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Medicine

Modello murino Spinotrapezius per valutare l'impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Dimostriamo un nuovo modello murino legatura arteriosa nei muscoli spinotrapezius, tra cui un passo-passo la procedura e la descrizione della strumentazione necessaria. Descriviamo l'intervento chirurgico e di misurare i risultati pertinenti relativi al rimodellamento della rete vascolare e la vasodilatazione funzionale usando la microscopia confocale e intravitale.

Abstract

Il spinotrapezius murino è un sottile muscolo superficiale sostegno scheletrico che si estende da T3 a L4, ed è facilmente raggiungibile tramite incisione cutanea dorsale. La sua anatomia unica rende le spinotrapezius utile per le indagini del danno ischemico e rimodellamento microvascolare successiva. In questo studio dimostriamo un modello arteriolare legatura nel muscolo murino spinotrapezius che è stato sviluppato dal nostro team di ricerca e tradotto 1-3. Per alcuni ceppi di topi vulnerabili, come il topo BALB / c, questa chirurgia legatura crea affidabile ischemia del muscolo scheletrico e funge da piattaforma per lo studio terapie che stimolano la rivascolarizzazione. Metodi di valutazione sono anche dimostrato, compreso l'uso di microscopia confocale e intravitale. Il spinotrapezius è adatto a studi di imaging tali a causa della sua accessibilità (anatomia dorsale superficiale) e la magrezza relativa (60-200 micron). Il muscolo spinotrapezius può essere montato en face, facilitandoimmagini delle reti microvascolari intero muscolari senza sezionamento istologico. Descriviamo l'uso della microscopia intravitale acquisire seguenti metriche una procedura funzionale vasodilatazione, specificamente, l'aumento del diametro arterilar come risultato della contrazione muscolare. Abbiamo inoltre dimostrato le procedure di raccolta e fissa i tessuti, necessario precursore immunostaining studi e l'uso di microscopia confocale.

Introduction

I modelli animali di ischemia cronica sono strumenti preziosi per lo studio della fisiopatologia delle malattie ischemiche, come la malattia delle arterie periferiche, malattia coronarica e malattia cerebrovascolare. Nei roditori, come negli esseri umani, occlusione arteriosa conduce rimodellamento strutturale della rete vascolare, compresi arteriogenesi e angiogenesi. Nei pazienti sani e più giovani, questo rimodellamento può essere sufficiente per salvare il tessuto da ischemia indotta da lesioni, ma co-morbidità come diabete può compromettere rimodellamento e recupero. La comprensione dei meccanismi alla base di eventi di rimodellamento vascolare è essenziale per lo sviluppo di terapie che stimolano questi processi endogeni di rivascolarizzazione.

Attualmente, legatura dell'arteria femorale o resezione in hindlimb è la tecnica standard per studiare cronica ischemia indotta rimodellamento vascolare in piccoli animali 4,5. Analisi del diametro, la connettività, e reattività dii microvasi che compongono valle rete vascolare dell'arteria femorale ligato è difficile, tuttavia, a causa dello spessore dei muscoli. Abbiamo sviluppato un modello arteriolare legatura nel topo muscoli spinotrapezius: legatura unilaterale dell'arteria alimentazione laterale in questo muscolo dorsale stabilizzazione 1. Le spinotrapezius relativamente sottili (60-200 micron) è suscettibile di faccia immunocolorazione en per la valutazione della topologia di rete intero con un solo cella di risoluzione, che permette un esame dettagliato degli eventi rimodellamento vascolare attraverso tutto il tessuto. Il spinotrapezius è anche superficiale e accessibile, e quindi le sue navi sono facilmente osservabili al microscopio intravitale, per la caratterizzazione efficace l'impatto di rimodellamento e legatura arteriolare sulla reattività vascolare.

