Summary
RPPA تمكن من التعبير البروتين مئات العينات، وطبع على الشرائح النيتروسليلوز لاستجوابه في وقت واحد، وذلك باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى. وقد تم تطبيق هذه التقنية لدراسة تأثير عدم التجانس العلاج من تعاطي المخدرات داخل الخلايا الكلوية سرطان واضحة.
Abstract
حاليا لا يوجد علاج العلاجية لسرطان الخلايا المتنقل الخلايا الكلوية واضحة، أشيع البديل من هذا المرض. ويعتقد أن العامل الرئيسي في هذه المقاومة العلاج ليكون التعقيد الجزيئي للمرض 1. وقد تم استخدام العلاج الموجه مثل مثبط التيروزين كيناز (TKI)-sunitinib، ولكن فقط 40٪ من المرضى سوف تستجيب، والغالبية العظمى من هؤلاء المرضى الانتكاس بعد 1 2 سنة. على هذا النحو مسألة المقاومة الذاتية والمكتسبة في مرضى السرطان الكلوي الخليوي هي وثيقة الصلة 3.
من أجل دراسة مقاومة TKIs، مع الهدف النهائي المتمثل في تطوير فعالية وعلاجات شخصية، مطلوب الأنسجة متتابعة بعد فترة محددة من العلاج المستهدف، وهو نهج قد أثبتت نجاحها في 4 سرطان الدم النخاعي المزمن. لكن معقد تطبيق مثل هذه الاستراتيجية في سرطان الخلايا الكلوية من مستوى عال من بعدم التجانس بين أوراسكوم تليكوم القابضة وintratumoral، الذي هو سمة من سمات سرطان الخلايا الكلوية 5،6 وكذلك الأورام الصلبة الأخرى 7. راسخة عدم التجانس Intertumoral بسبب الخلافات transcriptomic والجينية حتى في المرضى الذين يعانون من عرض مماثل، ومرحلة الصف من الورم. وبالإضافة إلى ذلك فإنه من الواضح أن هناك شيء عظيم المورفولوجية (intratumoral) عدم التجانس في RCC، التي من المرجح أن تمثل عدم التجانس الجزيئية أكبر. رسم خرائط تفصيلية وتصنيف الأورام من قبل مجلس قيادة الثورة التحليل الصرفي والدرجات المجمعة فورمان يسمح للاختيار المناطق ممثل للتحليل البروتين.
تحليل البروتين على أساس من RCC 8 هو جذابة نظرا لتوفر على نطاق واسع في مختبرات علم الأمراض، إلا أن تطبيقها يمكن أن يكون مشكلة بسبب محدودية توافر الأجسام المضادة المحددة 9. ونظرا لطبيعة طخة نقطة صالحة للبروتين عكس المرحلة (RPPA)، والنوعية الأجسام المضادة يجب أن به قبل التحقق من صحة، على هذا النحو رقابة صارمة على الجودة من الأجسام المضادة المستخدمة هي ذات أهمية قصوى. على الرغم من هذا القيد الشكل طخة نقطة لا تسمح التصغير الفحص، مما يسمح لطباعة مئات العينات على شريحة واحدة النيتروسليلوز. ويمكن بعد ذلك يتم تحليل الشرائح المطبوعة بطريقة مماثلة لتحليل الغربية مع استخدام الأجسام المضادة المحددة الهدف الرئيسي والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى، والسماح لمضاعفة. ويمكن بعد ذلك الفرق التعبير البروتين في عينات جميع على شريحة يتم تحليلها في وقت واحد من خلال مقارنة المستوى النسبي للمضان بطريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية.
Protocol
1. تحديد عدم التجانس ورم المورفولوجية والجزيئية
- الأورام إزالتها من الفريزر -80 درجة مئوية ويحرص على الثلج الجاف.
- تقسيم أورام في أجزاء من حوالي 1 سم 3. خريطة الموقع الأصلي للورم كل قسم بالنسبة لبعضها البعض والتسمية مع اسم فريد. عينات متجر في cryovials الفردية في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
- معطف العينات في أكتوبر وقطع في ناظم البرد -22 ° C. في
- ملطخة العينات باستخدام أسلوب hematoxylin و eosin counterstaining.
- تحليل المجهري لمقاطع المجمدة للتأكد من أنها ذات طبيعة ccRCC، ورم قابلة للحياة والدرجات (الدرجة المنخفضة، وارتفاع درجة أو مختلطة منخفض / عالي الجودة، مما يشكل تحديا للتمييز الدرجات فورمان 1 إلى 4 على القسم المجمدة). الشكل 1 أ و ب (H & E تلطيخ عالية الدرجة المنخفضة والمختلط).
- اختيار ما يصل إلى 4 عينات من كل منطقة مختلفة شكليا داخل كل ورم لاستخراج البروتين.
2. استخراج البروتين من عينات الأورام
- قطع عينة الورم من أكتوبر
- مكان 50-75 ملغ من الأنسجة إلى 2 مل أنابيب مع 990 ميكرولتر من العازلة تحلل [50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 5 ملي EGTA (الرقم الهيدروجيني 8.5)، 150 مم كلوريد الصوديوم] تستكمل مع أبروتينين (سيغما A6279) (10 ملغ / مل)، الفوسفاتيز كوكتيل المانع 2 (سيغما، P5716)، الفوسفاتيز كوكتيل المانع 3 (سيغما، P0044) وكوكتيل مثبط البروتياز (روش، 11836153001).
- إضافة واحد الصلب الكرة مم 5 لكل أنبوب والتجانس في 50HZ لمدة 5 دقائق باستخدام مرتين في TissueLyser، والتحقق من مستوى التجانس بعد كل فترة 5 دقائق.
- نقل إلى أنبوب عينة متجانسة جديدة مل 2 باستخدام ماصة ترك الكرة وراء الصلب.
- إضافة 10 ميكرولتر من تريتون X-100 إلى كل عينة قبل الطرد المركزي في 13000 XG لمدة 30 دقيقة في C. ° 4
- نقل supernatants لأنابيب microcentrifuge الطازجة.
- تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA (الشكل 2).
- تركيزات البروتين في تطبيع 1 ملغ / مل.
3. التحقق من صحة الأجسام المضادة
- إعداد عينات البروتين (المستخرج من خطوط الخلايا أو الأنسجة المناسبة) لطخة غربية وتعمل على هلام SDS-PAGE 10٪.
- نقل العينات إلى غشاء النيتروسليلوز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- منع الغشاء في المخزن المؤقت أوديسي ليثيوم كو حظر (50:50 المخفف في PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تخفيف الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت أوديسي ليثيوم كو حظر (50:50 المخفف في PBS) في مصنعين أوصت التخفيف عادة 1 في 1،000.
- احتضان الغشاء في ليلة وضحاها في الأجسام المضادة الأولية C. ° 4
- تشكل 0.1٪ PBS-Tween20 (PBS-T؛ 1 مل Tween20 / 1L PBS).
- يغسل الغشاء في PBS-T في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (X3).
- تمييع fluorescently-صفت الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت أوديسي حظر (50:50 المخفف في PBS) 0.01٪ SDS 1:10،000 في تخفيف (1.5 μl/15 مل).
- احتضان الغشاء في الثانويةالأجسام المضادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز لطيف - من المهم لحماية الغشاء من الضوء حتى يحين الوقت الذي فقد مسحها ضوئيا في نهاية المطاف.
- يغسل الغشاء في PBS-T في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (X3)، والحفاظ على الأغشية في الظلام.
- يغسل الغشاء في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (X3) لإزالة Tween20 المتبقية، وحفظ الغشاء مرة أخرى في الظلام.
- تكمن غشاء مسطح على قطعة من ورق الترشيح في الظلام، والسماح للهواء الجاف - السماح ليجف الغشاء قد يعزز إشارة والحد من الخلفية ولكن جعله عديم الفائدة للتجريد وإعادة التحقيق.
- مسح الغشاء على الماسح الضوئي أوديسي LiCor. الحفاظ على غشاء في الظلام حتى يحين الوقت الذي تم فحصه.
- فقط تحديد الأجسام المضادة التي تولد فرقة واحدة في الغالب الوزن الجزيئي الصحيح. ويبين الشكل 3 أمثلة على الأجسام المضادة المقبول وغير المقبول للاستخدام مع RPPA.
