Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Anvendelse af omvendt fase-protein Arrays (RPPA) at udforske Protein Expression Variation i de enkelte renalcellecarcinom Kræft

Published: January 22, 2013 doi: 10.3791/50221

Summary

RPPA muliggør protein ekspression af hundreder af prøver, udskrives på nitrocellulose objektglas til at blive udspurgt samtidigt under anvendelse af fluorescensmærkede antistoffer. Denne teknik er blevet anvendt til at studere virkningen af ​​lægemiddelbehandling heterogenitet inden clear cell renal carcinoma.

Abstract

I øjeblikket er der ingen helbredende behandling for metastatisk clear cell renal cell cancer, den hyppigste variant af sygdommen. En vigtig faktor for denne behandling modstand menes at være den molekylære kompleksitet af sygdommen 1. Målrettet terapi såsom tyrosinkinasehæmmer (TKI)-sunitinib er blevet anvendt, men kun 40% af patienterne vil reagere, med et overvældende flertal af disse patienter fik tilbagefald inden for 1 år 2. Som sådan spørgsmålet om iboende og erhvervet resistens i nyrecellecancer patienter er yderst relevant 3.

For at studere modstand mod TKIs, med det ultimative mål at udvikle effektive, personlige behandlinger, er sekventiel væv efter en bestemt periode med målrettet terapi er påkrævet, en tilgang, der havde været en succes i kronisk myeloid leukæmi 4. Men anvendelsen af ​​en sådan strategi i renalcellecarcinom kompliceres af det høje niveau af bOTH inter-og intratumoral heterogenitet, der er en funktion af renalcellecarcinom 5,6 samt andre faste tumorer 7. Intertumoral heterogenitet skyldes transkriptomisk og genetiske forskelle er veletableret selv hos patienter med lignende præsentation, stadium og kvalitet af tumor. Desuden er det klart, at der er stor morfologisk (intratumoral) heterogenitet i RCC, som kan repræsentere endnu større molekylær heterogenitet. Detaljeret kortlægning og kategorisering af RCC tumorer ved kombineret morfologisk analyse og Fuhrman grading tillader valg af repræsentative områder for proteom analyse.

Protein baseret analyse af RCC 8 er attraktiv på grund af sin udbredte tilgængelighed i patologi laboratorier, men kan det i princippet være problematisk på grund af den begrænsede tilgængelighed af specifikke antistoffer 9. På grund af dot blot arten af ​​omvendt fase Protein Arrays (RPPA), antistofspecificitet skal be prævalideret, som sådan en streng kvalitetskontrol af de anvendte antistoffer er af afgørende betydning. På trods af denne begrænsning af dot blot-format tillader, assay miniaturisering, der giver mulighed for trykning af hundredvis af prøver på et enkelt nitrocellulose slide. Trykte objektglas kan derefter analyseres på lignende måde til Western-analyse med anvendelse af mål-specifikke primære antistoffer og fluorescensmærkede sekundære antistoffer, der giver mulighed for multipleksering. Differential proteinekspression i alle prøverne på et objektglas kan derefter analyseres samtidigt ved at sammenligne det relative niveau af fluorescens på en mere omkostningseffektiv og højt gennemløb måde.

Protocol

1. Identifikation af morfologiske og molekylære Tumor Heterogenitet

  1. Tumorer fjernet fra -80 ° C fryser og holdt på tøris.
  2. Opdele tumorer i sektioner på ca 1 cm3. Kortlægge den oprindelige position af hver tumor sektion i forhold til hinanden og etiket med et unikt navn. Opbevar prøver i individuelle kryoglas ved -80 ° C indtil den skal bruges.
  3. Coat prøver i OLT og skåret i en kryostat ved -22 ° C.
  4. Prøver farvedes med hæmatoxylin-og eosin kontrastfarvning metode.
  5. Mikroskopi analyse af frosne dele for at sikre de er af ccRCC karakter, levedygtig tumor og til klassificering (lav kvalitet, høj kvalitet eller blandet lav / høj kvalitet, udfordrende at differentiere Fuhrman lønklasse 1 til 4 på frosne sektion). Figur 1 a & b (H & E farvning af høj værdi og blandet kvalitet).
  6. Vælg op til 4 prøver fra hver morfologisk forskellige region inden for hver tumor for protein udvinding.