In questo rapporto, descriviamo in dettaglio e dimostrare il mouse spinotrapezius modello di legatura arteriolare. Sia in vivo ed ex vivo methods chirurgia di valutazione sono descritti di seguito, compresa la misurazione della vasodilatazione funzionale, che ha dimostrato di essere compromessa in condizioni ischemiche 6, e l'imaging di immunofluorescenza intero muscolari reti microvascolari. Abbiamo anche risultati di due studi pilota separati per dimostrare l'utilità del modello. Prima, abbiamo utilizzato il modello arteriosa legatura per indurre un aumento statisticamente significativo tortuosità vaso in topi C57BL / 6 (Figura 2B). Tortuosità aumenta durante arteriogenesi in arteriole collaterali. In altri ceppi di topi, che sono più vulnerabili all'ischemia dovuta all'assenza di arteriole collaterali (ad es Balb / c), si osserva arterialization capillare 10. Arterialization capillare viene rilevata da diametri maggiori e lo sviluppo di α-actina del muscolo liscio reattività. Secondo, la stimolazione elettrica funzionale del muscolo porta a vasodilatazione in arteriole terminali del spinotrapezinoi (Figura 3B).

Protocol

1. Spinotrapezius feed Arteria Chirurgia legatura

  1. Anestetizzare topo mediante iniezione intraperitoneale. In una siringa da 0,5 ml, formulare: 0,06 ml di 100 mg / ml Ketamina
    0.03 ml di 20,0 mg / ml Xylazina
    0,01 ml di 0,4 mg / ml atropina
    0,30 ml di soluzione salina allo 0,9%.
    Dose: 0.01 * ml per grammo di peso corporeo, ip

* Dose variabile su ceppo di topi e stock, in modo da regolare di conseguenza il recupero del mouse si trova a un'ora da induzione.