4. RPPA الحزب الثوري المؤسسيnting
- تم رصد لست] البروتين على الشرائح الزجاجية النيتروسليلوز المغلفة (Fastslides-WHATMAN) باستخدام II MicroGrid الروبوتية نصاب. الشرائح المستخدمة الواردة على 2 منصات التي رصدت العينات. شوهد كل لوحة مع عينات مماثلة، في هذه الحالة 100 عينة. الأشكال الأخرى المتاحة تشمل 1 و 8 و الشرائح لوحة 16. ارتفاع عدد منصات أصغر عدد العينات التي يمكن رصدها على كل.
- وقدم سلسلة من التخفيفات 2-أضعاف خمسة من كل عينة وشوهد بعد ذلك في ثلاث نسخ كل (مما أدى إلى ما مجموعه 15 نقاط لكل عينة).
5. RPPA البروتين الكشف
- الشرائح العازلة الرطب في LiCor الزائدة حظر (50:50 المخفف في PBS). احتضان RT في ل1 ساعة على منصة هزاز.
- إعداد 800 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت LiCor حظر (50:50 المخفف في PBS) في تركيزات المطلوب والحفاظ على الجليد.
- تحميل الشرائح في إما (ط) كليب إطار شريحة واحدةأو (ب) من 'FastFrame' الشريحة الخليج 4 حامل بحيث يتم تشكيل ختم ضيق بين الشريحة وغرفة الحضانة.
- إزالة العازلة المتبقية من الآبار والأجسام المضادة الأولية اضافة 600 ميكرولتر من الآبار الخاصة.
- ضع الشريحة في مربع وغرفة رطبة مختومة واحتضان بين عشية وضحاها على منصة هزاز عند 4 ° C.
- تشكل 0.1٪ PBS-Tween20 (PBS-T و 100 ميكرولتر توين 20/100 مل PBS).
- إزالة الشرائح من غرفة باردة وإزالة الأجسام المضادة الأولية بعناية من كل بئر.
- اضافة 600 ميكرولتر من PBS-T وغسل الشرائح على منصة هزاز في RT لمدة 5 دقائق (X3).
- إعداد fluorescently-صفت الأجسام المضادة الثانوية من تمييع في المخزن المؤقت أوديسي حظر (50:50 المخفف في PBS) 0.01٪ SDS في التخفيف 1:2،000 (1 ميكرولتر / 2 مل) في المقام الأول.
- إزالة العازلة من الآبار واضافة 600 ميكرولتر الأجسام المضادة الثانوية fluorescently-المسمى إلى الآبار الخاصة. احتضان الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز لطيف - انهمن المهم لحماية الغشاء من الضوء حتى يحين الوقت الذي فقد مسحها ضوئيا في نهاية المطاف.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية من يغسل جيدا لفترة وجيزة (X3) في 600 ميكرولتر PBS-T في درجة حرارة الغرفة. إزالة الشريحة من الناقل، ونقل إلى وعاء مناسب وغسل ما يزيد PBS-T لمدة 15 دقيقة، والحفاظ على الأغشية في الظلام.
- إزالة PBS-T وكذلك الغشاء غسيل مع PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لإزالة بقايا توين-20، مع الغشاء مرة أخرى في الظلام.
- تجفيف Fastslide في 50 ° C الفرن لمدة 10 دقيقة ثم مسح على الماسح الضوئي أوديسي ليثيوم تبليغ الوثائق. إبقاء الشريحة في الظلام حتى يتم فحصه.
- مسح الشريحة بحوالي 680 نانومتر نانومتر و/ أو 800 اعتمادا على الأجسام المضادة الثانوية / الأجسام المضادة المستخدمة. لاللونين الكشف دائما استخدام للغاية عبر الأجسام المضادة الثانوية كثف لتقليل تفاعل الصليب. الاختيار الدقيق للأجسام مضادة الابتدائية والثانوية أمر ضروري لكشف اللونين. من الأهمية بمكان هو اختيارالأنواع المضيفة مختلفة (على سبيل المثال الأرانب والماوس) لأجسام مضادة الأساسيان. هذا التمييز من قبل الأجسام المضادة يسمح الثانوية المضادة للأرنب ومكافحة الفأر التي وصفت مع صبغ مع أطياف الانبعاثات تمييزها بسهولة.
- يتم حفظ ملفات الصور وملفات TIFF. الشكل 4 (صورة من الملفات الممسوحة ضوئيا).
6. تحليل البيانات
- إطلاق البرنامج MicroVigene (VigeneTech، كارلايل، MA، الولايات المتحدة الأمريكية).
- فتح. TIFF ملف الصورة الذي يحتوي على فحص الشريحة RPPA.
- حدد ملف قالب محدد مسبقا والتي سيكون لها الشبكة لتراكب على الصورة من الشريحة RPPA.
- انقر فوق الزر تحديد مناطق (ROI) فوائد، لإظهار الشبكة.
- وضع الشبكة على البقع RPPA. الشكل 6A (صورة الشبكة على الصورة).
- انقر فوق الزر تحديد الكل لتسليط الضوء على كل ROI.
- انقر فوق البحث عن جميع. سوف MicroVigene AUTOMالعثور على atically ROI، والعثور على بقع، طرح الخلفية، إزالة أي غبار وتحديد المواقع.
- انقر فوق منحنى التخفيف الزر عرض لإظهار النتائج لجميع العينات على الشريحة RPPA.
- انقر فوق حفظ البيانات التخفيف.
- كما يتم طباعة كل عينة عبر نقاط 5 لكل والتخفيف من ثلاث نسخ هناك 15 نقطة لتحليل، مما يقلل من احتمال حدوث أخطاء وتحسين نوعية منحنى المناسب. MicroVigene تنتج 4-المعلمة اللوجستية، سجل طراز "Supercurve" خوارزمية (الشكل 6B)، الذي يشتمل على جميع المواقع لإنتاج منحنى السيني من مستضد الضد حركية ملزمة. الافتراض هو أن الأجسام المضادة نفس المستضد حركية ملزمة تجري في كل بقعة العينة، حتى في عينات مختلفة، وبالتالي من خلال اتخاذ جميع البقع على مجموعة لتناسب منحنى استجابة مشتركة يمكن أن تزيد من ثقة منحنى المناسب 10،11
Y = A + ((BA) / (1 + E (ج * د-LN (X)))
حيث x هو dilutioن عامل وY هو كثافة الإشارة.
يمكن العينات التي تم تحليلها نسبيا باستخدام قيمة Y0، والتي في تحليلنا مساويا لقيمة Y في منتصف قيم س رسم الخرائط بعد تلك على وsupercurve. - تصدير البيانات في Microsoft Excel ومؤامرة Y0 كما في الشكل 7.
- تم حساب الفرق Intratumoral البروتين بشكل منفصل عن المعالجة غير المعالجة والمرضى الذين عولجوا في إطار ANOVA. وتمت مقارنة توزيع الفرق الجمع بين البيانات من جميع البروتينات من خلال اختبار تحليل مان ويتني (MWT). وتمت مقارنة الفروق الفردية Intratumoral لبروتينات من قبل تجارب F حيث الافتراضات الحياة الطبيعية ومتماثل التفاوت عقدت على التوالي تقييمهم باستخدام Lillefours والاختبارات Fligner؛ كاذبة معدل اكتشاف (FDR) تم تطبيق التصحيح 12. تم اختبار الفرق بين البروتين التعبير عينات المرضى دون علاج والمعالجة لكل طالب باستخدام بروتين تي الاختبار حيث طبيعتها وافتراض متماثل التفاوتوالتقى ثانية، وإلا تم تنفيذ MWT؛ تم تطبيق FDR على القيم ر الاختبار وMWT مجتمعة 12. وقدرت أهمية التعبير البروتين والفرق ارتباط بيرسون للبروتينات باستخدام نهج القياسية [R مرجع] وFDR تطبيق 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن رؤية مثال على شريحة RPPA الممسوحة ضوئيا في الشكل 4 (ط) مع كل من 680 و 800 نانومتر القنوات مبين. فصل الصور عن طريق الطول الموجي، الشكل 4 (الثاني) تمكن كل لوحة على الشريحة RPPA لتحليلها وتحديد بروتين تعبير الفرد الشكل 4 (ثالثا). كما يمكن أن يرى في الشكل 4 (ثالثا) التعبير عن البروتينات الفردية عبر عينات فريدة من نوعها مع وجود Gelsolin على مستوى عال من التعبير عبر الشريحة مقابل cMYC التي لديها أقل بكثير من البروتين التعبير، ولكن لا يزال أعرب عالميا عبر جميع العينات اختبارها. في المقابل أعطى CD10 التعبير المتغير، مع إعطاء بعض العينات على مستوى عال من التعبير على الرغم من وجود عينات أخرى التعبير ضئيلة أو معدومة للكشف. فشل pJAK2 أخيرا لإنتاج أي تعبير البروتين للكشف عن سطح الخلفية. من منظور الجودة والتحكم في نتائج pJAK2 غير مقبول في حين أن منوCD10 يكون مقبولا نظرا لمستويات البروتين التعبير الكشف عن عدد من العينات على شريحة ويبين الشكل 5 يسلط الضوء على عدم وجود تفاعل بين الأجسام المضادة عبر الثانوية والأجسام المضادة الأولية من نوع آخر. ويمكن رؤية مثال على Supercurve المستخدمة لحساب العينات عبر الشريحة الفردية في الشكل 6. وتستخدم هذه المنحنيات النسبية لإنتاج البروتين التعبير المستندة إلى البيانات كما هو الحال في الشكل 7 (AC). 7A يوضح الشكل مستويات التعبير عن بروتين ممثل عبر الشرائح RPPA 3 تسليط الضوء على كيفية RPPA يمكن الكشف عن الاختلافات بين العينات المعالجة وغير المعالجة. 7B الشكل يركز على مستويات بروتين تعبير الفرق بعد أن تم تجميع عينات من 7A الشكل يعتمد على العلاج، مع التعبير البروتين العالي التي وجدت لتكون في المعالجة. الشكل 7C يركز على أعلى intratumoralالفرق للعينات بعد العلاج بعد أن تم تجميع عينات على أساس المعاملة، مع ارتفاع التباين كونها وجدت في العينات بعد العلاج.
الرقم 1A خريطة العينة. الأنسجة من النسيج العلاج قبل مع H & E تلطيخ المرتبطة بها أقسام المجمدة
1B الرقم خريطة العينة. الأنسجة من الأنسجة بعد العلاج مع H & E تلطيخ المرتبطة بها أقسام المجمدة
الشكل 2. إعداد مقايسة لبرادفورد لتحديد البروتين، وأناالتسبب منحنى المعايرة، ونتائج الجدول و 96 لوحة جيدا الشكل. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. مثال على الأجسام المضادة الأولية مناسبة وغير صالحة للاستخدام مع RPPA
الشكل 4. رسما تخطيطيا لعملية المسح RPPA. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
6A الرقم. تركيب الشبكة على البقع الشريحة RPPA. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الرقم 6B. مثال SuperCurve الذي يستخدم لتحليل مقارن لجميع العينات على الشريحة RPPA. البقع الخضراء تمثل "قبولقادرة "النقاط الحمراء وتمثل" القيم المتطرفة "على أساس حدود المعرفة مسبقا في برنامج التحليل.
6C الرقم. مثال للاستنساخ من العينات رصدت سبيل المثال، أظهرت يتضمن ثلاث نسخ من البقع التخفيفات 5 من عينة واحدة بالإضافة إلى فارغة.
7A الرقم. RPPA النموذجية بيانات لبروتين (MLH1)، مقارنة عبر عدة شرائح. كل عينة يتوافق مع منطقة شبه الورم.
7B الرقم. التفاضليةآل التعبير عن البروتين MLH1 لعينات ما قبل وبعد العلاج.
الرقم 7C. الفرق في التعبير بين MLH1 عينات قبل وبعد العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة RPPA المقدمة هنا يمثل بديلا إنتاجية عالية لأسلوب الإنتاجية لطخة غربية تستخدم على نطاق واسع ولكن منخفضة نسبيا للتحليل البروتين. الأسلوب يسمح مئات العينات لتكون شبه كمي تحليل ومقارنة السماح في نفس الوقت للمقارنة المباشرة من البروتينات الرئيسية في مجموعة واسعة من خطوط الخلايا وعينات الأنسجة. مضاعفة مع الأنواع المختلفة الأجسام المضادة يزيد من قوة هذه التقنية السماح باستخدام أجسام مضادة متعددة في نفس الوقت. المثال المعروض هنا يبرز قدرة RPPA في دراسة التباين الورم وتأثير العلاج على استهداف عدم التجانس.
كأسلوب RPPA لديها عدد من الخطوات الحاسمة لاختيار الأجسام المضادة هو الهدف الأسمى. لا يمكن نظرا لطبيعة طخة نقطة من تقنية الأجسام المضادة تأكيد خصوصية خلال التحليل ويجب أن يكون التحقق قبل استخدامها. وفي الدراسة الحالية بنسبة 83 الأجسام المضادة صالحةated على البقع الغربية منها 58 فقط مرت (تفشل معدل 30٪ ~). هذه 58، 55 قدم الأجسام المضادة نتائج مقبولة عند التحليلات على RPPA (95٪ نسبة النجاح). خطوات حاسمة أخرى تشمل اختيار تركيز على الفور على عينات RPPA الشرائح وكذلك توحيد بقع دم. وهناك تركيز أعلى تعطي نتائج أكثر حساسية ولكن قد يؤدي إلى عدد أقل من العينات التي رصدت بسبب عدم كفاية البروتين حاضر. الحد الأدنى من الأنسجة التي سوف توفر البروتين كافية لاكتشاف RPPA هو ورم التابعة. لRCC تم استخدام ما لا يقل عن 50 ملغم التي سمحت الأقسام الفرعية المتعددة للورم أن تكون تحليلات في حين لا تزال تحتفظ تركيز اكتشاف من 1 ملغ / مل. توحيد اكتشاف هو أيضا المفتاح كما يفترض أن يتم تحليل جميع العينات رصدت بتركيز واحد، بالرغم من أنه يمكن التحقق من ذلك باستخدام الأجسام المضادة البروتين الكلي بعد اكتشاف الشريحة. النظر النهائي هو استخدام عينة التحكم ليتم استخدامها عند عينات أرقام مرتفعة بحيثلا يمكن رصدها على شريحة واحدة كما كان الحال في الأمثلة هنا. في المثال المستخدم هنا أدخلنا البروتين من خط الخلايا الكلوية وكذلك من خط الخلية HUVEC والضوابط. استخدام البروتين خط الخلية يسمح باستخراج كميات كبيرة من البروتينات وتستخدم لعدة شرائح. سيطرة يعوض عن أي خطأ جوهري بسبب اكتشاف الأجسام المضادة أو حضانات ويعوض عن الانحرافات بسبب مختلف المستخدمين والشرائح المستخدمة في أيام مختلفة.
RPPA كأسلوب يتسم بالمرونة فيما يتعلق عدد العينات التي سيتم استخدامها. قدم أمثلة المستخدمة هنا ~ 300 عينات من 45 عينة الورم الذي تم موزعة على ثلاث شرائح، مع 2 منصات على كل شريحة. وبدلا من ذلك يمكن أن يكون تم التنسيق الحالي رصدت على شريحة واحدة مع 1 وسادة. كما يمكن تكييف هذه الصيغة على الاحتياجات الفردية للتجارب، يمكن استخدام أكثر منصات على شريحة وأكثر الأجسام المضادة في وقت واحد ولكن الحد من عدد سامبليس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يذكر المصنف من المؤلفين وزارة الخارجية، DF، JN، DJH وGDS أعلاه يتم تمويله من قبل مكتب كبير العلماء، ومنحة رقم: ETM37 وبدعم من معهد أبحاث السرطان في المملكة المتحدة مركز الطب التجريبي للسرطان. ويتم تمويل عمل AL من قبل الكلية الملكية للجراحين في ادنبره روبرتسون الاستئماني، صندوق ميلفيل لرعاية وعلاج من السرطان ومجلس البحوث الطبية. ويدعم IO من قبل الجمعية الملكية للزمالة ادنبره الاسكتلندية cofunded الحكومة باتخاذ إجراءات ماري كوري والطبية UK مجلس البحوث. فإن الكتاب أود أن أشكر SCOTRRCC شارك في المتقدمين والمتعاونين لمناقشاتهم المفيدة حول بعض الموضوعات التي تمت مناقشتها في هذه الورقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
