Summary
RPPA이 휘황이라는 항체를 사용하여 동시에 심문을 할 수 니트로 셀룰로스 슬라이드에 인쇄 샘플 수백의 단백질 표현을 할 수 있습니다. 이 기술은 투명 세포 신장 암에서 약물 치료 이질성의 효과를 연구에 적용되었습니다.
Abstract
현재 전이성 투명 세포 신장 세포 암에 대한 치료 치료, 질병의 commonest 변형이 없습니다. 이 치료 저항에 핵심 요소가 질병 (1)의 분자 복잡한 것으로 생각됩니다. 같은 티로신 키나제 억제제 (TKI) sunitinib의 타겟 치료가 사용되어 왔지만, 환자의 단지 40 % 1 년 2 안에 원래대로 돌아가는 이들 환자의 절대 다수와 함께 응답합니다. 신장 세포 암 환자에 고유 및 취득 저항 등의 질문은 3 관련성이 있습니다.
효과적인 맞춤 치료를 개발의 궁극적 인 목표로, TKIs에 저항을 연구하기 위해, 대상 치료의 특정 기간 이후 순차 조직은, 만성 골수 양 백혈병 (4)에 성공적으로 입증 한 접근 방식을 필요합니다. 그러나 신장 세포 암종 이러한 전략의 응용 프로그램은 B의 높은 수준에 의해 복잡신장 세포 암종 5,6뿐만 아니라 다른 고체 종양 7의 기능입니다 oth 간 및 intratumoral 이질성. transcriptomic와 유전자의 차이로 인해 Intertumoral 이질성은 잘도 유사한 프리젠 테이션, 무대와 종양의 등급 환자에 설립되어 있습니다. 또한이 더욱 분자 이질성을 대표 할 가능성이 RCC에 큰 형태학 (intratumoral) 이질성이 있다는 것을 분명하다. 통합 형태학의 분석 및 Fuhrman 등급의 RCC 종양에 대한 상세한 매핑 및 분류는 proteomic 분석을위한 대표 지역의 선택을 할 수 있습니다.
RCC 8 단백질 기반의 분석으로 인해 병리 실험실에서의 광범위한 상황에 매력적입니다하지만, 그 응용 프로그램은 특정 항체 9의 제한된 가용성으로 인해 문제가 발생할 수 있습니다. 역 위상 단백질 배열의 점 얼룩 자연 (RPPA), 항체 특이성은 반드시 B로 인해전자 사전은 - 확인, 사용 항체의 이러한 엄격한 품질 관리로 최고의 중요성입니다. 이러한 제한에도 불구하고 점 얼룩 형식은 하나의 니트로 셀룰로스 슬라이드로 샘플 수백 인쇄 수 있도록 검정 소형화을 허용하지 않습니다. 인쇄 슬라이드 그런 다음 멀티플렉싱을 허용, 대상 특정 기본 항체와 휘황 분류 이차 항체를 이용하여 서양 분석과 유사한 방식으로 분석 할 수 있습니다. 슬라이드에있는 모든 샘플에서 차동 단백질 표현식은 다음보다 비용 효율적이고 높은 처리량 방식으로 형광의 상대적 수준을 비교하여 동시에 분석 할 수 있습니다.
Protocol
1. 형태학 및 분자 종양 이질성의 확인
- 종양 -80 ° C의 냉동고에서 제거 드라이 아이스에 보관.
- 약 1cm 3 부분으로 종양을 나눈다. 각 종양 서로에 대해 섹션을 고유 한 이름으로 라벨의 원래 위치를 매핑합니다. 스토어 샘플 -80에서 개인 cryovials에서 ° C 사용할 준비가 될 때까지.
- 코트 샘플 10월 및 -22 ° C.에 그라 이오 스탯에 절단
- 샘플 Hematoxylin과 Eosin의 counterstaining 방법을 사용하여 얼룩이.
- 냉동 섹션의 현미경 분석들이 ccRCC 자연, 가능한 종양 및 등급 (냉동 섹션에 Fuhrman 등급 1을 4 대 차별화 할 도전 낮은 등급 높은 등급 또는 혼합 고 / 저 등급)에 대한의을 보장합니다. 그림 1 A & B (H & E 염색 높은 낮은 혼합 학년).
- 단백질 추출 각 종양 내의 각 morphologically 서로 다른 지역에서 4 샘플까지 선택합니다.
2. 종양 샘플에서 단백질 추출
- 10월에서 종양 샘플을 잘라 버릴거야.
- 용해 버퍼 990 μl 수있는 2 ML 튜브에 조직의 장 50-75 MG [50 MM 트리스 - HCL (산도 7.5), 5 MM EGTA (산도 8.5), 150 MM NaCl] aprotinin (시그마 A6279) (10 밀리그램과 보충 / ML), 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 2 (시그마, P5716), 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 3 (시그마, P0044)와 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈, 11836153001).
- 각 튜브에 하나 5mm의 스틸 볼을 추가하고 두 번 각 5 분 기간이 지나면 TissueLyser를 사용하여 균질화의 수준을 확인 5 분을 위해 50Hz에서 균질화.
- 뒤에 강철 공을두고 피펫을 사용하여 새 2 ML 튜브에 균질 샘플을 전송합니다.
- 4 ° C.에서 30 분 동안 13,000 XG에서 centrifuging 전에 각 샘플에 트리톤 X-100의 10 μl를 추가합니다
- 신선한 microcentrifuge 튜브에 supernatants를 전송합니다.
- BCA 분석을 (그림 2)를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
- 1 MG / ML에서 단백질 농도를 정상화.
3. 항체 확인
- 서부 얼룩에 대한 단백질 샘플을 (적절한 셀 라인 또는 조직에서 추출) 준비하고 10 % SDS-PAGE 젤에서 실행됩니다.
- 4에서 하룻밤 니트로 셀룰로스 막에 샘플을 전송 ° C.
- 상온에서 1 시간에 리튬 오호 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석)에 멤브레인을 차단합니다.
- 제조업체에서 리튬 오호 오디세이 차단 버퍼의 기본 항체를 (PBS에서 50:50에 희석) 희석 희석 1,000에 일반적으로 1 권장합니다.
- 4 ° C.에서 밤새 차 항체의 멤브레인을 품다
- 0.1 % PBS-Tween20 (, 1 ML Tween20 / 1L PBS PBS-T)를 구성합니다.
- 5 분 (X3)에 대한 실온에서 PBS-T의 멤브레인을 씻으십시오.
- 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석) 0.01 % 1:10,000 희석에서 SDS (1.5 μl/15 ML)에 차 항체를 휘황 라벨이 표시된 희석.
- 차의 멤브레인을 품다부드러운 진동과 45 분 동안 실온에서 항체 - 그것이 마지막 스캔 작업이 완료되었으며, 같은 시간까지 빛으로부터 멤브레인을 보호하는 것이 중요합니다.
- 어둠 속에서 막을 유지 5 분 (X3), 동안 실온에서 PBS-T의 멤브레인을 씻으십시오.
- 다시 어둠 속에서 막을 유지 잔여 Tween20을 제거하는 5 분 (X3), 동안 실온에서 PBS의 멤브레인을 씻으십시오.
- 어둠 속에서 필터 종이에 평면 멤브레인을 누워 건조한 공기 할 수 있도록 - 건조 할 수있는 멤브레인의 신호를 향상시키고 배경을 줄일 수 있지만, 벗겨하고 다시 프로빙하기에 쓸모 렌더링 할 수 있도록합니다.
- LiCor 오디세이 스캐너에 멤브레인을 검사합니다. 이 스캔되어 같은 시간까지 어둠 속에서 막세요.
- 만 정확한 분자량의 하나의 지배적 인 밴드를 생성 항체을 선택합니다. 그림 3은 RPPA와 함께 사용하기위한 허용 및 허용되지 않는 항체의 예를 보여줍니다.
4. RPPA PRInting
- 단백질 lysates는 MicroGrid II 로봇 반점을 찍는를 사용하여 니트로 셀룰로스 - 코팅 유리 슬라이드 (Fastslides-워트 먼지)에 발견되었다. 사용 슬라이드 샘플이 발견 된에이 패드가 포함되어 있습니다. 각 패드는이 경우 100 샘플에 동일한 샘플 발견되었습니다. 다른 사용 가능한 형식은 1, 8 및 16 패드 슬라이드가 포함되어 있습니다. 패드의 높은 번호를 작은 각에 발견 할 수 있습니다 샘플의 수입니다.
- 오 2 배 dilutions 일련의 각 샘플에서 만든 각 그 다음 (샘플 당 15 곳의 총의 결과) 세중의에 발견되었다.
5. RPPA 단백질 감지
- 초과 LiCor 차단 버퍼에 젖은 슬라이드 (PBS에서 50:50에 희석). 흔들 플랫폼에서 1 시간에 RT를 품다.
- 원하는 농도에 LiCor 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석)에 차 항체 800 μl를 준비하고 얼음 계속.
- 중은 (i) 단일 프레임 칩 클립에서 슬라이드를 마운트또는 (ii) 'FastFrame의 4 베이 슬라이드 홀더 그래서 시일이 슬라이드 및 배양 챔버 사이에 형성되는.
- 우물에서 잔류 버퍼를 제거하고 각각의 우물에 600 μl 차 항체를 추가 할 수 있습니다.
- 4에 밤새 플랫폼을 흔들에 봉인 된 서부 유럽 표준시 상자 및 배양에 슬라이드와 챔버를 배치 ° C.
- 0.1 % PBS-Tween20 (; 100 μl 십대 초반 1백분의 20 ML PBS PBS-T)를 구성합니다.
- 추운 방에서 슬라이드를 제거하고 신중하게 각 우물에서 차 항체를 제거합니다.
- PBS-T 600 μl를 추가하고 5 분 (X3)에 대한 RT에서 플랫폼을 흔들에 슬라이드를 씻으십시오.
- 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석) 0.01 % 첫 번째 인스턴스에서 1:2,000 희석 (1 μl / 2 ML)에서 SDS에 diluting하여 휘황 - 라벨 차 항체를 준비합니다.
- 우물에서 버퍼를 제거하고 각각의 우물에 600 μl 휘황 - 라벨 차 항체를 추가합니다. 부드러운 진동과 45 분 동안 실온에서 보조 항체를 배양 -가이 마지막 스캔 작업이 완료되었으며, 같은 시간까지 빛으로부터 멤브레인을 보호하는 것이 중요합니다.
- 상온에서 600 μl PBS-T에서 잘하고 간단히 세척 (X3)에서 차 항체를 제거합니다. 통신사에서 슬라이드를 제거 적당한 용기에 전송하고 어둠 속에서 막을 유지, 15 분에 대한 초과 PBS-T에 씻는다.
- 다시 어둠 속에서 막을 유지, 잔여 십대 초반-20을 제거하는 PBS-T 및 15 분 동안 실온에서 PBS에 대한 추가 세탁 막을 제거합니다.
- 10 분 50 ° C의 오븐에 Fastslide 건조 후 리튬 오호 오디세이 스캐너에 스캔합니다. 이 스캔 될 때까지 어둠 속에서 슬라이드세요.
- 보조 항체 / 사용 항체에 따라 680 nm의 및 / 또는 800 nm의에서 슬라이드를 스캔합니다. 2 색 검출을 위해 항상 교차 반응성을 최소화하기 위해 매우 간 adsorbed 차 항체를 사용합니다. 기본 및 보조 항체에주의 선택은 2 색을 감지하기 위해 필요합니다. 주요 중요성의 선택은두 가지 기본 항체에 대해 다른 호스트 종 (예를 들면 토끼 및 마우스). 이 쉽게 구별 방출 스펙트럼과 염색으로 분류됩니다 항 토끼 반 마우스 보조 항체에 의한 차별 할 수 있습니다.
- 이미지 파일은. tiff 파일로 저장됩니다. 그림 4는 (스캔 파일의 이미지).
6. 데이터 분석
- MicroVigene 소프트웨어 (VigeneTech, 칼라일, MA, USA)를 실행합니다.
- 엽니 다. RPPA 슬라이드의 검사를 포함하는 TIFF 이미지 파일을.
- RPPA 슬라이드의 이미지에 오버레이 할 수있는 그리드를해야합니다 미리 정의 된 템플릿 파일을 선택합니다.
- 클릭하여 그리드를 표시, 관심 (ROI) 버튼의 영역을 정의합니다.
- RPPA 장소를 통해 그리드를 배치합니다. 그림 6A (이미지 이상의 격자의 이미지).
- 모든 투자 수익 (ROI)을 강조하기 위해 모두 선택 버튼을 클릭합니다.
- 모두 찾기를 클릭합니다. MicroVigene이 autom합니다atically 투자 수익 (ROI)을 찾아, 관광 명소를 찾아 배경을 빼야 모든 먼지를 제거하고 장소를 정할.
- RPPA 슬라이드에있는 모든 샘플에 대한 결과를 가져보기 희석 곡선 버튼을 클릭합니다.
- 희석 데이터 저장을 클릭합니다.
- 각 샘플은 5 희석 포인트에서 인쇄되기 때문에 세중의에서 각 분석 15 점, 오류의 위험을 줄이고 커브 피팅의 품질을 향상 있습니다. MicroVigene는 항원 - 항체 결합 반응 속도론의 sigmoid 곡선을 생산하기위한 모든 부분을 포함 4 매개 변수 물류 - 로그 모델 "Supercurve"알고리즘 (그림 6B)를 생산하고 있습니다. 가정은 동일한 항체 - 항원 바인딩 속도론는 일반적인 응답 곡선에 맞게 배열에있는 모든 장소를 활용하여 따라서도 다른 샘플에 각각의 샘플 지점에 자리를하고있다하면 곡선 피팅 10,11의 신뢰를 높일 수 있다는 것입니다
Y = + ((BA) / (1 + E (C * D-솔직히 (X)))
x는 dilutio입니다N 요소와 Y는 신호 강도입니다.
샘플은 비교적 분석에 supercurve로 사람들을 매핑 한 후 x 값의 중간 지점에있는 Y 값에 대응 y0 값을 사용하여 분석 할 수 있습니다. - 그림 7에서와 같이 Microsoft Excel 및 플롯 y0의 데이터를 내 보냅니다.
- Intratumoral 단백질 차이는 ANOVA 프레임 워크의 치료 및 처리 치료 환자에 대해 개별적으로 계산되었습니다. 모든 분석 단백질의 데이터를 결합 분산 배포판은 맨 - 휘트니 시험 (MWT)로 비교했다. 잘못된 검색 속도 (루즈 벨트)이 수정은 12 적용, 각각의 단백질에 대한 Intratumoral 차이는 정상 상태와 homoscedasticity의 가정이 Lillefours 및 Fligner 테스트를 사용하여 각각 평가 개최 F-테스트에 비교했다. 치료 및 처리 환자 샘플 사이의 차동 단백질 표현식은 학생의 t-테스트를 사용하여 각 단백질에 대한 테스트 된 곳 정상 상태 및 homoscedasticity 가정S는 달리 MWT이 수행되었습니다 충족 된, 루즈 벨트는 결합 t-테스트 및 MWT 값을 12으로 적용되었습니다. 단백질에 대한 단백질 표현과 분산 피어슨 상관의 의의는 표준 접근 방식을 사용하여 추정 된 [R 참조]와 루즈 벨트는 12을 적용했습니다.
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Representative Results
스캔 RPPA 슬라이드의 예는 680과 800 nm의 표시 채널을 모두 그림 4은 (i)에서 볼 수 있습니다. 파장, 그림 4 (II)에 의해 이미지를 분리하면 분석 할 RPPA 슬라이드와 그림 4 (III)를 결정 개별 단백질의 발현에 각 패드를 할 수 있습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 (iii) 본 샘플에서 개별 단백질의 표현은 Gelsolin이 훨씬 낮은 단백질 표현이 cMYC에 비해 슬라이드에 걸쳐 표현의 높은 수준을 가지는 독특한이지만, 여전히 보편적 모든 샘플에서 표현 테스트. 반면 CD10는 특정 샘플이 거의 또는 전혀 표현이 감지하지 다른 샘플에도 불구하고 표현의 높은 수준을 제공과 함께, 다양한 표현했다. 마지막으로 pJAK2 배경 해발 모든 감지 단백질 식을 생산에 실패했습니다. 품질 관리의 관점에서 pJAK2의 결과는 분들 반면 용납 할 수없는 것CD10은 슬라이드 샘플 수의 감지 단백질 표현 수준에 따라 허용됩니다. 그림 5 쇼 차 항체와 다른 종의 주요 항체 사이의 교차 반응성의 부족을 강조 표시합니다. 개별 슬라이드에서 샘플을 계산하는 데 사용되는 Supercurve의 예는 그림 6에서 볼 수 있습니다. 이 곡선은 같은 그림 7 (AC)에서와 같이 상대적으로 단백질 기반의 표현 데이터를 생산하는 데 사용됩니다. 그림 7A는 RPPA 대하고 치료 샘플 사이의 차이를 감지 할 수있는 방법을 강조 세 RPPA 슬라이드에 걸쳐 대표 단백질의 표현 수준을 보여줍니다. 그림 7B는 초점을 맞추고 7C 그림 7A에서 샘플을 전처리 한 것으로하고 높은 단백질의 발현과 치료에 따라 분류 한 후 차등 단백질 발현 수준에. 그림은 높은 intratumoral에 초점을 맞추고샘플이 게시물 트리트먼트 샘플에서 발견되고 높은 변동과 함께 치료에 따라 분류 한 후 후 처리 샘플 분산.
관련 H & 냉동 섹션 E의 착색과 사전 처리 조직의 그림 1a. 조직 샘플지도
관련 H & 냉동 섹션 E의 착색과 후 처리 조직의 그림 1b는. 조직 샘플지도
그림 2. 단백질 결정을 위해 브래드 포드 분석에 대한 설정, 전ncluding 보정 곡선, 결과 테이블과 96 잘 플레이트 형식은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. RPPA에서 사용하기에 적합하고 적합 차 항체의 예
그림 4. RPPA 스캔 프로세스의 흐름 다이어그램은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6A. RPPA 슬라이드 명소에 그리드에 맞는이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6B. RPPA 슬라이드에있는 모든 샘플 비교 분석을 위해 사용됩니다 SuperCurve의 예. 녹색 명소 "는 동의를 나타냅니다수 분석 소프트웨어에서 미리 정의 된 한도에 따라 특이점 "을"장소와 빨간색 대표 ".
그림 6C. 발견 샘플 재현성의 예 표시된 예는 빈뿐만 아니라 하나의 샘플의 5 dilutions의 세중의 명소가 포함되어 있습니다.
그림 7A. 전형적인 RPPA 단백질에 대한 데이터 (MLH1)는 여러 슬라이드에 걸쳐 비교했다. 각 샘플은 종양 하위 영역에 해당합니다.
그림 7B. Differenti사전 및 사후 처리 샘플 MLH1에 대한 알 단백질 표현.
사전 및 사후 처리 샘플 사이의 MLH1 표현의 7C. 분산을 그림.
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Discussion
여기에 제시된 RPPA 방법은 단백질 분석의 널리 사용하지만 비교적 낮은 처리량 서부 얼룩 기술에 대한 높은 처리량 대안을 나타냅니다. 방법은 샘플 수백 분석 동시에 셀 라인과 조직 샘플의 다양한 선택의 주요 단백질의 직접 비교할 수 비교 반 정량적으로 할 수 있습니다. 다른 항체 종과 멀티플렉싱은 더 여러 항체를 동시에 사용할 수 있도록 기술의 힘을 증가시킵니다. 여기에 제시된 예는 종양 이질성과 이질성에 타겟팅 된 치료의 효과의 연구에서 RPPA의 능력을 보여줍니다.
기술로 RPPA는 항체 선택 답있는 중요한 단계 수 있습니다. 기술의 항체 특이성의 점 얼룩 특성으로 인해이 분석 기간 동안 확인 할 수 있으며 사용하기 전에 ascertained 수 있어야합니다. 현재 연구에서 83 항체이 유효만 58 (~ 30 %의 비율을 실패) 전달 중 서부 blots에 ated. RPPA (95 %의 성공률)에서 분석합니다. 다른 중요한 단계가 RPPA에 샘플을 발견 할 수있는 농도의 선택 슬라이드뿐만 아니라 야생의 균일 성을 포함하면이 58, 55 항체은 허용 결과를 주었다. 높은 농도 더 민감한 결과를 얻을 수 있으나 현재 존재 부족한 단백질을 발견하고 더 적은 샘플이 발생할 수 있습니다. RPPA는 야생에 대한 충분한 단백질을 제공 할 것입니다 조직의 최소 금액은 따라 종양입니다. RCC 50 밀리그램의 최소는 여전히 1 MG / ML의 야생 농도를 유지하면서 종양의 여러 하위 섹션 분석 할 수있는 사용되었다. 분석이이 슬라이드 야생 후 총 단백질 항체를 사용하여 확인 할 수 있지만 모든 샘플은, 하나의 농도에서 발견되는 가정으로 야생의 균일 성 또한 중요합니다. 최종 고려 사항 샘플 숫자가 너무 높은 경우 사용되는 제어 샘플의 사용입니다여기 예제의 경우되면서 사람들은 하나의 슬라이드에 발견 할 수 없습니다. 여기에 사용 된 예제에서 우리는 신장 세포 라인에서뿐만 아니라 컨트롤로 HUVEC 세포 라인에서 단백질을 포함. 세포주 단백질의 사용은 단백질의 대량 추출하고 여러 슬라이드에 사용할 수 있습니다. 제어 incubations을 찾는 또는 항체로 인해 고유 오차에 대한 보상, 다른 일에 사용하는 다른 사용자와 슬라이드에 의한 편차에 대한 보상.
기술로 RPPA가 사용되는 샘플의 수와 관련이있는 융통성이 있습니다. 예를 들면 여기에 각 슬라이드에 2 개의 패드와 세 슬라이드에 걸쳐 한 45 종양 샘플에서 ~ 300 샘플을 사용 발표했다. 또한 현재의 형식은 1 패드와 하나의 슬라이드에 발견되었습니다 수 있습니다. 이러한 형식 실험의 개별 요구에 맞게 수 있듯이, 슬라이드보다 항체에 대한 자세한 패드를 동시에 사용할하지만 샘의 수를 제한 할 수 있습니다ples.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
ETM37 및 암 연구 영국의 실험 암 의학 센터에서 지원 : 최고 과학자 사무실, 교부금 번호의 지원을 받고 있습니다 위에 작성자 FCO, DF, JN, DJH와 GDS의 작품은 멘션했습니다. AL의 작품은 에딘버러 (Edinburgh) 로버슨 신뢰, 관리 및 암과 의학 연구위원회의 치료를위한 멜빌 신뢰의 외과의 로얄 대학의 지원을 받고 있습니다. IO는 마리 퀴리 작업과 영국 의학 연구위원회 cofunded 에딘버러 (Edinburgh) 스코틀랜드 정부 활동의 로얄 학회에 의해 지원됩니다. 저자는이 문서에서 설명하는 주제의 일부에서의 유용한 토론을 SCOTRRCC 공동 신청자 및 공동 작업자 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
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