  1. Applicare una pomata oftalmica di serie per prevenire l'essiccamento della cornea.
  2. Rimuovere i capelli dalla parte posteriore utilizzando Clippers taglio, seguito da breve applicazione di crema depilatoria.
  3. Disinfettare il campo chirurgico con clorexidina o polivinilpirrolidone-iodio. Alternate povidone-iodio con etanolo per tre volte, per finire con povidone-iodio.
  4. Trasferire il mouse sulla superficie precedentemente preparata lavoro chirurgico, con il rilievo di riscaldamento e telino sterilein posizione.
  5. Creare una incisione lineare (3-5 mm) attraverso la pelle dorsale circa 5 mm caudalmente alla prominenza ossea della scapola usando forbici iris e pinze modello standard (es. FST, 11.271-30) dalla tenda tessuto e taglio parallelo colonna vertebrale. Il sito di incisione di destinazione può essere identificato con la visualizzazione transdermico del cuscinetto dorsale grasso se i permessi di pigmentazione della pelle, tagliare al confine caudale del cuscinetto adiposo. Espandere l'incisione, se necessario, e si estendono attraverso gli strati cutanei secondari con le forbici a molla.
    1. Nota anatomica - Il muscolo spinotrapezius trova dorsalmente e si estende da T4 a L3 lungo entrambi i lati della colonna vertebrale. Il bordo anteriore si estende lateralmente a circa la scapola. Il muscolo si rastrema in direzione caudale in modo che il bordo più posteriore si trova medialmente al margine anteriore, e può fissare a filo con la spina dorsale. Due cuscinetti di grasso sono anche importante notare, posa direttamente dorsale e ventrale ai spinotrapeziusmuscolo verso la metà del cranio.
    2. Infiammazioni per l'incisione ha dimostrato di avere alcun effetto sulla risposta rimodellamento vascolare, come chirurgia legatura sham ha mostrato alcun cambiamento nel rimodellamento della vascolarizzazione spinotrapezius. Due fattori spaziali contribuiscono a questo risultato. Prima l'incisione viene rimosso da 5 mm in direzione craniale della regione di interesse in cui la risposta vascolare nel muscolo è tipicamente esaminato. Inoltre, il sito di incisione sulla pelle dorsale è separato dal sito legatura dei vasi da un pad ventrale grasso che si trova sulla sommità del terzo craniale del muscolo spinotrapezius.
  6. Irrigare l'incisione con la soluzione di Ringer riscaldata per prevenire l'essiccamento del muscolo. Applicazione di vasodilatatori come papaverina aiuterà a visualizzare l'arteria obiettivo per legatura.
  7. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare pinze per smussare sezionare e separare (ma non rimuovere) la dorsale bianco-pad grasso dal musc sottostantetessuto colare per visualizzare la vascolarizzazione, che entra ed esce dalla spinotrapezius sul suo bordo laterale.
  8. Individuare l'arteria bersaglio, che insieme con una o due coppie di vene, passa attraverso il cuscinetto di grasso che è ventrale alle spinotrapezius il suo cammino verso il bordo laterale del muscolo. Questa arteria alimenta una porzione sostanziale della metà caudale del muscolo, che può essere confermata da riflettere e sostituendo il muscolo di osservare il percorso dell'arteria all'interno del muscolo. La posizione di destinazione è il segmento legatura dell'arteria uscita dal pad ventrale grasso e immettendo il muscolo, ed è piuttosto accessibile in questa regione. L'arteria-vena coppia potrebbe essere necessario delicatamente separata dal pad ventrale grasso in questa regione. Si noti che il spinotrapezius è alimentata da molteplici arteria-vena coppie, comprese le navi che attraversano sia le pastiglie dorsali e ventrali di grasso. Fare attenzione a non interrompere questi vasi.
    1. Più indicatori possono essere utilizzati per distinguere arteriadalla vena. Uno dei metodi migliori è quello di ostacolare il flusso di sangue delicatamente con la microsonda e spostare a monte dal muscolo; flusso non riprenderà nell'arteria finché l'ostruzione viene rilasciato. Colore può anche essere usato, come pareti venose contengono una guaina biancastra di tessuto connettivo che mancano arterie. Inoltre, si può considerare il diametro prima dell'applicazione di vasodilatatore come vene sono tipicamente di dimensioni maggiori.
  9. L'arteria è tipicamente in prossimità della sua vena accoppiato; utilizzare scollamento con una microsonda e # 5 forcipe per isolare un segmento di circa 5 mm, passando la microsonda dietro l'arteria, e utilizzando la punta per fare un gap più ampio nella naturale fessura tra l'arteria e la vena. Questo è il varco attraverso il quale la sutura viene filettato.
  10. Utilizzando 10-0 sutura singolo filo e dell'ago segnaposto una legatura intorno all'arteria alimentazione (~ 70 micron di diametro) verso l'estremità prossimale del segmento sezionato utilizzando nodo di un chirurgo. Place un ulteriore legatura verso l'estremità distale del segmento dell'arteria sezionato, con separazione sufficiente tra legature per consentire transezione dell'arteria.
    1. La piccola scala associato con l'arteria alimentazione spinotrapezius porta a un maggiore difficoltà chirurgica, rispetto alla legatura di un vaso più grande, come l'arteria femorale. Chirurghi inesperti in particolare si hanno alti tassi di avulsione, emorragia involontaria, e altre complicanze chirurgiche. Di particolare interesse è la difficoltà di individuare e tagliare l'arteria incolore dopo che il flusso è stato impedito appena prima del taglio. Per queste ragioni, ponendo due legature è raccomandato per chi non sia la procedura, il chirurgo ha una guida visiva nel localizzare dove transetto l'arteria e la conferma del taglio con la separazione facilmente osservabili dei due legature. Tuttavia, un chirurgo più esperto può trovare una legatura singola sufficiente, purché siano in grado di chiaramenteindividuare e tagliare le arterie valle della legatura. Mentre questa tecnica riduce il rischio di intaccare involontariamente una nave vicina alla sutura legatura tagliente, non è priva di inconvenienti, tra cui difficoltà aumentata nel confermare l'arteria stato sezionato.
  11. Verificare legatura osservando diminuzione del flusso di sangue (RBC ostruito colonna) a valle del sito di legatura (cioè verso il muscolo).
  12. Usando forbici transetto dissezione dell'arteria ligato, tra le due legature. Se solo una legatura è stato posto (11a), tagliato con estrema cura nella direzione a valle.
  13. Droga caricato plain-film (1 mm) può essere posta a valle (caudalmente) come parte della procedura sperimentale.
  14. Riposizionare la fascia sfollati e tessuto adiposo per l'orientamento originale.
  15. Chiudere l'incisione cutanea con 8-0 punti di sutura non riassorbibili. Quindi posizionare il mouse in una gabbia preparata recupero riscaldato sotto osservazione e amministrare un apinappropriate analgesico come bupivacaina, 0,02-0,05 ml 0,25% infiltrazione locale.

