Summary
RPPA नमूने के सैकड़ों, nitrocellulose स्लाइड पर मुद्रित करने के लिए एक साथ पूछताछ की, fluorescently लेबल एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए सक्षम बनाता है. इस तकनीक स्पष्ट सेल गुर्दे कार्सिनोमा के भीतर दवा उपचार विविधता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है.
Protocol
1. Morphological और आण्विक ट्यूमर विविधता के पहचान
- ट्यूमर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटा दिया है और सूखी बर्फ पर रखा.
- लगभग 1 3 सेमी के वर्गों में ट्यूमर विभाजित करते हैं. हर ट्यूमर एक दूसरे के रिश्तेदार अनुभाग और एक अद्वितीय नाम के साथ लेबल की मूल स्थिति मानचित्र. -80 पर व्यक्तिगत cryovials में स्टोर के नमूने ° C उपयोग के लिए तैयार है जब तक.
- अक्टूबर में और कोट -22 डिग्री सेल्सियस में एक cryostat में कटौती के नमूने
- नमूने Hematoxylin और लाल भामसान रंग counterstaining विधि का उपयोग दाग.
- जमे हुए वर्गों के माइक्रोस्कोपी विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए करने के लिए वे ccRCC प्रकृति, व्यवहार्य ट्यूमर ग्रेडिंग (कम ग्रेड, उच्च ग्रेड या मिश्रित ग्रेड कम / उच्च, के लिए Fuhrman ग्रेड जमे हुए खंड पर 1 से 4 अंतर को चुनौती) के लिए और के हैं. चित्रा 1 एक और ख (धुंधला हो जाना और एच ई उच्च कम और मिश्रित ग्रेड).
- 4 के नमूने के morphologically भिन्न प्रोटीन निकासी के लिए प्रत्येक ट्यूमर के भीतर प्रत्येक क्षेत्र से चुनें.
2. ट्यूमर के नमूनों से प्रोटीन निष्कर्षण
- अक्टूबर से ट्यूमर नमूना काटें.
- प्लेस ऊतक के 2 मिलीलीटर ट्यूब में 50-75 मिलीग्राम lysis बफर के 990 μl के साथ [50 मिमी Tris एचसीएल (7.5 पीएच), 5 मिमी EGTA (8.5 पीएच), 150 मिमी NaCl] (A6279 सिग्मा) aprotinin (10 मिलीग्राम के साथ पूरक / मिलीलीटर), फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल 2 (सिग्मा, P5716), फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल 3 (सिग्मा P0044) और एक protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल (Roche, 11836153001).
- प्रत्येक ट्यूब के लिए एक भी 5 मिमी स्टील की गेंद जोड़ें और 5 मिनट के लिए दो बार एक TissueLyser का उपयोग करते हुए, हर 5 मिनट की अवधि के बाद homogenization के स्तर की जाँच 50Hz में homogenize.
- नई 2 मिलीलीटर ट्यूब विंदुक स्टील की गेंद को पीछे छोड़ने का उपयोग homogenized नमूना स्थानांतरण.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 13,000 XG पर centrifuging से पहले प्रत्येक नमूने में ट्राइटन X-100 के 10 μl जोड़ें
- ताजा microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण supernatants.
- प्रोटीन बीसीए परख (चित्रा 2) का उपयोग करते हुए एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
- 1 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन सांद्रता सामान्यकरें.
3. एंटीबॉडी मान्यकरण
- वेस्टर्न ब्लॉट के लिए प्रोटीन के नमूने (उपयुक्त सेल लाइनों या ऊतकों से निकाली) तैयार है और एक 10% जेल एसडीएस पृष्ठ पर चलाते हैं.
- Nitrocellulose झिल्ली पर नमूने 4 में रातोंरात स्थानांतरण ° सी.
- ली कोर ओडिसी अवरुद्ध बफर (पीबीएस में 50:50 पतला) में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए झिल्ली ब्लॉक.
- निर्माताओं में ली कोर ओडिसी अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी (पीबीएस में पतला 50:50) पतला कमजोर पड़ने आम तौर पर 1000 में 1 की सिफारिश की.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक रातोंरात एंटीबॉडी में झिल्ली सेते
- 0.1% पीबीएस Tween20 (, 1 मिलीग्राम / 1L Tween20 PBS पीबीएस-टी).
