنية لميولهم الأصلي.
  15. إغلاق شق الجلد باستخدام 8-0 غير resorbable الغرز. ثم ضع الماوس في قفص الانتعاش ساخنة أعدت تحت الملاحظة وإدارة أبpropriate مسكن مثل بوبيفاكايين، 0،02-0،05 مل حقن الموضعي 0.25٪.

2. Spinotrapezius المجهر Intravital، في الموقع

  1. تخدير الماوس في غرفة التعريفي مع 3-4٪ isoflurane يتبخر الأوكسجين في 100٪ بمعدل تدفق L 3-4 دقيقة · -1.
    1. استخدام التخدير الاستنشاق هو الأفضل لقياس وظيفية بسبب وجود الاكتئاب أقل من القلب والأوعية الدموية مع التخدير عن طريق الحقن. إذا ويفضل التخدير الاستنشاق غير متوفرة في التخدير طويل المفعول، عن طريق الحقن، مثل الصوديوم بنتوباربيتال لتجنب الحقن مرة واحدة وقد تم تكرار وضع الحيوان.
  2. تخدير مرة واحدة، وتقديم باستمرار isoflurane من خلال قناع التخدير (ويعرف أيضا باسم مخروط الأنف) عند تركيزات الصيانة (عموما ~ 2٪) ومعدل تدفق 0،5-1 L -1 دقيقة ·.
    1. الفئران في الغالب من خلال ممرات تهوية الأنف الخاصة بهم، لذلك فإن اللجنة الوطنية للانتخابات فقطايساري لتغطية أنوفهم مع التخدير الحجاب الحاجز قناع.
  3. إذا لزم الأمر، وإزالة الشعر من الخلف باستخدام كليبرز تقليم وكريم مزيل الشعر.
  4. نقل الحيوانات الى منصة الحرارة.
    1. من المهم للحفاظ على الفئران في حالة باعث الدفء لمنع الباردة التي يسببها تضيق الأوعية، ويمكن تحقيق ذلك من خلال المصابيح والمياه المتداولة منصات الحرارة، مع ارتفاع درجات الحرارة microwavable منصات، الخ.
  5. إدراج التحقيق درجة حرارة الجسم وتعيين الحرارية تحكم إلى 35 ° C.
  6. جعل شق الجلد في نهاية الذيلية للspinotrapezius باستخدام مقص وملقط القزحية نمط القياسية.
  7. تمديد شق cranially إلى لوحة الدهون، وخلق شق حذاء الحصان، وتغطية الجلد رفرف مع غلاف بلاستيكي لمنع جفاف.
  8. بلانت تشريح النسيج الضام تحت الجلد مع ملقط ومقص الربيع لزيادة مدى الرؤية الأفقية.
  9. وضع أقطاب كهربائية تحفيز وتوجي إغلاقTHER وقت ممكن، للتقليل من حجم الحقل الحالي، والموقف منها في نهاية الذيلية من العضلات الجانبية يتعرض فقط على العمود الفقري.
  10. إجراء اختبار التنبيه الكهربائي لتأكيد التنسيب باستخدام نظام الحصول على البيانات القطب، القطب المعزل التحفيز، وحدة تحكم الكمبيوتر، مع موجات مربع من مدة μsec 200، 2 مللي أمبير السعة، ألقاها في 1 هرتز.
  11. وضع الاغطية البلاستيكية على العضلات لمنع جفاف تتعرض.
  12. بدء توقيت فترة 30 دقيقة خلالها أقطار السفينة سوف تتوازن.
  13. وضع المجهر intravital على العضلات spinotrapezius لعرض العمارة الأوعية الدموية.
    1. في حالة استخدام عدسة الغمر، ضع قطرة من PBS بين الهدف والاغطية البلاستيكية.
  14. بدءا فوق شرين الرئيسية (أكبر سفينة مرئية)، والتعامل معها في المرحلة الطائرة XY لتحديد موقع السفينة في المصالح.
    1. تصور arteriol الصغيرةوفاق مع ينعكس الضوء المجهر النقيض من أكبر يتطلب المقدمة من العمود الحمراء الخلية. نستخدم في المقام الأول جنبا إلى تيار المجهر التصوير الظلام الميدان المقابل لتعزيز الاوعية الدموية الدقيقة، ولكن يمكن أيضا أن تتحسن مع النقيض المجهر ينعكس الضوء الفلورية بعد الحقن في الوريد من ديكستران الفلورسنت الوزن الجزيئي عالية.
  15. بعد موازنة دقيقة 30-، التقاط صورة / فيديو من السفينة في المصالح.
  16. تحفيز العضلات مع موجات مربع من مدة μsec 200، 2 مللي أمبير السعة، ألقى الساعة 8 هرتز، لمدة 90 ثانية، كما هو موضح أعلاه.
  17. ~ التقاط صورة أخرى التحفيز / فيديو آخر على الفور، والاستمرار في القبض على كل دقيقة حتى السفينة قد عاد إلى القطر يستريح، 10 دقيقة.
  18. كرر الخطوات 6-18 باستخدام العضلات المقابل.
  19. لا يمكن أن يؤديها تحليل البيانات في الزمن الحقيقي مع الفرجار الفيديو أو خارج الخط مع برنامج تحليل الصور.
  20. الموت ببطء الماوس اتبعجي IACUC البروتوكول.

3. Spinotrapezius حصاد الأنسجة والتثبيت

  1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق؛ كما هو الحال في صياغة Spinotrapezius تغذية الشريان خطوة ربط 1.
  2. إجراء شق عدة ملليمترات الجمجمة إلى بروز عظمي من الكتف باستخدام الماوس، مقص وملقط القزحية نمط القياسية. توسيع شق أفقيا ثم نحو caudally على كلا الجانبين.
  3. الافراج عن الجلد من الجذع الظهري من خلال عكس بلطف الجلد وقطع فآسيا سطحية.
  4. استخدام تشريح حادة لإزالة الأنسجة الدهنية باستخدام الظهرية ملقط القياسية، ومن ثم تعكس تشريح العضلات والأنسجة الدهنية وبالمثل بطني.
  5. إزالة اللفافة التي تغمر العضلات باستخدام ملقط ومقص الربيع. يمكن أن تكون هذه الخطوة صعبة وتستغرق وقتا، ولكن من المهم لتحسين تلوين مناعي والتصوير. يمكن الحفاظ على الأنسجة رطب تخفيف إزالة اللفافة.
  6. حددالحدود الجانبية للعضلة، واستخدام تشريح حادة لفصل العضلات spinotrapezius من منصة الدهون البطنية التي تقع عليه.
  7. مواصلة تشريح حادة في الجمجمة إلى الاتجاه الذيلية. نلاحظ أن العديد من الأوعية الدموية الدخول والخروج من هذا السطح البطني للعضلة، وإذا هو مطلوب نضح، ينبغي أن يقوم به من قبل transecting هذه السفن. نلاحظ أيضا أنه في النصف الذيلية من العضلات، وتدرج في الحدود الجانبية في عضلة البطنية الكذب عليه. قد تكون هناك حاجة بعض القطع على طول هذه الحدود لتحديد وخالية تماما الحافة.
  8. استئصال العضلات spinotrapezius. للقيام بذلك:
    1. مجانا حافة الجانبية للعضلة كما هو موضح أعلاه.
    2. قطع مستعرض عبر مدى العضلات الأكثر الجمجمة.
    3. قطع على طول الحدود وسطي (على طول العمود الفقري)، في المستوى السهمي.
  9. كرر الخطوات من 4-9 الإجراء على العضلات المقابل، والموت ببطء ثم م[أوس] باستخدام أسلوب IACUC المعتمدة.
  10. إصلاح الأنسجة على الشرائح الزجاجية المغلفة الجيلاتين عن طريق الغمر في الميثانول المبردة (4 ° C) أو في بارافورمالدهيد 4٪ / منزوع الأيونات الماء في حل RT لمدة 20 دقيقة.
    1. وبدلا من ذلك، قد يتم تثبيت العاملين التروية. قبل الخطوة 2، نفذ بضع الصدر، وجعل شق في الأذين الأيمن، والأوعية الدموية يروي مع 5 مل من 1 × تريس مخزنة المالحة بنسبة 0.1 ملي CaCl 2 و 2٪ الهيبارين عن طريق البطين الأيسر، تليها 5 مل من 4 بارافورمالدهيد تثبيت٪ للسفينة، وأخيرا 5 مل من 1 × تريس مخزنة المالحة بنسبة 0.1 ملي CaCl 2 7.
  11. تثبيت فورا التالية، وغسل عينة أربع مرات لمدة 20 دقيقة لكل منهما. باستخدام 0،01 M المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) مع سابونين 0.1٪

Representative Results

ويرد عرض العمليات الجراحية في الشريان الرئيسي تغذية العضلات التي يخضع spinotrapezius ربط في الشكل 1، مع تسميات تشير إلى مجالات الاهتمام. صورة مبائر سبيل المثال في المنطقة وتحصد immunostained من العضلات يقع المصب مباشرة من الشريان ligated بعد أسبوع واحد يظهر في ربط الشكل 2A. الشرايين تحتوي على ضمانات الموسع العضلات الملساء ألفا أكتين التعبير عن خلايا العضلات الملساء (أحمر) عرض تعرج مميزة بعد ربط. تعرج السفينة، كما ورد النسبة بين طول مسار السفينة ومسافة الحبل (أي الخط يمتد على مدى النهاية سفينة المسار نفسه)، في العضلات ligated (يمين) ومما يعزز نسبة إلى العضلات المقابل unligated (الشكل 2B، ن = 8) . ويبين الشكل 3 نتائج الدراسة التجريبية التي تم قياسها محطة شرين توسع الأوعية الوظيفية باستخدام المجهر intravital. كما هو متوقع، شريني دي ameter يزيد بشكل كبير بعد تقلص العضلات التحفيز الكهربائي الناجم عن.

الشكل 1
الشكل 1. وligated الجراحي الميداني من العضلات والشرايين ينعكس spinotrapezius الأعلاف. الشريان الأعلاف في الموقعين المشار إليها بواسطة A0. بين هذه الحروف المركبة وعرقلة تدفق الدم بعد، ومقطوع الشريان في موقع المشار إليها بواسطة A. الجزء المستهدف من التحولات الشريان من منصة الدهون البطنية، التي حددها C، في عضلة spinotrapezius، التي حددها D، وأشار في موقع يشار إلى سهم مع اتجاه تدفق B. بواسطة E. سهم متقطع

ghres.jpg "/>
الشكل 2. صورة مبائر من العضلات spinotrapezius شبكة الاوعية الدموية الدقيقة للدراسة التجريبية لتعرج. (A) المقطوع وimmunostained العضلات كلها محمولة على العضلات الملساء لألفا أكتين والمصورة باستخدام المجهر متحد البؤر. مجال الرؤية معارض منطقة المصب العضلات تقع مباشرة من ligated شرين 1 أسبوع آخر ربط. سفن متعرجة واضحة في العضلات نتيجة للربط (B) نتائج الدراسة التجريبية تظهر زيادة كبيرة (P = 0.035، 1 طالب الذيل تي اختبار). تعرج التي أظهرتها microvessels في العضلات ligated التي تقاس طول مسار السفينة إلى الحبل نسبة المسافة للمحاكمة من الفئران C57BL / 6 (ن = 8) مقارنة مع السيطرة المقابل.

الشكل 3
فيقوإعادة 3. Intravital التصوير المجهري للتوسع الأوعية الوظيفية في الشرايين spinotrapezius، في الجسم الحي. (A) photomicrographs ممثل الشرايين الطرفية في بقية spinotrapezius (يسار) ومباشرة بعد وقف من 8 هرتز تقلص العضلات (يمين). (B) قطر شرين الطرفية في بقية ( 8.5 ± 0.5 ميكرون، يسار) والتالي مباشرة (11 ± 1 ميكرومتر، الشرق) 90 ثانية من تقلص العضلات، زيادة كبيرة قطرها الذي شريني (P = 0.032؛ الذيل 1-T-إقران اختبار) في BALB / C الفئران (ن = 6). وأشارت نسبة التغير (يمين).

Discussion

وربط spinotrapezius الفئران النموذج المقدم هنا هو نموذج فعال الحيوان الصغير الذي لدراسة التعديلات الوظيفية والهيكلية التي تنجم عن انسداد الشرايين. هذا النموذج هو مكملا للنموذج استخداما نقص التروية hindlimb من حيث أنه يقدم وجهة نظر كامل العضلات شبكات الاوعية الدموية الدقيقة سليمة لقرار مكانية عالية. وعلاوة على ذلك، لأنه يقع هذا العضلات فقط تحت الجلد الظهرية، فإنه يمكن الوصول إلى التصوير المجهري مع المسلسل intravital، وتقديم الأدوية المحلية عن طريق زرع رقيقة أو superfusion الفيلم 2. هذه الميزات تجعل من جاذبية النموذج الحيواني الصغيرة التي لدراسة آثار من الأهداف العلاجية الرواية على إعادة عرض الأوعية الدموية وتوسع الأوعية الوظيفية التالية انسداد الشرايين.

ملاحظة يجب أن تستخدم بحذر عند مقارنة البيانات التي حصل عليها في نموذج ربط البيانات لspinotrapezius المكتسبة في نموذج ربط hindlimb بسبب د رئيسية عديدةifferences. أولا، يتم تثبيت العضلات spinotrapezius العضلات، وأنها تختلف عن عضلات الساق من حيث الوظيفة ونوع الألياف التوزيع. وقد أثبتت مجموعتنا سبق أن ربط تصلب في العضلات spinotrapezius يخلق نقص الأكسجة أو أقل لا يذكر في سلالات متطورة مع شبكات الضمان شريني، بالمقارنة مع نقص الأكسجة التي لوحظت في hindpaw بعد ربط الشريان الفخذي في النموذج hindlimb 1،8 - 10. لقد أظهرنا أيضا أن النموذج ربط spinotrapezius تنتج استجابة إعادة عرض مختلفة في BALB / ج الفئران مقارنة C57BL / الفئران 6، مع BALB / ج الفئران عن طريق إعادة عرض شبكات الضمانات الاحتياطية وإعادة عرض الشعرية C57BL / 6 عن طريق توسيع الاتصالات شريني القائمة 3. هناك اهتمام مواز بين هذه الملاحظات وتلك المصنوعة في نماذج ربط hindlimb، حيث BALB / ج الفئران تعاني من الانتعاش لفترة طويلة بعد ربط نضح مقارنة C57BL / 6 الفئران 9،11،12 </ سوب>. في نماذج أخرى من نقص تروية الأنسجة، العمر 13 الجنس الماوس (14) وجود المرض يؤثر أيضا 15 الردود الأنسجة 'إلى انسداد شريني، على الرغم من أننا لم تختبر بعد هذه تنبؤ في نموذج ربط spinotrapezius.

الثانية، وحجم الشريان الذي ligated في النموذج spinotrapezius أصغر بكثير من شريان الفخذ، وبالتالي فإن ربط يؤثر على حجم أصغر الأنسجة التي هي مزيد من المصب، أي على مستوى أدنى من شجرة الدورة الدموية، في spinotrapezius مقارنة hindlimb 3. وبالتالي، ينبغي النظر في الفرق التشريحية في موقع ربط في هذين النموذجين عند مقارنة ردود الفسيولوجية منها (على سبيل المثال إعادة عرض الأوعية الدموية) لهذا التدخل.

الثالث، قد النحافه من spinotrapezius تسمح الأكسجين للوصول إلى جزء من النسيج unperfused من الدول المجاورةالأنسجة، مقارنة مع نقص التروية ونقص الأكسجة مجتمعة في النموذج hindlimb كما ذكر أعلاه 3. الرابعة، واستعادة التدفق إلى جزء من المصب spinotrapezius من ربط أسرع مما كانت عليه في ربط hindlimb. نموذج ربط spinotrapezius هو نموذج فريد المزمن وينبغي عدم الخلط مع نماذج أخرى من انسداد الشرايين عابرة أو نماذج من الاصابة ضخه نقص التروية. نرى أنه من الممكن تكييف هذا النموذج لاستيعاب هذه الأنواع من الظروف، ولكن هذا خارج نطاق العمل الواردة في هذه الوثيقة. وأخيرا، فإننا نحذر من له صلة مباشرة ما قبل السريرية الملاحظات في هذا النموذج إلى المظاهر السريرية للمرض نقص تروية في البشر، وخصوصا عندما تستخدم الشباب والأصحاء والفئران بسبب الحدود الفسيولوجية الكامنة مثل ارتفاع معدل القلب 5. ومع ذلك، فإننا نعتبر هذا النموذج الجديد باعتباره أداة قيمة لكشف الآليات الأساسية للاستجابات لربط الأنسجة وتحديد الإمكاناتrapeutic الأهداف في جو المجراة في.

بالإضافة إلى الملاحظات المقدمة الجراحية في إجراء عملية ربط الشريان تغذية spinotrapezius (ملاحظة التشريحية (6A)، التمييز بين الشريان من الوريد (9A)، واستخدام رباط واحد (11A))، وبعض الجوانب الأخرى من الاستفادة من الإجراء المناقشة.

أولا، يتم إجراء شق مثالي الأولية التي عبر الحدود منصة الدهون الظهرية (أو مم عدة الذيلية إلى الكتف، إذا التصور عبر الجلد من غير الممكن) صغيرة مثل الجراح هو مريح مع، وتوسعت خلال الإجراء إذا لزم الأمر. هذه الممارسة يقلل من خياطة اللازمة لإغلاق الشق، وهو مناسب للجراح، ويقلل من الوقت الداخلي، وأيضا أقل تهيجا للحيوان خلال الانتعاش. بدلا من ذلك، قد شق الجلد أكبر من المناسب وفقا لتفضيل الجراح، منذ العضلات يمكن أن يكون أسهل لتحديد موقع مع حقل الموسعة. في هذه الحالة، قد شقالاستفادة من شكل حصان الأحذية المفتوحة مع وجه الإنسي للسماح للطي نحو العمود الفقري. في حين جعل شق الجلد وتمتد من خلال طبقات الجلد الثانوية، في حالة تلف سطح سفينة ويسبب نزيف، وتطبيق الضغط الخفيف مع شاش معقم وتوفير الوقت لالإرقاء.

أيضا من ملاحظة، فمن المهم للتعامل مع الأنسجة مع الحد الأدنى من القوة المطلوبة، وحيثما كان ذلك ممكنا الاستمرار مع ملقط أقرب إلى الحدود العضلات الجانبية للوبعيدا عن المنطقة الدماغية المقصود. هذه الممارسة تساعد على تجنب الإصابة سحق، الذي يمكن أن يؤدي إلى التهاب الأنسجة ردود إضافية بوساطة التي قد تؤدي إلى تشويش استجابة الأوعية الدموية إعادة عرض أثار من قبل ربط الشرايين.

في الختام، لقد أثبتنا استخدام العضلات spinotrapezius الفئران كنموذج لدراسة الأوعية الدموية الجراحية والأنسجة الردود على ربط شريني. هذا النموذج هو مناسبة لتقييم التغيرات intravital الأوعية الدموية (على سبيلسبيل المثال، توسع الأوعية الوظيفية)، وفيفو السابقين لتقييم التغيرات الوعائية (على سبيل المثال، والتصوير مناعي وتحديد الكميات من شبكات الأوعية الدموية). وقد أثبتت كل الدراسات ما قبل السريرية والسريرية أن استجابة الفرد لعرقلة شريني (على سبيل المثال عن طريق ربط في الفئران أو لويحات تصلب الشرايين لدى البشر) يعتمد على سنهم وجود أو عدم وجود مرض (مثل داء السكري) من قطر الشريان عرقلت ، التركيبة الجينية للفرد، والطلب التمثيل الغذائي في الأنسجة 11-15. نماذج الفئران، مثل تلك التي عرضت هنا، الباحث الاستفادة من الخلافات سلالة محددة التشريحية والوراثية والظواهر بأمراض محددة، مما يسهل تحقيق في هذه العلاقات المعقدة.

Disclosures

الكتاب تعلن أنها لا تملك المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgments

كيفن ماكلويد أن نعترف لاستخدام موسيقاه الإبداعية العموم المرخصة في الفيديو المرتبطة بها، بما في ذلك (بترتيب ظهورها) له المسارات "استراحة المطار" "جدران"، و "ميلودراما المساء." نود أيضا أن نعترف Ndubisi Okeke وTorstrick فريدريك لمساعدتهم مع الفيديو الجراحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Spinotrapezius نموذج الفئران لتقييم أثر ربط شريني ظيفة الاوعية الدموية الدقيقة وعلى إعادة عرض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter