Summary
RPPA позволяет экспрессии белка сотен образцов, напечатанных на нитроцеллюлозные слайды на допрос одновременно, с использованием флуоресцентно меченых антител. Этот метод был применен для изучения влияния препарата неоднородности лечения в течение ясно рак почек.
Protocol
1. Определение морфологических и молекулярных опухоли гетерогенность
- Опухоль удалена от -80 ° C морозильнике и хранится на сухом льду.
- Разделите опухоли на секции примерно на 1 см 3. Карта исходное положение каждой опухоли раздел по отношению друг к другу и этикетку с уникальным именем. Магазин образцов в отдельных криопробирки при -80 ° С до готовности к употреблению.
- Пальто образцов в октябре и сократить в криостат при -22 ° C.
- Образцы окрашивали гематоксилином и эозином counterstaining метод.
- Микроскопический анализ замороженных срезах, чтобы убедиться, что они имеют ccRCC природы, жизнеспособной опухоли и для сортировки (низкий класс, высокий класс или смешанной низкого / высокого класса, сложно дифференцировать Фурман классы с 1 по 4 на замороженный участок). Рисунок 1 & B (H & E окрашивание высокого низкого и смешанного класса).
- Выберите до 4 образцов из каждой морфологически различные области внутри каждой опухоли для экстракции белков.
2. Белки извлечения из образцов опухолей
- Вырезать опухоль выборки из октябре
- Место 50-75 мг ткани в 2 мл пробирки с 990 мкл буфера для лизиса [50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 5 мМ EGTA (рН 8,5), 150 мМ NaCl] дополнена апротинин (Sigma A6279) (10 мг / мл), смесью для ингибирования фосфатаз 2 (Sigma, P5716), смесью для ингибирования фосфатаз 3 (Sigma, P0044) и коктейль ингибиторов протеаз (Roche, 11836153001).
- Добавить один 5 мм стальной шар в каждую пробирку и гомогенизируют при 50 Гц в течение 5 мин дважды, используя TissueLyser, проверка уровня гомогенизации после каждого 5-минутного периода.
- Передача гомогенизированный образец нового 2 мл трубки с помощью пипетки выходя из стальной шарик позади.
- Добавить 10 мкл Тритон Х-100 в каждом образце до центрифугирования при 13000 х г в течение 30 мин при 4 ° C.
- Передача супернатантов на свежий труб микроцентрифуге.
- Определение концентрации белка использовании BCA анализа (рис. 2).
- Нормализация концентрации белка в концентрации 1 мг / мл.
3. Антитела проверки
- Подготовка образцов белка (выдержка из подходящих линий клеток или тканей) для вестерн-блот и работают на 10% SDS-PAGE гель.
- Передача образцов на нитроцеллюлозные мембраны в течение ночи при 4 ° C.
- Блок мембраны в Li-Cor Odyssey блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Развести первичных антител в Li-Cor Odyssey блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) на производителей рекомендуется разбавление обычно 1 на 1000.
- Инкубируйте мембраны в первичных антител в течение ночи при 4 ° C.
- Убедитесь, что на 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 1 мл Tween20 / 1л PBS).
- Вымойте мембраны в PBS-T при комнатной температуре в течение 5 мин (x3).
- Развести флуоресцентно-меченых вторичных антител в Odyssey блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) 0,01% ДСН при разведении 1:10000 (1,5 μl/15 мл).
- Инкубируйте мембраны в среднемАнтитела при комнатной температуре в течение 45 мин при осторожном встряхивании - это важно для защиты мембраны от света до тех пор, как он был окончательно сканирования.
- Вымойте мембраны в PBS-T при комнатной температуре в течение 5 мин (x3), сохраняя мембраны в темноте.
- Вымойте мембраны в PBS при комнатной температуре в течение 5 мин (x3), чтобы удалить остатки Tween20, опять поддержанию мембраны в темноте.
- Ли мембраны квартира на кусок фильтровальной бумаги в темноте и дайте высохнуть на воздухе - позволяет мембрана высохнуть может усилить сигнал и снизить фон, но сделать его бесполезным для зачистки и повторного зондирования.
- Сканирование мембраны на сканер Odyssey Licor. Держите мембраны в темноте до тех пор, как он был отсканирован.
- Только выберите антитела, которые генерируют одну преобладает группа при правильной молекулярной массой. Рисунке 3 приведены примеры допустимых и недопустимых антител для использования с RPPA.
4. RPPA Printing
- Белки лизатов были замечены на нитроцеллюлозные-стекла с покрытием слайды (Fastslides-ватман) с помощью Microgrid II роботов корректировщик. Слайдах использованы содержал 2 колодки, на котором образцы были замечены. Каждая площадка была замечена с идентичными образцами, в данном случае 100 образцов. Другие доступные форматы включают в себя 1, 8 и 16 слайдов площадку. Чем выше число площадок меньшего количества образцов, которые могут быть выставлены на каждого.
- Серия из пяти 2-кратные разведения были сделаны из каждого образца и каждый из них был затем обнаружен в трех экземплярах (в результате чего в общей сложности 15 мест в образце).
5. RPPA детекции белка
- Мокрый слайды более Licor блокирующего буфера (разбавленный 50:50 в PBS). Выдержите при комнатной температуре в течение 1 часа на качающейся платформе.
- Подготовка 800 мкл первичных антител в Licor блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) в нужной концентрации и держать на льду.
- Установите слайды либо (I) один клип Chip кадровили (II) четыре "FastFrame" отсек держателя слайдов, так что уплотнение образуется между горкой и инкубационной камере.
- Удалите остатки буфера из колодцев и добавить 600 мкл первичных антител в соответствующие лунки.
- Поместите слайд-шоу и камеру в герметичный мокрого окна и инкубировать на качающейся платформе течение ночи при 4 ° C.
- Убедитесь, что на 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 100 мкл Tween 20/100 мл PBS).
- Удалить слайды из холодной комнате и осторожно удалить первичных антител из каждой лунки.
- Добавить 600 мкл PBS-T и мыть слайды на качающейся платформе при комнатной температуре в течение 5 мин (X3).
- Подготовка флуоресцентно-меченых вторичных антител путем разбавления в Odyssey блокирующего буфера (50:50 разбавляют в PBS) 0,01% SDS в разведении 1:2000 (1 мкл / 2 мл) в первой инстанции.
- Удалите буфер из колодцев и добавить 600 мкл флуоресцентно-меченого вторичного антитела к соответствующим скважин. Инкубируйте вторичные антитела при комнатной температуре в течение 45 мин при осторожном встряхивании - этоВажно, чтобы защитить мембрану от света до тех пор, как он был окончательно сканирования.
- Удалить вторичные антитела из хорошо и кратко стирки (x3) в 600 мкл PBS-T при комнатной температуре. Удалить слайд с носителем, трансфер в подходящую емкость и промыть более PBS-T в течение 15 мин, сохраняя мембраны в темноте.
- Удалить PBS-T и дальнейшей промывки мембранных PBS при комнатной температуре в течение 15 мин для удаления остаточных Твин-20, снова поддержанию мембраны в темноте.
- Высушите Fastslide в 50 ° C духовке в течение 10 мин, а затем сканировать на Li-Cor Odyssey сканера. Держите слайд в темноте, пока не будут отсканированы.
- Сканирование слайдов при 680 нм и / или 800 нм в зависимости от вторичными антителами / Антитела используются. В течение двух-определение цвета всегда использовать высоко перекрестно адсорбированных вторичными антителами, чтобы минимизировать перекрестную реактивность. Тщательный отбор первичных и вторичных антител, необходимых для двухцветного обнаружения. Первостепенное значение имеет выборразличных видов хозяев (например, кроликов и мышей) для двух первичных антител. Это позволяет дискриминация анти-кролик и анти-мышиных вторичные антитела, которые помечены краской с легко различимыми спектров излучения.
- Файлы изображений сохраняются как. Файлы TIFF. Рисунке 4 (изображение сканируемых файлов).
6. Анализ данных
- Запустите программу MicroVigene (VigeneTech, Карлайл, штат Массачусетс, США).
- Открыть. TIFF-файл, содержащий изображение сканирования слайдов RPPA.
- Выберите предопределенный файл шаблона, который будет иметь сетку для наложения на изображение слайда RPPA.
- Нажмите Определить регионы (ROI) кнопки, чтобы вызвать Grid.
- Установите сетку на местах RPPA. Рис. 6а (изображение сетки на изображении).
- Нажмите кнопку Выбрать все, чтобы выделить все ROI.
- Нажмите кнопку Найти все. MicroVigene будет автомматически найти ROI, найти места, вычитание фона, удалить пыль и количественно пятна.
- Нажмите на кривой Посмотреть разведение кнопку, чтобы открыть результаты для всех образцов на слайде RPPA.
- Нажмите кнопку Сохранить, разведение данных.
- Поскольку каждый образец напечатан на 5 баллов разбавления каждый в трех экземплярах есть 15 очков, чтобы проанализировать, что снижает риск ошибок и улучшает качество подгонки кривой. MicroVigene производит 4-параметров логистической логарифмической модели "Supercurve" алгоритм (рис. 6б), которая включает в себя все места, чтобы произвести сигмовидной кривой антиген-антитело кинетики. Предполагается, что тот же антиген-антитело кинетику связывания происходит в каждом образце месте, даже в разных образцах, таким образом, принимая все пятна на массив, чтобы соответствовать общей кривой ответ может повысить доверие кривой 10,11
Y = + ((BA) / (1 + Е (C * D-Ln (X)))
где х dilutioп фактор и Y является интенсивность сигнала.
Образцы могут быть сравнительный анализ с помощью y0 значение, которое в нашем анализе соответствовало значению у в середине Х значения после преобразования тех, на supercurve. - Экспорт данных в Microsoft Excel и земельный участок y0 как показано на рисунке 7.
- Внутриопухолевые дисперсии белка рассчитывается отдельно для необработанных и обработанных пациентов в рамках ANOVA. Разница распределения объединения данных из всех анализируемых белков сравнивали теста Манна-Уитни (МВт). Внутриопухолевые отклонений для отдельных белков сравнивали с помощью F-теста, где предположения нормальности и гомоскедастичность, состоявшихся соответственно оценивается с помощью Lillefours и Fligner испытаний; ложных открытий (FDR) коррекция была применена 12. Дифференциальная экспрессия белка между необработанных и обработанных образцов пациентов был протестирован для каждого белка использованием Стьюдента-тест, где нормальность и гомоскедастичность предположенииы были выполнены, в противном случае MWT было выполнено; FDR был применен комбинированный над значениями Т-тест и MWT 12. Значение экспрессии белка и корреляции Пирсона дисперсии для белков были оценены с использованием стандартного подхода [R ссылка] и FDR применяется 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример отсканированных слайдов RPPA можно увидеть на рисунке 4 (I) и с 680 и 800 нм каналов показано на рисунке. Разделение изображений по длине волны, рисунок 4 (II) позволяет каждой площадки на слайде RPPA должны быть проанализированы и индивидуальных экспрессии белка определяется рисунке 4 (III). Как видно на рисунке 4 (III) выражение индивидуальных белков через образцов является уникальным с Gelsolin имеющих высокий уровень экспрессии по слайду по сравнению с CMYC которая имеет значительно более низкую экспрессию белка, но все же универсально выразил во всех образцах испытания. В отличие от CD10 дал выражение переменной, с некоторыми образцами дает высокий уровень экспрессии несмотря на другие образцы, имеющие мало или совсем не обнаруживается выражение. Наконец pJAK2 не дали заметного экспрессии белка выше фонового уровня. С точки зрения контроля качества результатов pJAK2 было бы неприемлемо в то время как уCD10 была бы приемлема из-за обнаруженного белка уровни экспрессии ряда образцов на слайде. Рисунке 5 показано, свидетельствует об отсутствии перекрестной реактивности между вторичными антителами и первичных антител другого вида. Пример Supercurve используется для расчета образца через отдельный слайд можно увидеть на рисунке 6. Эти кривые используются для получения относительных данных на основе белка выражение, как показано на рисунке 7 (переменного тока). Рис. 7а показаны уровни экспрессии белка представителем всех трех слайдах RPPA будет показано, как RPPA может обнаружить различия между обработанной и необработанной образцов. Рис. 7б фокусируется по дифференциальной экспрессии белка уровней после образцы рис. 7а были сгруппированы по лечению, с более высокой экспрессии белка был найден, чтобы быть в предварительной обработке. рис. 7, фокусируется на более высоком внутриопухолевыедисперсии на пост образцы лечение после образцы были сгруппированы по лечению, с более высокой дисперсии были найдены в образцах сообщение лечения.
На рисунке 1а. Образец ткани карту предварительной обработки тканей с соответствующими H & E окрашивания замороженных срезов
Рисунок 1б. Образец ткани карту сообщению ткани лечения с соответствующими H & E окрашивания замороженных срезов
Рисунок 2. Настройка для анализа Bradford для определения протеина, яncluding калибровочной кривой, результаты матчей и 96 также формат пластины. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Примеры подходящих и неподходящих первичных антител для использования с RPPA
Рисунок 4. Технологическая схема процесса сканирования RPPA. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6а. Установка сетки в местах, RPPA слайдов. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6b. Пример SuperCurve, который используется для сравнительного анализа всех образцов на слайде RPPA. Зеленые пятна представляют собой "принятьв состоянии "пятнами и красными представляют« выбросы »на основе заданных пределов в анализе программного обеспечения.
Рисунок 6с. Пример воспроизводимость заметил образцов, пример, показанный включает в трех экземплярах пятна на 5 разведений одного образца в дополнение к пустым.
Рисунок 7а. Типичные RPPA Данные для белка (MLH1), по сравнению через несколько слайдов. Каждый образец соответствует опухоли субрегионе.
На рисунке 7б. DIFFERENTIАль экспрессии белка для MLH1 для пре-и пост образцы лечение.
Рисунок 7в. Разница в MLH1 выражение между до и после образца лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод RPPA представленные здесь представляет собой высококачественную альтернативу пропускной способности широко используется, но сравнительно низкой пропускной западной техники блот-анализа белка. Метод позволяет сотни образцов, чтобы быть полуколичественным анализируются и сравниваются одновременно позволяет прямое сравнение ключевых белков в широком выборе клеточных линий и тканей. Мультиплексирование с различными видами антитело дополнительно увеличивает мощность методика, позволяющая нескольким антитела, которые будут использоваться одновременно. Например, представленные здесь подчеркивается способность RPPA в исследовании опухоли неоднородности и влияния таргетной терапии на неоднородность.
В технике RPPA имеет ряд важных шагов которой антитела выбор имеет первостепенное значение. В связи с характером дот-блот специфичности антитела техника не может быть подтверждено в ходе анализа и должна быть установлена до использования. В текущем исследовании 83 антитела были признаны действительнымиated на западном пятна, из которых только 58 прошли (сбой скоростью ~ 30%). Из этих 58, 55 антител дали приемлемые результаты, когда анализы на RPPA (95% успеха). Другие важные шаги включают в себя выбор концентрации точечных проб на RPPA слайдов, а также равномерность кровянистые выделения. Более высокая концентрация даст более чувствительны результаты, но может привести к уменьшению числа образцов, заметил в связи с недостаточным белок присутствует. Минимальное количество ткани, которая будет обеспечивать достаточную белка для RPPA кровянистые выделения является зависимой опухолью. Для РСС минимум 50 мг была использована что позволило несколько подразделы опухоли, чтобы быть анализов в то же время поддерживать кровянистые выделения концентрации 1 мг / мл. Однородность кровянистые выделения также является ключевым как анализ предполагает, что все образцы заметил в одной концентрации, хотя это можно проверить с помощью общего белка антител после слайда кровянистые выделения. Окончательного рассмотрения является использование контрольного образца, которые будут использоваться, когда образцы номера настолько высоки, чтоони не могут быть выставлены на одном слайде, как это было в примерах. В примере используется здесь мы включили белки от почечной клеточной линии, а также от HUVEC клеточной линии в качестве контроля. Использование клеточных белков линия позволяет большое количество белков должны быть извлечены и использованы для нескольких слайдов. Контроль компенсирует любые погрешности из-за кровянистые выделения или антитела инкубации и компенсирует отклонения, обусловленные различными пользователями и слайдов используется в разные дни.
RPPA как метод является гибким в отношении количества проб, которые будут использоваться. Примеры, представленные здесь использованы ~ 300 образцов из 45 образцов опухолей, которые были распространены в течение трех слайдов, с 2 площадки на каждом слайде. Кроме того нынешнем формате могла бы были замечены на одном слайде с 1 площадки. В таком формате могут быть приспособлены к индивидуальным потребностям экспериментов, тем больше площадок на слайде больше антител, могут быть использованы одновременно, но ограничить количество образцовПлес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа авторов FCO, DF, JN, DJH и GDS упомянутых выше финансируется за счет главного офиса ученый, номер гранта: ETM37 и при поддержке Cancer Research UK экспериментальный центр медицины Рак. Работа AL финансируется за счет Королевского колледжа хирургов в Эдинбурге Robertson Trust, Мелвилл целевой для ухода и лечения рака и Совет по медицинским исследованиям. IO при поддержке Королевского общества Эдинбурга стипендий Правительства шотландского cofunded Мари Кюри действия и Великобритании Medical Research Council. Авторы хотели бы поблагодарить SCOTRRCC со-заявителей и сотрудников за полезные обсуждения на некоторые из тем, обсуждаемых в данной статье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