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट (x3) के लिए पीबीएस - टी में झिल्ली धो लें.
- जलमिश्रित ओडिसी अवरुद्ध बफर (पीबीएस में 50:50 पतला) 0.01% 1:10,000 कमजोर पड़ने पर एसडीएस (1.5 μl/15 मिलीलीटर) में माध्यमिक एंटीबॉडी fluorescently लेबल.
- माध्यमिक में झिल्ली सेतेकोमल झटकों के साथ 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एंटीबॉडी यह महत्वपूर्ण है कि ऐसे समय जब तक प्रकाश से झिल्ली की रक्षा के रूप में यह अंत में स्कैन किया गया.
- कमरे के तापमान पर 5 (x3) मिनट, अंधेरे में झिल्ली रखने के लिए पीबीएस - टी में झिल्ली धो लें.
- कमरे के तापमान पर 5 (x3) मिनट अवशिष्ट Tween20 को दूर करने, फिर अंधेरे में झिल्ली रखने के लिए पीबीएस में झिल्ली धो लें.
- झिल्ली अंधेरे में फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर फ्लैट झूठ और शुष्क हवा की अनुमति - अनुमति के लिए सूखी झिल्ली संकेत को बढ़ाने और पृष्ठभूमि को कम सकता है, लेकिन यह अलग करना और फिर से जांच कर रही करने के लिए प्रस्तुत करना बेकार है.
- Licor ओडिसी स्कैनर पर स्कैन झिल्ली. ऐसे समय जब तक अंधेरे में झिल्ली के रूप में यह स्कैन किया गया है रखें.
- केवल एंटीबॉडी कि सही आणविक वजन में एक एकल प्रमुख बैंड उत्पन्न चित्रा 3 का चयन करें. RPPA साथ उपयोग के लिए स्वीकार्य और अस्वीकार्य एंटीबॉडी का उदाहरण दिखाता है.
4. RPPA पंचायती राजnting
- प्रोटीन lysates nitrocellulose - में लेपित गिलास (Fastslides वाटमान) स्लाइड्स एक microgrid द्वितीय रोबोट टोहिया का उपयोग करने पर देखा गया था. स्लाइड्स का इस्तेमाल 2 पैड पर जो नमूने देखा गया निहित. प्रत्येक पैड समान नमूनों के साथ देखा गया था, इस मामले में 100 नमूनों में. अन्य उपलब्ध स्वरूप, 8 1 और 16 पैड स्लाइड्स शामिल हैं. उच्च पैड की संख्या छोटे नमूनों की संख्या है जो प्रत्येक पर देखा जा सकता है.
- पाँच 2 गुना dilutions की एक श्रृंखला के प्रत्येक नमूने से किए गए थे और एक तो तीन प्रतियों में देखा गया था (नमूना प्रति 15 स्थानों की कुल में जिसके परिणामस्वरूप).
5. RPPA प्रोटीन का पता लगाने के
- अतिरिक्त licor अवरुद्ध बफर में गीले स्लाइड (पीबीएस में पतला 50:50). आर टी में एक कमाल मंच पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- Licor अवरुद्ध बफर (पीबीएस में 50:50 पतला) में वांछित सांद्रता में प्राथमिक एंटीबॉडी के 800 μl और तैयार बर्फ पर रख.
- या तो (i) एकल फ्रेम चिप क्लिप में स्लाइड माउंटया (ii) 'FastFrame' चार बे स्लाइड धारक इतना है कि एक तंग सील स्लाइड और ऊष्मायन कक्ष के बीच का गठन किया है.
- और कुओं से अवशिष्ट बफर निकालें और संबंधित कुओं 600 μl प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने.
- जगह और एक मोहरबंद गीला और मंच 4 रातोंरात कमाल पर बॉक्स सेते में स्लाइड चैम्बर डिग्री सेल्सियस
- 0.1% द्वारा PBS Tween20 (100 μl बीच 20/100 मिलीलीटर पीबीएस पीबीएस - टी).
- ठंडे कमरे से स्लाइड निकालें और ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी को दूर.
- पीबीएस - टी 600 μl जोड़ें और RT 5 मिनट (X3) के लिए मंच कमाल पर स्लाइड्स धो लो.
- ओडिसी अवरुद्ध (पीबीएस में पतला 50:50) बफर 1:2,000 कमजोर पड़ने के पहले उदाहरण में (1 μl / 2 मिलीलीटर) में 0.01% एसडीएस में कमजोर द्वारा fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार.
- बफर कुओं से निकालें और संबंधित कुओं के 600 μl fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने. यह कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी कोमल झटकों के साथ 45 मिनट के लिए सेतेऐसे समय के रूप में यह अंत में स्कैन किया गया जब तक प्रकाश से झिल्ली की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है.
- 600 μl पीबीएस टी में अच्छी तरह से और संक्षिप्त (x3) कमरे के तापमान पर धोने से माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें. वाहक से स्लाइड निकालें, एक उपयुक्त कंटेनर हस्तांतरण और 15 मिनट के लिए अतिरिक्त पीबीएस - टी में धोने, अंधेरे में झिल्ली रखने.
- पीबीएस - टी और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस के साथ आगे धोने झिल्ली निकालें अवशिष्ट Tween-20 को निकालने के लिए, फिर अंधेरे में झिल्ली रखने.
- 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस ओवन में Fastslide सूखी और फिर ओडिसी ली कोर स्कैनर पर स्कैन. अंधेरे में स्लाइड रखें जब तक यह स्कैन किया गया है.
- 680 एनएम और / या 800 एनएम माध्यमिक एंटीबॉडी / इस्तेमाल किया एंटीबॉडी पर निर्भर करता है पर स्लाइड स्कैन. दो रंग का पता लगाने के लिए हमेशा अत्यधिक पार adsorbed माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए पार जेट को कम. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन सावधानी से दो रंग का पता लगाने के लिए आवश्यक है. प्राथमिक महत्व का चयन होता हैदो प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विभिन्न मेजबान प्रजातियों (जैसे खरगोश और माउस). यह विरोधी खरगोश और विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी जो रंग के साथ आसानी से अलग पहचाना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ लेबल रहे हैं द्वारा भेदभाव की अनुमति देता है.
- छवि फ़ाइलों झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सहेज कर रहे हैं 4 चित्रा (स्कैन फ़ाइलों की छवि).
6. डेटा विश्लेषण
- MicroVigene सॉफ्टवेयर (VigeneTech, कर्लाए, एमए, यूएसए) लॉन्च.
- झगड़ा छवि RPPA स्लाइड का स्कैन युक्त फ़ाइल खोलें.
- एक पूर्वनिर्धारित टेम्पलेट फ़ाइल का चयन करें जो RPPA स्लाइड की छवि पर उपरिशायी ग्रिड होगा.
- क्लिक ब्याज बटन (आरओआई) के क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए ग्रिड लाने.
- RPPA स्थानों पर ग्रिड की स्थिति. 6a चित्रा (छवि पर ग्रिड की छवि).
- सभी का चयन सभी ROI ज़्यादा से ज़्यादा को उजागर करने के लिए बटन पर क्लिक करें.
- सभी ढूँढें क्लिक करें. MicroVigene autom जाएगाatically ROI ज़्यादा से ज़्यादा मिल जाए, स्पॉट खोजने, पृष्ठभूमि घटाना, किसी भी धूल हटाने और स्पॉट मात्रा ठहराना.
- सभी नमूनों के लिए RPPA स्लाइड पर परिणाम लाने के लिए दृश्य कमजोर पड़ने वक्र बटन पर क्लिक करें.
- मन्दन डेटा सहेजें पर क्लिक करें.
- प्रत्येक नमूना के रूप में 5 कमजोर पड़ने अंक भर में मुद्रित तीन प्रतियों में प्रत्येक 15 अंक का विश्लेषण करने के लिए है, जो त्रुटियों के जोखिम को कम कर देता है और वक्र ढाले की गुणवत्ता में सुधार कर रहे हैं. MicroVigene 4-पैरामीटर मॉडल रसद लॉग Supercurve "(चित्रा 6b) एल्गोरिथ्म, कि प्रतिजन एंटीबॉडी बंधनकारी कैनेटीक्स की एक अवग्रह वक्र उत्पादन स्पॉट शामिल पैदा करता है. धारणा यह है कि एक ही प्रतिरक्षी - प्रतिजन बाध्यकारी कैनेटीक्स प्रत्येक नमूना स्थान पर जगह ले जा रहा है, विभिन्न नमूनों में भी इस तरह के एक सरणी पर सभी स्थानों को लेने के लिए एक आम प्रतिक्रिया वक्र फिट वक्र 10,11 फिटिंग के आत्मविश्वास में वृद्धि कर सकते हैं
= एक + (बीए) (y / (1 + ई (ग * (x) d - एल.एन.))
जहाँ x dilutio हैn कारक और वाई संकेत तीव्रता है.
नमूने y0 मूल्य, जो हमारे विश्लेषण में supercurve पर उन मानचित्रण के बाद x मान के मध्य में y मूल्य corresponded का उपयोग करके तुलनात्मक विश्लेषण किया जा सकता है. - 7 चित्रा में रूप माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल और y0 साजिश में डेटा निर्यात.
- Intratumoral प्रोटीन विचरण एक एनोवा ढांचे में इलाज और इलाज इलाज के रोगियों के लिए अलग से गणना की गई. वेरिएंस सभी विश्लेषण प्रोटीन से डेटा के संयोजन वितरण मान - व्हिटनी परीक्षण (एमडब्ल्यूटी) द्वारा की तुलना में थे. झूठी खोज दर (एफडीआर) सुधार 12 लागू किया गया था, व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए intratumoral प्रसरण एक एफ परीक्षण जहां सामान्य और homoscedasticity की मान्यताओं का आयोजन किया, क्रमशः Lillefours और Fligner परीक्षण का उपयोग मूल्यांकन से तुलना की गई. विभेदकों प्रोटीन अभिव्यक्ति अनुपचारित और इलाज रोगी के नमूने के बीच प्रत्येक प्रोटीन के लिए परीक्षण किया गया था छात्र टी परीक्षण का उपयोग जहां सामान्यता और homoscedasticity धारणाएस से मुलाकात की है, अन्यथा एमडब्ल्यूटी प्रदर्शन किया गया था, एफडीआर संयुक्त टी परीक्षण और एमडब्ल्यूटी 12 मूल्यों पर लागू किया गया था. प्रोटीन और प्रोटीन के लिए विचरण Pearson सहसंबंध अभिव्यक्ति का महत्व एक मानक दृष्टिकोण का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था [आर संदर्भ] और एफडीआर 12 लागू होता है.
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Representative Results
एक स्कैन RPPA स्लाइड का एक उदाहरण दोनों 680 और 800 एनएम दिखाया चैनलों के साथ 4 चित्रा (i) में देखा जा सकता है. तरंगदैर्ध्य, 4 चित्रा (ii) छवियों को अलग RPPA विश्लेषण किया जा स्लाइड और व्यक्ति प्रोटीन चित्रा 4 (iii) निर्धारित अभिव्यक्ति पर प्रत्येक पैड के लिए सक्षम बनाता है. चित्रा 4 में देखा जा सकता है (iii) नमूनों भर में व्यक्ति प्रोटीन की अभिव्यक्ति Gelsolin स्लाइड भर cMYC जो एक बहुत कम प्रोटीन अभिव्यक्ति है अभिव्यक्ति की एक उच्च स्तर की तुलना में होने के साथ अद्वितीय है, लेकिन अभी भी सार्वभौमिक सभी नमूनों भर में व्यक्त परीक्षण किया गया. इसके विपरीत CD10 कुछ नमूने अन्य कम या कोई अभिव्यक्ति detectable होने के नमूनों के बावजूद अभिव्यक्ति की एक उच्च स्तर देने के साथ चर अभिव्यक्ति दे दी है. PJAK2 अंत पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर किसी भी detectable प्रोटीन अभिव्यक्ति का उत्पादन करने में विफल रहा है. एक गुणवत्ता नियंत्रण के नजरिए से pJAK2 के परिणामों की उन जबकि अस्वीकार्य होगाCD10 स्वीकार्य स्लाइड पर नमूनों की संख्या का पता लगाया प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की वजह से होगा. चित्रा 5 से पता चलता माध्यमिक एंटीबॉडी और अन्य प्रजातियों के प्राथमिक एंटीबॉडी के बीच पार जेट की कमी पर प्रकाश डाला गया. चित्रा 6 में एक व्यक्तिगत स्लाइड भर नमूने की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता Supercurve का एक उदाहरण देखा जा सकता है. इन घटता 7 चित्रा (एसी) में जैसे रिश्तेदार प्रोटीन आधारित अभिव्यक्ति डेटा का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है चित्रा 7a तीन RPPA हाइलाइटिंग कैसे RPPA और इलाज नमूनों के बीच अंतर का पता लगा सकते हैं स्लाइड्स के पार एक प्रतिनिधि प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर से पता चलता है. चित्रा 7b केंद्रित अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के बाद चित्रा 7a से नमूने के साथ इलाज के उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति pretreatment में होना पाया जा रहा है, के आधार पर वर्गीकृत किया गया है. 7c चित्रा उच्च intratumoral पर ध्यान केंद्रितइलाज के बाद नमूनों के बाद नमूने उपचार के आधार पर वर्गीकृत किया गया है उच्च विचरण के साथ इलाज के बाद नमूनों में पाया जा रहा है, के लिए विचरण.
चित्रा 1a ऊतक संबद्ध एच एंड ई धुंधला हो जाना जमे हुए वर्गों के साथ पूर्व उपचार ऊतक के नमूने नक्शा
चित्रा 1b ऊतक. इलाज के बाद ऊतक के संबद्ध एच एंड ई धुंधला हो जाना जमे हुए वर्गों के साथ नमूना नक्शा
चित्रा 2 ब्रैडफोर्ड परख के लिए प्रोटीन के निर्धारण के लिए सेट, मैंncluding अंशांकन वक्र, परिणाम तालिका और 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3 RPPA के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त और अनुपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के उदाहरण हैं.
चित्रा 4 RPPA स्कैनिंग प्रक्रिया का प्रवाह आरेख. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 6a. RPPA स्लाइड स्थानों पर ग्रिड फिटिंग. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 6b SuperCurve का उदाहरण है जो RPPA स्लाइड पर सभी नमूनों के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है. हरी स्पॉट "स्वीकार प्रतिनिधित्व करते हैंसक्षम विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पूर्वनिर्धारित सीमा के आधार पर "outliers" स्पॉट और लाल का प्रतिनिधित्व करते हैं. "
चित्रा 6c. देखा नमूनों की reproducibility के उदाहरण, उदाहरण दिखाया 5 रिक्त करने के लिए इसके अलावा में एक नमूना की dilutions की तीन प्रतियों स्पॉट शामिल हैं.
चित्रा 7a ठेठ RPPA एक प्रोटीन के लिए डेटा (MLH1), एकाधिक स्लाइड भर की तुलना में. प्रत्येक नमूना एक ट्यूमर उप क्षेत्र से मेल खाती है.
चित्रा 7b. Differentiअल MLH1 लिए पूर्व और बाद उपचार के नमूने के लिए प्रोटीन की अभिव्यक्ति.
पूर्व और इलाज के बाद नमूनों के बीच MLH1 अभिव्यक्ति में 7c वेरिएंस. चित्रा.
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Discussion
RPPA यहाँ प्रस्तुत पद्धति एक उच्च throughput प्रोटीन विश्लेषण के बारे में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है, लेकिन अपेक्षाकृत कम throughput वेस्टर्न ब्लॉट तकनीक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है. विधि नमूने के सैकड़ों अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण और की तुलना में एक साथ सेल लाइनों और ऊतकों के नमूनों की एक विस्तृत चयन भर में महत्वपूर्ण प्रोटीन के प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है. बहुसंकेतन अलग एंटीबॉडी प्रजातियों के साथ आगे कई एंटीबॉडी एक साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है तकनीक की शक्ति बढ़ जाती है. यहाँ प्रस्तुत उदाहरण लक्षित चिकित्सा के ट्यूमर के विविधता और विजातिता पर प्रभाव के अध्ययन में RPPA की क्षमता पर प्रकाश डाला गया है.
एक तकनीक के रूप में RPPA महत्वपूर्ण कदम है जो एंटीबॉडी चयन सर्वोपरि है की एक संख्या है. डॉट धब्बा तकनीक एंटीबॉडी विशिष्टता की प्रकृति के कारण विश्लेषण के दौरान पुष्टि नहीं की और पहले का पता लगाया उपयोग करने के लिए होना चाहिए. वर्तमान अध्ययन में 83 एंटीबॉडी मान्य थेपश्चिमी blots जिनमें से केवल 58 पारित (~ 30% की दर असफल) पर पैदा. इनमें से 58, 55 एंटीबॉडी स्वीकार्य परिणाम दिया जब (95% सफलता दर) RPPA विश्लेषण अन्य महत्वपूर्ण कदम है. एक को RPPA पर नमूने हाजिर एकाग्रता का चयन स्लाइड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खोलना की एकरूपता शामिल. एक उच्च एकाग्रता और अधिक संवेदनशील परिणाम दे, लेकिन कम अपर्याप्त वर्तमान जा रहा है प्रोटीन की वजह से देखा जा रहा है नमूनों में परिणाम हो सकता है. ऊतक की न्यूनतम राशि जो RPPA खोलना करने के लिए पर्याप्त प्रोटीन प्रदान करेगा निर्भर ट्यूमर है. आरसीसी के लिए 50 मिलीग्राम की एक न्यूनतम इस्तेमाल किया गया था, जो एक ट्यूमर के कई उप वर्गों का विश्लेषण करती है हो सकता है, जबकि अभी भी 1 मिलीग्राम / एमएल के एक खोलना एकाग्रता बनाए रखा अनुमति दी. खोलना की एकरूपता भी महत्वपूर्ण है विश्लेषण के रूप में मानता है कि सभी नमूनों को एक ही एकाग्रता में देखा जाता है, हालांकि यह स्लाइड खोलना के बाद एक कुल प्रोटीन एंटीबॉडी का उपयोग कर सत्यापित किया जा सकता है. अंतिम विचार एक नियंत्रण नमूना का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है जब नमूने संख्या इतनी अधिक होती है किवे एक एकल स्लाइड पर नहीं देखा है के रूप में यहाँ उदाहरण में मामला था. यहां इस्तेमाल किया गए उदाहरण में हम एक वृक्क कोशिका लाइन से प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण के रूप में एक HUVEC कोशिका लाइन से शामिल है. सेल लाइन प्रोटीन के उपयोग प्रोटीन की बड़ी मात्रा में निकाला जा करने के लिए और एकाधिक स्लाइड के लिए इस्तेमाल की अनुमति देता है. नियंत्रण किसी भी आंतरिक खोलना या एंटीबॉडी incubations के कारण त्रुटि के लिए compensates और विभिन्न उपयोगकर्ताओं और स्लाइड अलग अलग दिनों पर इस्तेमाल किया जा रहा है की वजह से विचलन के लिए compensates.
RPPA एक तकनीक के रूप में करने के लिए इस्तेमाल किया जा नमूनों की संख्या के संबंध के साथ लचीला है. उदाहरण प्रस्तुत यहाँ प्रत्येक स्लाइड पर 2 पैड के साथ, जो तीन स्लाइड्स पर फैल रहे थे 45 ट्यूमर के नमूनों से ~ 300 नमूनों का इस्तेमाल किया. वैकल्पिक रूप से मौजूदा स्वरूप 1 पैड के साथ एक एकल स्लाइड पर देखा गया था. के रूप में इस तरह के प्रारूप प्रयोगों की व्यक्तिगत जरूरतों के अनुरूप किया जा सकता है, एक स्लाइड अधिक एंटीबॉडी पर अधिक पैड के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन सैम की संख्या की सीमामंदिरों.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
FCO, DF, जे.एन., DJH और GDS लेखकों के काम का उल्लेख ऊपर मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय, अनुदान संख्या द्वारा वित्त पोषित है: ETM37 और कैंसर रिसर्च यूके के प्रयोगात्मक कैंसर चिकित्सा केंद्र द्वारा समर्थित है. अल का काम एडिनबर्ग Robertson ट्रस्ट, देखभाल और कैंसर और चिकित्सा अनुसंधान परिषद के इलाज के लिए Melville ट्रस्ट के सर्जन के रॉयल कॉलेज द्वारा वित्त पोषित है. कब मैरी क्यूरी प्रक्रिया और ब्रिटेन चिकित्सा अनुसंधान परिषद द्वारा cofunded एडिनबर्ग स्कॉटिश सरकार फैलोशिप के रॉयल सोसाइटी के द्वारा समर्थित है. लेखकों के इस पत्र में चर्चा विषयों में से कुछ पर उनके उपयोगी विचार - विमर्श के लिए SCOTRRCC सह आवेदकों और सहयोगियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
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