Summary
RPPA permite a expressão da proteína de centenas de amostras, impressos em lâminas de nitrocelulose para serem interrogados ao mesmo tempo, utilizando anticorpos marcados com fluorescência. Esta técnica tem sido utilizada para estudar o efeito do tratamento com medicamentos na heterogeneidade claro carcinoma de células renais.
Abstract
Actualmente não existe tratamento curativo para cancro metastático da célula clara de células renais, o mais comum dos variante da doença. Um factor chave neste resistência ao tratamento é considerado a complexidade molecular da doença 1. Terapia-alvo, tais como o inibidor da tirosina cinase (TKI)-sunitinib têm sido utilizados, mas apenas 40% dos pacientes respondem, com a grande maioria destes pacientes recidivantes dentro de 1 ano 2. Como tal a questão da resistência intrínseca e adquirida em pacientes com câncer de células renais é altamente relevante 3.
Para estudar a resistência a inibidores da tirosina quinase, com o objetivo final de desenvolver tratamentos eficazes e personalizados, tecido seqüencial após um período específico de terapia-alvo é necessária, uma abordagem que tinha sido bem sucedida em mielóide crônica 4 leucemia. No entanto, a aplicação de uma tal estratégia em carcinoma de células renais é complicada pelo elevado nível de both heterogeneidade inter-e intra-tumoral, o que é uma característica do carcinoma de células renais, 5,6, assim como outros tumores sólidos 7. Heterogeneidade Intertumoral devido a diferenças transcriptomic e genética está bem estabelecido, mesmo em pacientes com apresentação semelhante, estágio e grau do tumor. Além disso, é evidente que existe uma grande heterogeneidade (intratumoral) morfológica no RCC, a qual é susceptível de representar ainda maior heterogeneidade molecular. Mapeamento detalhado e classificação de tumores CCR por análise morfológica e classificação combinada Fuhrman permite a seleção de áreas representativas para análise proteômica.
Análise de proteínas baseada em 8 RCC é atraente devido a sua ampla disponibilidade em laboratórios de patologia, no entanto, a sua aplicação pode ser problemática devido à disponibilidade limitada de anticorpos específicos 9. Devido à natureza dot blot dos arrays de proteínas, em fase reversa (RPPA), a especificidade do anticorpo deve be pré-validado, como o controlo de qualidade rigoroso de tais anticorpos utilizados é de importância primordial. Apesar desta limitação, o formato dot blot não permite a miniaturização do ensaio, permitindo a impressão de centenas de amostras para uma lâmina de nitrocelulose único. Slides impressos podem então ser analisadas de uma forma semelhante à análise de Western com o uso de alvos específicos anticorpos primários e anticorpos secundários marcados com fluorescência, permitindo a multiplexagem. A expressão diferencial de proteínas em todas as amostras numa lâmina pode então ser analisados simultaneamente através da comparação do nível relativo de fluorescência de uma forma mais rentável e de alto rendimento.
Protocol
1. Identificação de morfológica e molecular Heterogeneidade Tumor
- Os tumores removidos do congelador a -80 ° C e mantido em gelo seco.
- Dividir os tumores em secções de cerca de 1 cm 3. Mapear a posição original de cada secção do tumor em relação ao outro e etiqueta com um nome único. Armazenar as amostras em criotubos individuais a -80 ° C até que esteja pronto para uso.
- Amostras do revestimento em outubro e cortar em um criostato a -22 ° C.
- Amostras corados com Hematoxilina e Eosina método contracoloração.
- Análise de microscopia de cortes congelados para garantir que eles são de natureza ccRCC, tumor viável e de classificação (de baixo grau, de alto grau ou mista de grau baixo / alto, desafiando a diferenciar os graus Fuhrman 1 a 4 na seção de congelados). Figura 1 a & b (coloração H & E de grau baixo e elevado misto).
- Selecione até 4 amostras de cada região morfologicamente diferentes dentro de cada tumor para extração de proteínas.
2. Extracção de proteínas a partir de amostras de tumores
- Corte amostra de tumor de outubro
- Lugar 50-75 mg de tecido em tubos de 2 ml com 990 ul de tampão de lise [Tris 50 mM-HCl (pH 7,5), 5 mM de EGTA (pH 8,5), 150 mM de NaCl] suplementado com aprotinina (Sigma A6279) (10 mg / ml), a fosfatase cocktail inibidor 2 (Sigma, P5716), cocktail de inibidores de fosfatase 3 (Sigma, P0044) e um cocktail de inibidores de protease (Roche, 11836153001).
- Adicionar uma única esfera de aço de 5 mm de cada tubo e homogeneíza-se a 50 Hz, durante 5 min duas vezes utilizando um TissueLyser, verificando o nível de homogeneização, após cada período de 5 min.
- Transfira a amostra homogeneizada novo tubo de 2 ml usando uma pipeta de sair da esfera de aço para trás.
- Adicionar 10 ul de Triton X-100 a cada uma das amostras antes da centrifugação a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
- Transfira os sobrenadantes para tubos de microcentrífuga fresco.
- Determinar a concentração de proteína utilizando o BCA ensaio (Figura 2).
- Normalizar as concentrações de proteína a 1 mg / ml.
3. Validação de anticorpo
- Preparar as amostras de proteína (extraído de linhas de células ou tecidos adequados) para transferência de Western e executado em um gel de 10% SDS-PAGE.
- Transferir as amostras para uma membrana de nitrocelulose durante a noite a 4 ° C.
- Bloquear a membrana no tampão de Li-Cor Odyssey bloqueio (50:50 diluída em PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Diluir os anticorpos primários em Li-Cor Tampão de Bloqueio Odyssey (50:50 diluída em PBS) na diluição recomendada os fabricantes tipicamente 1 em 1000.
- Incubar membrana em anticorpos primários durante a noite a 4 ° C.
- Tornar-se 0,1% de PBS-Tween 20 (PBS-T, 1 ml Tween 20/1 L de PBS).
- Lavar membrana em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3).
- Diluir fluorescente marcado com anticorpos secundários em Tampão de Bloqueio Odyssey (diluído em PBS, 50:50) 0,01% de SDS a diluição 1:10000 (1,5 μl/15 ml).
- Incubar em membrana secundáriaanticorpos à temperatura ambiente durante 45 min com agitação suave - é importante proteger a membrana a partir da luz até ao momento em que tenha sido finalmente digitalizado.
- Lavar membrana em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3), mantendo-se a membrana no escuro.
- Lavar membrana em PBS à temperatura ambiente durante 5 min (x3) para remover Tween20 residual, mais uma vez mantendo a membrana no escuro.
- Deite membrana plana sobre um pedaço de papel de filtro no escuro e deixar secar ao ar - permitindo que a membrana de secar pode melhorar o sinal e reduzir o fundo, mas tornar-se inútil para remoção e re-sondagem.
- Digitalização da membrana no scanner Odyssey LiCor. Manter a membrana no escuro até ao momento em que tenha sido digitalizada.
- Apenas seleccionar anticorpos que geram uma única banda predominante no peso molecular correcto. Figura 3 mostra exemplos de anticorpos aceitáveis e inaceitáveis para uso com RPPA.
4. RPPA PriNTING
- Lisados de proteínas foram depositados em lâminas de nitrocelulose revestidos de vidro (Fastslides-Whatman) usando um MicroGrid II robótica observador. As lâminas utilizadas continham duas almofadas sobre o qual as amostras foram manchados. Cada bloco foi manchado com amostras idênticas, neste caso, 100 amostras. Outros formatos disponíveis incluem 1, 8 e 16 lâminas almofada. Quanto maior o número de almofadas de quanto menor for o número de amostras que podem ser depositados em cada um.
- Uma série de cinco diluições de 2 vezes foram feitas a partir de cada amostra e cada uma delas foi então visto em triplicado (resultando num total de 15 pontos por amostra).
5. Detecção de Proteína RPPA
- Lâminas molhados em tampão LiCor excesso de bloqueio (50:50 diluída em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 1 hora numa plataforma de agitação.
- Preparar 800 ul de anticorpos primários em LiCor tampão de bloqueio (diluído em PBS, 50:50) para as concentrações desejadas e manter em gelo.
- Montar as lâminas em (i) Clip Chip o único frameou (ii) a quatro 'FastFrame' porta-lâminas compartimento de modo que uma vedação apertada é formado entre a lâmina e a câmara de incubação.
- Remover o tampão residual a partir de poços e adicionar 600 uL de anticorpo primário às cavidades respectivas.
- Colocar a lâmina e câmara em uma caixa selada húmida e incubar no balanço da plataforma durante a noite a 4 ° C.
- Tornar-se 0,1% de PBS-Tween 20 (PBS-T, 100 ul de Tween 20/100 ml de PBS).
- Retirar as lâminas da câmara e remova cuidadosamente os anticorpos primários de cada poço.
- Adicionar 600 ul de PBS-T e lavagem das lâminas em balançar plataforma à temperatura ambiente durante 5 min (X3).
- Prepare fluorescentemente marcadas com anticorpos secundários através de diluição em tampão de bloqueio Odyssey (diluído em PBS, 50:50) 0,01% de SDS a 1:2.000 de diluição (1 ul / 2 ml), em primeiro lugar.
- Remover o tampão dos poços e adicionar 600 ul de anticorpos marcados com fluorescência, secundárias às cavidades respectivas. Incubar anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 45 min com agitação suave - loÉ importante proteger a membrana a partir da luz até ao momento em que tenha sido finalmente digitalizado.
- Remover anticorpos secundários de lavagem bem e rapidamente (3x) em 600 ul de PBS-T, à temperatura ambiente. Retirar a lâmina de suporte, a transferência para um recipiente adequado e lavar em excesso de PBS-T, durante 15 minutos, mantendo-se a membrana no escuro.
- Remover o PBS-T e da membrana de lavagem adicional com PBS à temperatura ambiente durante 15 min para remover o residual de Tween-20, mais uma vez mantendo a membrana no escuro.
- Seca-se o forno Fastslide em 50 ° C durante 10 min e, em seguida, digitalizar no digitalizador Odyssey Li-Cor. Mantenha o slide no escuro até que tenha sido digitalizado.
- Digitalizar o slide a 680 nm e / ou 800 nm, dependendo do anticorpo secundário / anticorpos utilizados. Por duas cores de detecção de usar sempre altamente cross-adsorvidas anticorpos secundários para minimizar reatividade cruzada. A selecção cuidadosa de anticorpos primários e secundários é necessário para a detecção de duas cores. De importância primária é a selecção dediferentes espécies hospedeiras (coelho e rato, por exemplo) para os dois anticorpos primários. Isso permite que a discriminação por anti-coelho e rato anti-anticorpos secundários que são marcadas com corante com espectros de emissão facilmente distinguíveis.
- Os arquivos de imagem são salvos como arquivos. Tiff. Figura 4 (imagem de arquivos digitalizados).
6. Análise de Dados
- Lançamento do Software MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, EUA).
- Abra. Tiff arquivo de imagem contendo a digitalização do slide RPPA.
- Seleccionar um ficheiro de modelo predefinido que terá uma grelha para sobrepor a imagem do slide RPPA.
- Clique no botão definir regiões de interesse (ROI), para abrir a grade.
- Posicione a grade sobre os pontos RPPA. Figura 6a (imagem da grade sobre a imagem).
- Clique no botão Selecionar ALL destacar tudo o ROI.
- Clique em Localizar tudo. MicroVigene vai automaticam encontrar o ROI, encontrar os pontos, subtrair o fundo, remova a poeira e quantificar pontos.
- Clique no botão Exibir curva de diluição para trazer os resultados para todas as amostras no slide RPPA.
- Clique em Salvar Dados diluição.
- À medida que cada amostra é impresso em 5 pontos a cada diluição em triplicado, são 15 pontos a analisar, o que reduz o risco de erros e melhora a qualidade do ajustamento de curva. MicroVigene produz uma logística de 4 parâmetros de registo de modelo de algoritmo "Supercurve" (Figura 6b), que incorpora todos os pontos para produzir uma curva sigmoidal de antigénio-anticorpo cinética de ligação. A suposição é que os mesmos anticorpos antígeno-cinética de ligação está ocorrendo em cada ponto da amostra, mesmo em diferentes amostras, assim, tomando todos os pontos em uma matriz para atender a uma curva de resposta comum pode aumentar a confiança do ajuste de curva 10,11
Y = a + ((ba) / (1 + e-(c * d-ln (x)))
em que x é o dilution factor e Y é a intensidade do sinal.
As amostras podem ser analisadas comparativamente, usando o valor de y0, que, em nossa análise correspondia ao valor de y no ponto médio dos valores de x, após o mapeamento aqueles para o supercurve. - Exportar os dados em Microsoft Excel e enredo y0 como na Figura 7.
- Variância proteína intratumoral foi calculado separadamente para tratados e não tratados pacientes tratados em um quadro ANOVA. Distribuições de variância combinando dados a partir de todas as proteínas analisadas foram comparados pelo teste de Mann-Whitney (TMV). Variações intratumorais para proteínas individuais foram comparadas pelo teste F, onde os pressupostos de normalidade e homocedasticidade realizadas, respectivamente avaliada utilizando o Lillefours e testes Fligner; taxa de descoberta de falsas (FDR) correção foi aplicada 12. A expressão diferencial de proteínas entre as amostras dos pacientes tratados e não tratados foi testada para cada proteína utilizando teste t de Student, onde normalidade e homocedasticidade suposiçãos foram atendidas, caso contrário, MWT foi realizada; FDR foi aplicado sobre os valores combinados t-teste e MWT 12. Significado da expressão de proteínas e correlação de Pearson variância para as proteínas foram estimados usando uma abordagem padrão [R referência] e FDR aplicada 12.
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Representative Results
Um exemplo de uma lâmina de RPPA digitalizada pode ser visto na Figura 4 (i), com ambos os canais 680 e 800 nm indicadas. Separando as imagens por comprimento de onda, a Figura 4 (ii) permite que cada bloco na corrediça RPPA a ser analisado e a expressão da proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como pode ser visto na Figura 4 (iii) a expressão de proteínas individuais através das amostras é o único com gelsolina tendo um elevado nível de expressão do outro lado da lâmina em relação ao cMYC que tem uma expressão de proteína muito mais baixa, mas ainda universalmente expressos em todas as amostras testados. Em contraste CD10 deu expressão variável, com certas amostras dar um elevado nível de expressão, apesar de outras amostras que têm pouca ou nenhuma expressão detectável. Finalmente pJAK2 não conseguiu produzir qualquer expressão da proteína detectável acima do nível do fundo. Do ponto de vista de controle de qualidade dos resultados dos pJAK2 seriam inaceitáveis enquanto que as deCD10 seria aceitável devido aos níveis de proteína detectadas de expressão de um número de amostras sobre a lâmina. Figura 5 mostra evidencia a ausência de reactividade cruzada entre os anticorpos secundários e os anticorpos primários de uma outra espécie. Um exemplo da Supercurve usado para calcular as amostras através de um slide individual pode ser visto na Figura 6. Estas curvas são utilizadas para produzir os dados de expressão de proteínas em relação à base tal como mostrado na Figura 7 (ac). A Figura 7a mostra os níveis de expressão de uma proteína representativa entre as três lâminas RPPA destacando como RPPA podem detectar diferenças entre amostras tratadas e não tratadas. Figura 7b concentra sobre os níveis de proteínas de expressão diferencial após as amostras provenientes Figura 7a foram agrupados com base em tratamento, com a expressão mais elevada da proteína a ser considerada no pré-tratamento. Figura 7c centra-se na maior intratumoralvariância para as amostras de pós-tratamento depois de as amostras terem sido agrupados com base no tratamento, com maior variância, sendo encontrado em amostras de pós-tratamento.
Figura 1a mapa de exemplo. Tecido de tecido associado com tratamento pré coloração H & E de cortes congelados
Figura 1b mapa de exemplo. Tecido de tecido pós-tratamento com associados H & E coloração de cortes congelados
Figura 2. Configurar para o ensaio de Bradford para a determinação da proteína, icurva de calibração ncluding, tabela de resultados e 96 formato de placa também. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Exemplos adequados e não adequados anticorpos primários para utilização com RPPA
Figura 4. Diagrama de fluxo de RPPA processo de digitalização. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 6a. Montagem da Grade nos pontos de deslizamento RPPA. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 6b. Exemplo de SuperCurve que é utilizado para a análise comparativa de todas as amostras no slide RPPA. Pontos verdes representam "aceitarcapazes "pontos e vermelhas representam" outliers "com base em limites predefinidos no software de análise.
Figura 6C. Exemplo da reprodutibilidade das amostras manchadas, o exemplo mostrado inclui os pontos em triplicado com as cinco diluições de uma única amostra, para além do espaço em branco.
Figura 7a. RPPA típica dados para uma proteína (MLH1), comparado vários slides. Cada amostra corresponde a uma região de tumor secundário.
Figura 7b. DIFERENCIALal expressão da proteína por MLH1 para amostras pré e pós tratamento.
Figura Variância. 7c em MLH1 expressão entre as amostras pré e pós tratamento.
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Discussion
O método aqui apresentado RPPA representa uma alternativa para a produção elevada amplamente utilizada mas comparativamente baixa taxa de transferência western blot técnica de análise de proteínas. O método permite que centenas de amostras para ser semi-quantitativamente analisadas e comparadas simultaneamente permitindo a comparação directa de proteínas-chave através de uma grande variedade de linhas celulares e amostras de tecido. Multiplexagem com espécies diferentes de anticorpos aumenta ainda mais o poder da técnica que permite múltiplos anticorpos a serem utilizados simultaneamente. O exemplo aqui apresentado evidencia a capacidade de RPPA no estudo da heterogeneidade de tumores e o efeito da terapia orientada para a heterogeneidade.
Como uma técnica RPPA tem um número de passos críticos do qual a selecção de anticorpos é primordial. Devido à natureza dot blot da especificidade do anticorpo técnica não pode ser confirmada durante a análise e deve ser verificada antes da sua utilização. No estudo atual 83 anticorpos foram válidassituados de western blots dos quais apenas 58 passaram (fail taxa de ~ 30%). Destes 58, 55 anticorpos deu resultados aceitáveis quando análises sobre RPPA (95% de sucesso). Outros passos críticos incluem a selecção de uma concentração de detectar amostras no RPPA desliza bem como a uniformidade de manchas. A maior concentração dará resultados mais sensíveis, mas pode resultar em menos amostras sendo manchado devido à insuficiência de proteínas estar presente. A quantidade mínima de tecido que irá fornecer a proteína suficiente para manchar RPPA tumor é dependente. Para RCC um mínimo de 50 mg foi utilizada permitiu que vários sub secções de tumor seja análises enquanto ainda mantém uma concentração de focagem de 1 mg / ml. Uniformidade de manchas é também essencial que a análise assume que todas as amostras são manchados com uma única concentração, embora isto possa ser verificada utilizando um anticorpo de proteína total após corrediça manchas. A última consideração é a utilização de uma amostra de controlo para ser utilizado quando as amostras são números tão elevados queeles não podem ser manchadas sobre uma lâmina única, como era o caso nos exemplos aqui. No exemplo utilizado aqui incorporamos proteína a partir de uma linha de células renais, bem como a partir de uma linha de células HUVEC como controles. A utilização de proteínas linha celular permite que grandes quantidades de proteínas a ser extraída e utilizada para vários slides. O controlo compensa qualquer erro intrínseca devido a manchas ou anticorpo incubações e compensa os desvios devido a diferentes utilizadores e lâminas serem usados em dias diferentes.
RPPA como uma técnica é flexível no que diz respeito ao número de amostras a serem utilizados. Os exemplos apresentados aqui usado ~ 300 amostras de 45 amostras de tumor que foram distribuídos por três lâminas, com duas almofadas de cada slide. Alternativamente, o formato atual poderia ter sido flagrado em um único slide com uma almofada. Como tal formato pode ser adaptado às necessidades individuais dos experimentos, as almofadas mais em um slide mais anticorpos podem ser usados simultaneamente, mas limitar o número de sampios.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho dos autores FCO, DF, JN, DJH e GDS mencionado acima é financiado pelo Escritório Cientista Chefe, número de concessão: ETM37 e apoiado pelo Reino Unido Centro de Pesquisa do Câncer Medicina Experimental do Câncer. O trabalho de AL é financiado pelo Royal College of Surgeons de Edinburgh Robertson Trust, o Confiança Melville para o cuidado ea cura do câncer e do Conselho de Pesquisa Médica. IO é apoiado por uma Sociedade Real de Edimburgo Fellowship Governo escocês co-financiado pelas Acções Marie Curie e do UK Medical Research Council. Os autores gostariam de agradecer SCOTRRCC co-candidatos e colaboradores para suas discussões úteis sobre alguns dos temas abordados neste trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
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