2. Spinotrapezius microscopia intravitale, in situ

  1. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione con 3-4% vaporizzato isoflurano in ossigeno al 100% ad una velocità di flusso di 3-4 L · min -1.
    1. L'uso di anestesia per inalazione è preferibile per misurazioni funzionali perché c'è minore depressione cardiovascolare che con anestetici iniettabili. Se l'anestesia inalatoria in non disponibili, anestetici iniettabili a lunga azione, come sodio pentobarbital sono preferiti per evitare iniezioni ripetute volta che l'animale è stato posizionato.
  2. Una volta anestetizzato, continuamente fornire isoflurano attraverso una maschera di anestesia (cono di aka) a concentrazioni di manutenzione (in genere ~ 2%) e il tasso di flusso di 0,5-1 L · min -1.
    1. Topi prevalentemente ventilare attraverso i loro passaggi nasali, quindi è solo ncasario per coprire il naso con il diaframma maschera anestesia.
  3. Se necessario, rimuovere i capelli dalla parte posteriore utilizzando cesoie taglio e crema depilatoria.
  4. Trasportare l'animale al pad calore.
    1. È importante mantenere topi in uno stato euthermic per evitare freddo indotta vasocostrizione, che può essere realizzato attraverso lampade, acqua circolante pastiglie di calore, riscalda microwavable pastiglie, ecc
  5. Inserire la sonda di temperatura rettale e impostare termo-regolatore a 35 ° C.
  6. Effettuare una incisione cutanea alla fine caudale dei spinotrapezius con le forbici iris e pinze dello stile internazionale.
  7. Estendere l'incisione cranialmente al cuscinetto adiposo, la creazione di una incisione ferro di cavallo, e coprire il lembo cutaneo con involucro di plastica per prevenire l'essiccamento.
  8. Blunt sezionare il tessuto connettivo sottocutaneo con pinze e forbici a molla per massimizzare la visibilità.
  9. Posizionare gli elettrodi stimolanti come toge vicinother possibile, per ridurre al minimo le dimensioni del campo corrente, e posizionarli all'estremità caudale del muscolo esposto appena lateralmente alla colonna vertebrale.
  10. Eseguire una stimolazione di prova per verificare il posizionamento degli elettrodi con un sistema di elettrodi di acquisizione dati, stimolo isolatore dell'elettrodo, e controller computer, con onde quadre di durata 200 msec, 2 mA ampiezza, consegnato a 1 Hz.
  11. Posizionare l'involucro di plastica sopra il muscolo esposto per prevenire l'essiccamento.
  12. Iniziare il cronometraggio un periodo di 30 minuti durante il quale i diametri dei vasi si equilibrano.
  13. Posizionare il microscopio intravitale sopra il muscolo spinotrapezius per visualizzare l'architettura vascolare.
    1. Se si utilizza un obiettivo a immersione, una goccia di PBS tra l'obiettivo e l'involucro di plastica.
  14. Partenza sopra l'arteriola principale (la più grande vaso visibile), manipolare la fase nel piano XY per individuare il vaso di interesse.
    1. Visualizzare piccolo arterioles con luce riflessa microscopio richiede un maggiore contrasto rispetto a quanto previsto dal rosso-cella della colonna. Si utilizzano principalmente un lato-stream microscopio a campo scuro imaging per migliorare il contrasto microvascolare, ma invece può essere migliorata con un microscopio a luce riflessa fluorescente dopo l'iniezione endovenosa di un elevato peso molecolare fluorescente destrano.
  15. Dopo i 30 minuti di equilibrio, acquisire un'immagine / video del vaso di interesse.
  16. Stimolare il muscolo con onde quadre di 200 psec durata, ampiezza 2 mA, consegnato a 8 Hz, per 90 secondi, come descritto sopra.
  17. Cattura un'altra immagine / video stimolazione immediatamente dopo e continuare a catturare ogni minuto fino nave è tornato al diametro di riposo, ~ 10 min.
  18. Ripetere i passaggi 6-18 utilizzando il muscolo controlaterale.
  19. L'analisi dei dati può essere eseguita in tempo reale con pinze video o off-line con il software di analisi delle immagini.
  20. Eutanasia seguire il mouseing IACUC protocollo.

3. Tissue Harvest Spinotrapezius e fissaggio

  1. Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale, come nella formulazione Spinotrapezius passo legatura dell'arteria alimentazione 1.
  2. Fai un millimetro di incisione più cranici alla prominenza ossea della scapola del mouse con le forbici iris e pinze dello stile internazionale. Espandere l'incisione lateralmente e caudalmente su entrambi i lati.
  3. Rilasciare la pelle dal tronco dorsale delicatamente riflettendo la pelle e tagliare la fascia superficiale.
  4. Utilizzare smussa per rimuovere il tessuto adiposo dorsale con pinze standard, e poi riflettere e allo stesso modo il muscolo sezionare il tessuto adiposo ventrale.
  5. Rimuovere fascia sovrastante il muscolo con pinze e forbici a molla. Questo passaggio può essere difficile e richiede tempo, ma è importante per migliorare immunofluorescenza e di imaging. Mantenendo il tessuto idratato può facilitare la rimozione della fascia.
  6. Individuareil bordo laterale del muscolo, e utilizzare smussa per separare il muscolo spinotrapezius dal cuscinetto adiposo che si trova ventrale ad esso.
  7. Continua la dissezione smussa in un cranio in direzione caudale. Si noti che i vasi sanguigni più entrare e uscire da questa superficie ventrale del muscolo; se perfusione è richiesto, dovrebbe essere eseguita prima sezionare questi vasi. Si noti inoltre che nella metà caudale del muscolo, gli inserti bordo laterale nel muscolo ventrale giace ad esso. Alcuni di taglio può essere richiesto lungo questo confine per definire completamente e liberare il bordo.
  8. Accise il muscolo spinotrapezius. Per fare ciò:
    1. Libera il bordo laterale del muscolo come descritto sopra.
    2. Tagliare trasversalmente misura più craniale del muscolo.
    3. Tagliare lungo il bordo mediale (lungo la colonna vertebrale), nel piano sagittale.
  9. Procedura Ripetere i passaggi 4-9 a muscolo controlaterale, e quindi l'eutanasia mOuse con un metodo IACUC approvato.
  10. Fissare i tessuti di gelatina rivestite vetrini per immersione in metanolo freddo (4 ° C) o in paraformaldeide 4% / soluzione di acqua deionizzata a temperatura ambiente per 20 min.
    1. In alternativa, la fissazione di perfusione può essere impiegato. Prima del punto 2, eseguire una toracotomia, fare un'incisione nell'atrio destro, vascolarizzazione e profumato con 5 ml di Tris 1 × soluzione salina tamponata con 0,1 mM CaCl 2 e 2% eparina attraverso il ventricolo sinistro, seguito da 5 ml di 4 % paraformaldeide per fissaggio vaso, e infine 5 ml di Tris 1 × soluzione salina tamponata con 0,1 mM CaCl 2 7.
  11. Immediatamente fissazione seguente, lavare campione quattro volte per 20 minuti ciascuno utilizzando 0,01 M tampone fosfato salino (PBS) con 0,1% saponina.

Representative Results

Una vista chirurgica dell'arteria principale che alimenta il muscolo spinotrapezius che subisce legatura è mostrato in Figura 1, con etichette indicanti aree di interesse. Un'immagine esempio confocale della regione raccolti e immunostained del muscolo situato direttamente a valle dell'arteria ligato una settimana dopo la legatura viene mostrato nella figura 2A. Arteriole collaterali ingrandite contenenti muscolatura liscia alfa-actina esprimono cellule muscolari lisce (rosso) mostrano tortuosità seguente caratteristica legatura. Tortuosità nave, riportato come il rapporto tra la lunghezza della nave percorso e la distanza del cavo (cioè, la linea che si estende oltre le estremità stesse percorso vaso), nel muscolo ligato (destra) è maggiore rispetto a unligated muscolo controlaterale (Figura 2B; n = 8) . Figura 3 mostra i risultati di uno studio pilota in cui è stata misurata terminale vasodilatazione delle arteriole funzionale utilizzando microscopia intravitale. Come previsto, arteriolare di diametro compreso aumenta in modo significativo dopo stimolazione elettrica indotta contrazione muscolare.

Figura 1
Figura 1. Campo chirurgico del riflesso muscolare spinotrapezius e arteria di alimentazione. L'arteria di alimentazione è legata a due punti indicati da A0. Tra queste legature e dopo l'ostruzione del flusso di sangue, l'arteria è sezionato al sito indicato da A. Il segmento mirato delle transizioni arteria dal pad ventrale grassa, delineato da C, nel muscolo spinotrapezius, delineato da D, sul sito indicato con la freccia di direzione del flusso è indicata da B. tratteggiata freccia E.

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Figura 2. Immagine confocale della rete microvascolare muscolare spinotrapezius per lo studio pilota di tortuosità. (A) Raccolta e muscolo intero è stato montato per la muscolatura liscia immunostained alfa-actina e con immagini usando la microscopia confocale. Il campo di visualizzazione mostra la regione del muscolo situato direttamente a valle della ligato arteriola 1 settimana dopo la legatura. Vasi tortuosi sono evidenti nel muscolo come risultato della legatura (B) i risultati dello studio pilota mostrano aumentato significativamente (p = 0,035; 1 Student tailed t-test). Tortuosità esposti da microvasi nel muscolo ligato misurata dalla lunghezza della nave percorso Rapporto distanza cavo per una prova di topi C57BL / 6 (n = 8) rispetto al controllo controlaterale.

Figura 3
Figure 3. Microscopia di imaging funzionale intravitale di vasodilatazione nelle arteriole spinotrapezius, in vivo. (A) microfotografie rappresentativi di arteriole terminali spinotrapezius a riposo (a sinistra) e subito dopo la cessazione di 8 Hz contrazione muscolare (a destra). (B) Terminale diametro delle arteriole a riposo ( 8,5 ± 0,5 micron, a sinistra) e subito dopo (11 ± 1 micron, al centro) 90 sec di contrazione muscolare, che ha significativamente aumentato diametro arteriolare (p = 0,032; 1-coda paired t-test) in topi BALB / c (n = 6). La variazione percentuale indicata (a destra).

Discussion

Il modello murino legatura spinotrapezius presentato qui è un modello efficace per piccoli animali per lo studio degli adattamenti strutturali e funzionali che derivano da una occlusione arteriosa. Questo modello è complementare al modello ampiamente utilizzato ischemia hindlimb 4, in quanto fornisce un intero muscolo vista intatti reti microvascolari con elevata risoluzione spaziale. Inoltre, dato che questo muscolo si trova appena sotto la pelle dorsale, è accessibile per l'imaging di serie con la microscopia intravitale, e per la consegna della droga locale tramite superfusione o impianto a film sottile 2. Queste caratteristiche lo rendono un modello attraente piccolo animale in cui studiare gli effetti di nuovi bersagli terapeutici sul rimodellamento vascolare e la vasodilatazione funzionale dopo occlusione arteriosa.

Si noti che deve essere usata cautela quando si confrontano i dati acquisiti nel modello legatura spinotrapezius ai dati acquisiti nel modello di legatura arti posteriori a causa di diverse chiavi differences. In primo luogo, i muscoli si stanno stabilizzando spinotrapezius muscoli, e si differenziano dai muscoli delle gambe in termini di funzione e tipo di distribuzione delle fibre. Il nostro gruppo ha dimostrato che la legatura arteriolare nel muscolo spinotrapezius crea ipossia o meno trascurabile in ceppi con reti collaterali ben sviluppati arteriolare, rispetto alla ipossia osservata nella zampa posteriore dopo la legatura dell'arteria femorale nel modello hindlimb 1,8 - 10. Abbiamo inoltre dimostrato che il modello legatura spinotrapezius produce una diversa risposta rimodellamento in topi Balb / c rispetto a topi C57BL / 6, con Balb / c rimodellamento topi reti da collateralizzazione capillare e rimodellamento C57BL / 6 dall'allargamento esistenti connessioni arteriolare 3. C'è un parallelo interessante tra queste osservazioni e quelle contenute nei modelli legatura arti posteriori, in cui topi Balb / c sperimentare una ripresa prolungata perfusione dopo legatura rispetto a topi C57BL / 6 9,11,12 </ Sup>. In altri modelli di ischemia tissutale, l'età del mouse 13 sesso 14 e la presenza di malattia 15 incidere anche le risposte dei tessuti 'a occlusione arteriolare, anche se non abbiamo ancora testato questi predittori nel modello di legatura spinotrapezius.

In secondo luogo, la dimensione della arteria che viene ligato nel modello spinotrapezius è sostanzialmente minore l'arteria femorale, e pertanto, la legatura incide un volume di tessuto più piccolo che è più a valle, ossia ad un livello inferiore dell'albero circolatorio, nel spinotrapezius rispetto al hindlimb 3. Quindi, la differenza nella posizione anatomica della legatura in questi due modelli dovrebbero essere considerati quando si confrontano le rispettive risposte fisiologiche (es. rimodellamento vascolare) di questo intervento.

Terzo, la sottigliezza delle spinotrapezius può permettere ossigeno di raggiungere la porzione unperfused del tessuto dalla vicinatessuto, rispetto alla ischemia e ipossia combinata nel modello hindlimb come notato sopra 3. Quarto, il recupero del flusso verso la porzione di valle spinotrapezius della legatura è più veloce rispetto alla legatura arti posteriori. Il modello di legatura spinotrapezius è un modello unico nel suo genere cronica e non deve essere confuso con altri modelli di transitoria occlusione arteriosa o modelli di danno ischemia riperfusione. Riteniamo che sia possibile adattare questo modello per accogliere questo tipo di condizioni, ma questo è al di fuori del campo di applicazione del lavoro qui presentato. Infine, in guardia contro direttamente relative osservazioni precliniche in questo modello alle manifestazioni cliniche della malattia ischemica negli esseri umani, in particolare quando si utilizza giovane e in buona salute e topi a causa dei limiti intrinseci fisiologici come la frequenza cardiaca superiore 5. Tuttavia, riteniamo che questo nuovo modello, come un valido strumento per scoprire i meccanismi di base della risposta dei tessuti per la legatura e individuando il potenzialeobiettivi rapeutic in un ambiente in vivo.

Oltre alle note chirurgiche previste nel spinotrapezius procedura di legatura dell'arteria alimentazione (nota anatomica (6a), distinguendo l'arteria dalla vena (9a), e l'uso di una singola legatura (11a)), alcuni aspetti altro beneficio dalla procedura discussione.

In primo luogo, l'incisione iniziale effettuata oltre il confine dorsale cuscinetto adiposo (o qualche mm caudalmente alla scapola, se la visualizzazione transdermica non è possibile) è idealmente fatto piccolo come il chirurgo sta bene con, e ampliato durante la procedura se necessario. Questa pratica riduce la sutura necessaria per chiudere l'incisione, che è conveniente per il chirurgo, riduce il tempo della procedura, ed è anche meno irritante per l'animale durante il recupero. In alternativa, una incisione cutanea più grande può essere appropriato in base alla preferenza chirurgo, poiché il muscolo può essere più facile da individuare con un campo espanso. In questo caso, l'incisione puòbeneficiare di un ferro di cavallo con una faccia mediale aperto per consentirne il piegamento verso la colonna vertebrale. Rendendo l'incisione cutanea e si estende attraverso gli strati cutanei secondari, se la nave superficie è danneggiata e provoca emorragia, applicare una leggera pressione con garza sterile e fornire tempo per emostasi.

Anche di nota, è importante gestire il tessuto con la minima forza necessaria, e se possibile tenere con una pinza più vicino al bordo laterale del muscolo e lontano dalla zona prevista ischemico. Questa pratica aiuta a evitare lesioni da schiacciamento, che può portare a ulteriori risposte mediate infiammatoria del tessuto che possono confondere il rimodellamento vascolare risposta evocata dal legatura arteriosa.

In conclusione, abbiamo dimostrato l'uso del muscolo murino spinotrapezius come modello chirurgico per l'esame risposte vascolari e tessuti di legatura arteriolare. Questo modello è adatto per la valutazione di intravitale cambiamenti vascolari (per laesempio, vasodilatazione funzionale), e per la valutazione ex vivo di cambiamenti vascolari (per esempio, l'imaging immunofluorescenza e la quantificazione di reti vascolari). Entrambi gli studi preclinici e clinici hanno dimostrato che la risposta di un individuo ad ostruzione arteriolare (ad esempio tramite legatura in topi o placche aterosclerotiche nell'uomo) dipende dalla loro età la presenza o assenza di malattia (diabete mellito) il diametro dell'arteria ostruita , il corredo genetico dell'individuo, e la domanda metabolica del tessuto 11-15. Modelli murini, come quello qui presentato, avvalersi il ricercatore del ceppo-specifiche anatomiche e le differenze genetiche e malattie specifiche fenotipi, che facilita indagini in queste complesse relazioni.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Acknowledgments

Riconosciamo Kevin Macleod per l'uso creativo della sua musica Commons licenza nel video associato, tra cui (in ordine di apparizione) il suo "Airport Lounge," tracce "Wallpaper" e "Melodramma Sera." Vorremmo inoltre ringraziare Ndubisi Okeke e Federico Torstrick per la loro assistenza con il video chirurgia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Modello murino Spinotrapezius per valutare l&#39;impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento
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Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

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