2. Protein Udtræk fra tumorprøver

  1. Skær tumor prøve fra oktober
  2. Sted fra 50 til 75 mg væv i 2 ml rør med 990 ul lysepuffer [50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCI] suppleret med aprotinin (Sigma A6279) (10 mg / ml), phosphatase inhibitor cocktail 2 (Sigma, P5716), phosphatase inhibitor cocktail 3 (Sigma, P0044) og en protease-inhibitor cocktail (Roche, 11836153001).
  3. Tilføje en enkelt 5 mm stålkugle til hvert rør og homogeniseres ved 50Hz i 5 minutter to gange ved anvendelse af en TissueLyser, kontrollering af homogenisering efter hver 5 minutter.
  4. Overførsel homogeniserede proeve til ny 2 ml rør ved hjælp pipette forlader stålkugle bag.
  5. Der tilsættes 10 ul Triton X-100 til hver prøve før centrifugering ved 13.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C.
  6. Overfør supernatanterne til friske mikrocentrifugerør.
  7. Bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af BCA-assay (figur 2).
  8. Normalize proteinkoncentrationer på 1 mg / ml.

3. Antistof Validation

  1. Forbered proteinprøver (ekstraheret fra egnede cellelinier eller væv) for western blot og kørt på en 10% SDS-PAGE gel.
  2. Overføre prøver på nitrocellulosemembran natten over ved 4 ° C.
  3. Blokere membranen i Li-Cor Odyssey blokeringspuffer (fortyndet 50:50 i PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Fortynd de primære antistoffer i Li-Cor Odyssey blokeringspuffer (fortyndet 50:50 i PBS) ved fabrikanterne anbefalede fortynding typisk 1 ud af 1.000.
  5. Inkuber membranen med primære antistoffer natten over ved 4 ° C.
  6. Udgør 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 1 ml Tween 20/1 liter PBS).
  7. Vask membranen med PBS-T ved stuetemperatur i 5 min (x3).
  8. Fortynd fluorescens-mærkede sekundære antistoffer i Odyssey blokerende buffer (fortyndet 50:50 i PBS) 0,01% SDS ved 1:10.000 fortynding (1,5 μl/15 ml).
  9. Inkuber membran i sekundærantistoffer ved stuetemperatur i 45 minutter under forsigtig omrystning - det er vigtigt at beskytte membranen mod lyset, indtil den er endeligt scannet.
  10. Vask membranen med PBS-T ved stuetemperatur i 5 min (x3), holde membranen i mørke.
  11. Vask membranen i PBS ved stuetemperatur i 5 min (x3) for at fjerne resterende Tween ® 20, igen holde membranen i mørke.
  12. Ligge membran fladt på et stykke filtrerpapir i mørke og lad lufttørre - tillade membranen at tørre kan forøge signal og reducere baggrunden, men gøre den ubrugelig til stripning og fornyet sondering.
  13. Scan membranen på licor Odyssey scanneren. Holde membranen i mørke, indtil det er blevet scannet.
  14. Kun vælge antistoffer, der genererer en enkelt dominerende bånd ved den korrekte molekylevægt. Figur 3 viser eksempler på acceptable og uacceptable antistoffer til anvendelse med RPPA.

4. RPPA Printing

  1. Proteinlysater blev plettet på nitrocellulose-coatede objektglas (Fastslides-Whatman) ved hjælp af en MicroGrid II robot spotter. De anvendte objektglas indeholdt 2 blokke, på hvilke prøver blev spottet. Hver pude blev spottet med identiske prøver, i dette tilfælde 100 prøver. Andre tilgængelige formater omfatter 1, 8 og 16 pad dias. Jo højere antallet af puder jo mindre antallet af prøver, der kan plettet på hver.
  2. En serie af fem 2-ganges fortyndinger blev fremstillet ud fra hver prøve, og hver blev derefter spottet i tre eksemplarer (hvilket resulterer i i alt 15 felter per prøve).

5. RPPA Protein Detection

  1. Våde objektglas på over licor blokeringspuffer (fortyndet 50:50 i PBS). Inkuber ved RT i 1 time på en vippende platform.
  2. Forbered 800 ul primære antistoffer i licor blokerende buffer (fortyndet 50:50 i PBS) ved de ønskede koncentrationer og holde på is.
  3. Monter dias i enten (i) af et enkelt billede Chip Clipeller (ii) den "FastFrame» fire bay diasholder således at en tæt forsegling dannes mellem glideren og rugekammeret.
  4. Fjerne resterende puffer fra brøndene, og der tilsættes 600 pi primært antistof til respektive brønde.
  5. Placer dias og kammeret i en forseglet våd boks og inkuber på rocking platform natten over ved 4 ° C.
  6. Udgør 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 100 pi Tween 20/100 ml PBS).
  7. Fjern dias fra kølerum, og fjern forsigtigt de primære antistoffer fra hver brønd.
  8. Tilsættes 600 pi PBS-T og skylning af objektglas på rocking platform ved stuetemperatur i 5 min (X3).
  9. Forbered fluorescens-mærkede sekundære antistoffer ved fortynding i Odyssey blokerende buffer (fortyndet 50:50 i PBS) 0,01% SDS ved 1:2000 fortynding (1 pi / 2 ml) i første omgang.
  10. Fjerne bufferen fra brøndene, og der tilsættes 600 pi fluorescens-mærkede sekundære antistoffer til respektive brønde. Inkuber sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 45 minutter under forsigtig omrystning - deter vigtigt at beskytte membranen mod lyset, indtil den er endeligt scannet.
  11. Fjerne sekundære antistoffer fra brønd og kort vask (x3) i 600 pi PBS-T ved stuetemperatur. Fjern side fra bæreren, overføres til en egnet beholder og vask over PBS-T i 15 minutter, holde membranen i mørke.
  12. Fjern PBS-T og yderligere vask membran med PBS ved stuetemperatur i 15 minutter for at fjerne resterende Tween-20, igen holde membranen i mørke.
  13. Tør Fastslide i 50 ° C ovn i 10 minutter og derefter scanne på Li-Cor Odyssey scanner. Hold dias i mørke, indtil det er blevet scannet.
  14. Scan objektglasset ved 680 nm og / eller 800 nm afhængigt af det sekundære antistof / anvendte antistoffer. For tofarvet afsløring altid bruger højt cross-adsorberede sekundære antistoffer for at minimere krydsreaktivitet. Omhyggelig udvælgelse af primære og sekundære antistoffer er nødvendig for to-farve-detektion. Af primær betydning er udvælgelsen afforskellige værtsarter (fx kanin og mus) for de to primære antistoffer. Dette tillader diskrimination af anti-kanin-og anti-muse-sekundære antistoffer der er mærket med farvestof med let at skelne emissionsspektre.
  15. Billedfiler gemmes som. TIFF-filer. Figur 4 (billede af scannede filer).

6. Dataanalyse

  1. Start MicroVigene Software (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).
  2. Åbn. Tiff billede fil, der indeholder scanning af RPPA slide.
  3. Vælge en foruddefineret skabelon fil, som har et gitter til at overlejre på billedet af RPPA slide.
  4. Klik på Definer regioner af interesse (ROI)-knappen, for at hente Grid.
  5. Placer Gitter over RPPA pletter. Figur 6a (billede af gitter henover billedet).
  6. Klik knappen Marker alle for at markere alle ROI.
  7. Klik på Find alle. MicroVigene vil AUTOMmatisk finde ROI, finde de steder, trække baggrunden, skal du fjerne støv og kvantificere pletter.
  8. Klik på View fortyndingskurven for at åbne resultaterne for alle prøverne på RPPA slide.
  9. Klik på Gem fortyndings data.
  10. Da hver prøve er trykt på tværs af 5 fortyndingsforhold points hver i tre eksemplarer er der 15 point at analysere, hvilket mindsker risikoen for fejl og forbedrer kvaliteten af ​​kurvetilpasning. MicroVigene danner en 4-parameter logistisk-log model "Supercurve" algoritme (figur 6b), der inkorporerer alle pletter for at frembringe en sigmoid kurve af antigen-antistof bindingskinetik. Antagelsen er, at de samme antistof-antigen bindingskinetik finder sted på hver prøve stedet, selv i de forskellige prøver, og dermed ved at tage alle pletter på et array til at passe en fælles responskurve kan øge tilliden til den kurvetilpasning 10,11
    Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
    hvor x er dilution faktor og Y er signalintensiteten.
    Prøver kan forholdsvis analyseret ved hjælp af y0 værdi, hvilket i analysen svarer til y-værdien ved midten af ​​X-værdierne efter kortlægge dem på supercurve.
  11. Eksportere data i Microsoft Excel og plot y0 som i figur 7.
  12. Intratumoral protein varians blev beregnet separat for ubehandlede og behandlede patienter i en ANOVA rammer. Varians fordelinger kombinerer data fra alle de analyserede proteiner blev sammenlignet med en Mann-Whitney testen (MWT). Intratumoral afvigelser for de enkelte proteiner blev sammenlignet med en F-test, hvor antagelser om normalitet og homoscedasticity holdt, vurderet henholdsvis ved hjælp af de Lillefours og Fligner test, falsk opdagelse sats (FDR) korrektion blev anvendt 12. Forskellen proteinekspression mellem ubehandlede og behandlede patientprøver blev testet for hvert protein under anvendelse af Students t-test, hvor normalitet og homoscedasticity antagelses var opfyldt, ellers MWT blev udført, FDR blev anvendt frem for kombinerede t-test og MWT værdier 12. Betydningen af proteinekspression og varians Pearson korrelation for proteinerne blev vurderet ved hjælp af en standardmetode [R reference] og FDR anvendt 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på et scannet RPPA slide kan ses i figur 4 (i) med både 680 og 800 nm viste kanaler. Separering af billeder ved bølgelængde, figur 4 (ii) giver hver pude på RPPA slide skal analyseres og individuelle proteinekspression bestemt Figur 4 (iii). Som det kan ses i figur 4 (iii) ekspression af individuelle proteiner tværs prøverne er unik med gelsolin har et højt niveau af ekspression over objektglasset i forhold til cMYC som har en meget lavere proteinekspression, men stadig universelt udtrykt i alle prøverne testet. I modsætning CD10 gav variable udtryk, med visse prøver, der giver et højt niveau af ekspression trods andre prøver har lille eller ingen ekspression påviselig. Endelig pJAK2 undladt at producere en påviselig proteinekspression højere end baggrundsniveauet. Fra et kvalitetskontrol perspektiv resultaterne af pJAK2 vil være uacceptabelt hvorimod deCD10 ville være acceptabel på grund af de detekterede protein ekspressionsniveauer af et antal prøver på objektglasset. Figur 5 viser fremhæver den manglende krydsreaktivitet mellem sekundære antistoffer og primære antistoffer ifølge en anden art. Et eksempel på Supercurve anvendes til at beregne prøver over et individuelt lysbillede kan ses i figur 6. Disse kurver anvendes til fremstilling relative proteinbaserede ekspressionsdata, såsom i figur 7 (ac). Figur 7a viser ekspressionsniveauer af et repræsentativt protein i de tre RPPA slides fremhæver, hvordan RPPA kan påvises forskelle mellem behandlede og ubehandlede prøver. Figur 7b fokuserer på de differentielle protein-ekspressionsniveauer efter at prøverne fra figur 7a er blevet grupperet baseret på behandling med højere protein-ekspression blev fundet i forbehandlingen. figur 7c fokuserer på højere intratumoralvarians for de efter behandlingen prøver efter at prøverne er blevet grupperet baseret på behandling med højere varians, der findes i de efter behandlingen prøver.

Figur 1a
Figur 1a. Vævsprøve kort over før behandling væv med tilhørende H & E-farvning af frosne snit

Figur 1b
Figur 1b. Vævsprøve kort over efter behandlingen væv med tilhørende H & E-farvning af frosne snit

Figur 2
Figur 2. Oprettet for Bradford assay for protein bestemmelse, including kalibreringskurve, resultater bord og 96 brønde format. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Eksempler på passende og upassende primære antistoffer til anvendelse med RPPA

Figur 4
Figur 4. Blokdiagram af RPPA scanning proces. Klik her for at se større figur .

Figur 5. Eksempel på manglen på krydsreaktivitet mellem sekundære antistoffer og primære antistoffer ifølge en anden art. Venstre billede påvisning af proteinekspression ved hjælp sekundært antistof scannet ved korrekt bølgelængde på 680 nm og ukorrekt bølgelængde på 800 nm.

Figur 6a
Figur 6a. Montering gitteret på RPPA slide pletter. Klik her for at se større figur .

6b
Figur 6b. Eksempel på SuperCurve som anvendes til komparativ analyse af alle prøverne på RPPA slide. Grønne pletter repræsenterer "accepterestand "pletter og røde repræsenterer" outliers "baseret på prædefinerede grænser i analyse software.

Figur 6c
Figur 6C. Eksempel på reproducerbarheden af de plettede prøver viste eksempel omfatter den tredobbelte pletter af de 5 fortyndinger af en enkelt prøve ud over emnet.

Figur 7A
Figur 7a. Typisk RPPA data for et protein (MLH1), sammenlignes på tværs af flere dias. Hver prøve svarer til en tumor sub region.

Figur 7b
Figur 7b. Differentiereal protein udtryk for MLH1 for før og efter behandling prøver.

Figur 7c
Figur 7c. Afvigelse i MLH1 udtryk mellem før og efter behandling prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

The RPPA metode præsenteres her repræsenterer en high throughput alternativ til den udbredte, men forholdsvis lille produktion western blot teknik proteinanalyse. Fremgangsmåden tillader hundreder af prøver at være semi-kvantitativt analyseret og sammenlignet samtidig giver mulighed for direkte sammenligning af vigtige proteiner over et bredt udvalg af cellelinjer og vævsprøver. Multipleksering med forskellige antistofarter yderligere øger effekten af ​​teknikken tillader flere antistoffer, som anvendes samtidig. Eksemplet præsenteret her fremhæves evne RPPA i studiet af tumor heterogenitet og virkningen af ​​målrettet terapi på heterogenitet.

Som en teknik RPPA har en række kritiske faser af hvilket antistof valg er altafgørende. På grund af dot-blot arten af ​​teknikken antistofspecificitet ikke kan bekræftes under analysen og skal vurderes før anvendelse. I den aktuelle undersøgelse 83-antistoffer var gyldigelavet på western blots, hvoraf kun 58 igennem (ikke på ~ 30%). Af disse 58, gav 55-antistoffer acceptable resultater, når analyser af RPPA (95% succesrate). Andre kritiske skridt omfatter valg af en fusion til at spotte prøver på RPPA glider samt ensartethed pletblødning. En højere koncentration vil give mere følsomme resultater, men kan resultere i færre prøver at blive opdaget på grund af utilstrækkelig protein er til stede. Den minimale mængde væv, som vil give tilstrækkelig protein for RPPA spotting er tumor afhængig. For RCC mindst 50 mg blev anvendt som tillod flere sub dele af en tumor for at være analyser, mens der stadig opretholdes en spotting koncentration på 1 mg / ml. Ensartethed af spotting er også nøglen, da analysen antages, at alle prøver er spottet på en enkelt fusion, selv om dette kan kontrolleres ved hjælp af en total protein antistof efter slide spotting. Den sidste overvejelse er anvendelsen af ​​en kontrolprøve, der skal anvendes, når prøver tal er så høje, atde kan ikke blive opdaget på et enkelt dias som det var tilfældet i de eksempler her. I eksemplet her anvendte vi inkorporeret protein fra en nyre cellelinje samt fra en HUVEC-cellelinie som kontroller. Anvendelsen af ​​cellelinien protein tillader store mængder af proteiner, der skal ekstraheres og anvendes til flere objektglas. Styringen kompenserer for enhver iboende fejl på grund af pletblødning eller antistof inkubationer og kompenserer for afvigelser på grund af forskellige brugere og dias bliver brugt på forskellige dage.

RPPA som en teknik er fleksibel med hensyn til det antal prøver, der skal anvendes. De eksempler, der præsenteres her brugt ~ 300 prøver fra 45 tumorprøver, som blev fordelt på tre dias, med 2 puder på hver dias. Alternativt det aktuelle format kunne være blevet spottet på et enkelt dias med 1 pude. Som sådan formatet kan skræddersyes til de individuelle behov hos de eksperimenter, jo flere puder på et præparatglas jo flere antistoffer anvendes samtidig, men begrænser antallet af sampler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Arbejdet af forfattere FCO, DF, JN, DJH og GDS ovennævnte er finansieret af Chief Scientist Office, tilskud nummer: ETM37 og støttet af Cancer Research UK Forsøgscenter Cancer Medicin Centre. Arbejdet i AL er finansieret af Royal College of Surgeons i Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust for pleje og helbredelse af kræft og Medical Research Council. IO er understøttet af en Royal Society of Edinburgh skotske regering Fellowship samfinansieres af Marie Curie-aktiviteterne og det britiske Medical Research Council. Forfatterne vil gerne takke SCOTRRCC medansøgere og samarbejdspartnere for deres nyttige drøftelser om nogle af de diskuterede emner i dette papir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
aprotinin Sigma A6279
phosphatase inhibitor cocktail 2 Sigma P5726
phosphatase inhibitor cocktail 3 Sigma P0044
protease inhibitor cocktail Roche 11836153001
Triton X-100 Triton-X T8787
Li-Cor Odyssey Blocking Buffer Li-Cor 927-40000
TissueLyser Qiagen 85600
MicroGrid II robotic spotter Biorobotics
FastFrame' four bay slide holder Whatman 10486001
FAST Slide - 2-Pad Whatman 10485317
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG Licor 926-68020
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Licor 926-32211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
  2. Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
  3. Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
  4. Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
  5. Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
  6. Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
  7. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  8. O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
  9. Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
  10. Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
  11. Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
  12. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).

Tags

Cancer Biology Bioengineering medicin Biomedical Engineering Cellular Biology molekylærbiologi genetik Patologi Oncology Proteins tidlig påvisning af kræft Translationel Medical Research RPPA RCC heterogenitet Proteomics Tumor Grade intertumoral tumor metastatisk carcinoma renal cancer clear cell renal cell cancer cancer assay
Anvendelse af omvendt fase-protein Arrays (RPPA) at udforske Protein Expression Variation i de enkelte renalcellecarcinom Kræft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Mahony, F. C., Nanda, J., Laird,More

O'Mahony, F. C., Nanda, J., Laird, A., Mullen, P., Caldwell, H., Overton, I. M., Eory, L., O'Donnell, M., Faratian, D., Powles, T., Harrison, D. J., Stewart, G. D. The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers. J. Vis. Exp. (71), e50221, doi:10.3791/50221 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter