Summary
RPPA consente l'espressione della proteina di centinaia di campioni, stampati su vetrini nitrocellulosa da interrogare simultaneamente, utilizzando fluorescente anticorpi. Questa tecnica è stata applicata per studiare l'effetto di eterogeneità farmaco nel trattamento carcinoma a cellule renali chiare.
Abstract
Attualmente non esiste alcun trattamento curativo per carcinoma a cellule chiare metastatico a cellule renali, il più comune variante della malattia. Un fattore chiave in questa resistenza trattamento è pensato per essere la complessità molecolare della malattia 1. La terapia mirata come l'inibitore della tirosin-chinasi (TKI), sunitinib sono stati utilizzati, ma solo il 40% dei pazienti risponde, con la stragrande maggioranza di questi pazienti recidivanti entro 1 anno 2. Come tale la questione della resistenza intrinseca e acquisita nei pazienti con carcinoma renale delle cellule è molto importante 3.
Al fine di studiare la resistenza a TKIs, con l'obiettivo finale di sviluppare efficaci, trattamenti personalizzati, tessuti sequenziale dopo un determinato periodo di terapia mirata è necessario, un approccio che ha avuto successo in quattro mieloide cronica leucemia. Tuttavia l'applicazione di tale strategia nel carcinoma renale è complicata dal livello di bOTH eterogeneità inter-e intratumorale, che è una caratteristica del carcinoma renale 5,6 e altri tumori solidi 7. Eterogeneità Intertumoral a causa delle differenze trascrittomica e genetico è ben definito anche nei pazienti con presentazione simile, stadio e grado del tumore. Inoltre, è chiaro che vi è grande morfologica (intratumorale) eterogeneità in RCC, che rischia di rappresentare ancora maggiore eterogeneità molecolare. Mappatura dettagliata e classificazione dei tumori RCC di combinata analisi morfologica e classificazione Fuhrman consente la selezione di aree rappresentative per l'analisi proteomica.
Analisi a base di proteine del RCC 8 è interessante per la sua ampia disponibilità in laboratori di patologia, ma la sua applicazione può essere problematico a causa della limitata disponibilità di anticorpi specifici 9. A causa della natura dot blot delle matrici Reverse proteina di fase (RPPA), specificità anticorpale deve be pre-validato, in quanto tale controllo di qualità rigoroso di anticorpi utilizzati è di fondamentale importanza. Nonostante questa limitazione, il formato dot blot non consentono miniaturizzazione dosaggio, consentendo la stampa di centinaia di campioni su un vetrino nitrocellulosa singola. Diapositive stampate possono poi essere analizzate in modo simile ad analisi Western con l'uso di anticorpi specifici obiettivi primari e contrassegnati in modo fluorescente anticorpi secondari, consentendo multiplexing. Proteina espressione differenziale in tutti i campioni di una diapositiva possono essere analizzati simultaneamente confrontando il livello relativo di fluorescenza in un modo più conveniente e ad alta produttività.
Protocol
1. Identificazione di eterogeneità morfologica e molecolare del tumore
- Tumori rimossi dal congelatore -80 ° C e mantenuto in ghiaccio secco.
- Dividere i tumori in sezioni di circa 1 cm 3. Mappare la posizione originale di ogni sezione tumore rispetto all'altro ed etichetta con un nome univoco. Conservare i campioni in cryovials individuali a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Campioni Coat in ottobre e tagliare in un criostato a -22 ° C.
- I campioni colorati con ematossilina eosina e il metodo di contrasto.
- Analisi al microscopio di sezioni congelate per garantire che siano di natura CCRcc, tumore vitale e per la classificazione (di basso grado, di alto grado o misti alta / bassa qualità, difficile da differenziare gradi Fuhrman 1 a 4 su sezioni congelate). Figura 1 a & b (H & E colorazione di alta qualità bassa e mista).
- Selezionare fino a 4 campioni da ogni regione morfologicamente differenti all'interno di ogni tumore per l'estrazione delle proteine.
2. Estrazione di proteine da campioni tumorali
- Tagliare campione del tumore da ottobre
- Luogo 50-75 mg di tessuto in 2 ml provette con 990 pl di tampone di lisi [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCl] supplementato con aprotinina (Sigma A6279) (10 mg / ml), fosfatasi inibitore cocktail 2 (Sigma, P5716), cocktail di inibitori delle fosfatasi 3 (Sigma, P0044) e un cocktail di inibitori delle proteasi (Roche, 11.836.153,001 mila).
- Aggiungere un singolo 5 sfera in acciaio mm a ciascuna provetta e omogeneizzare a 50Hz per 5 minuti due volte utilizzando un TissueLyser, il controllo del livello di omogeneizzazione dopo ogni periodo di 5 minuti.
- Trasferimento campione omogeneizzato al nuovo 2 ml tubetto con pipetta lasciando la sfera d'acciaio dietro.
- Aggiungere 10 ml di Triton X-100 per ciascun campione prima centrifugazione a 13.000 xg per 30 min a 4 ° C.
- Trasferimento surnatanti ai tubi microcentrifuga freschi.
- Determinare la concentrazione di proteina mediante saggio BCA (Figura 2).
- Normalizzare le concentrazioni di proteine a 1 mg / ml.
3. Anticorpo di convalida
- Preparare campioni proteici (estratto da linee cellulari o di tessuto appropriati) per western blot ed eseguito su un 10% SDS-PAGE gel.
- Campioni di trasferimento su membrana di nitrocellulosa notte a 4 ° C.
- Bloccare la membrana in Li-Cor Buffer Odyssey blocco (50:50 diluito in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Diluire gli anticorpi primari in Li-Cor Buffer Odyssey Blocco (50:50 diluito in PBS) presso il produttore consiglia di diluizione in genere di 1 su 1000.
- Incubare membrana in anticorpi primari overnight a 4 ° C.
- Make up 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T, 1 ml Tween20 / 1L PBS).
- Lavare membrana in PBS-T a temperatura ambiente per 5 min (x3).
- Diluire fluorescente marcato anticorpi secondari nel tampone Odyssey blocco (50:50 diluito in PBS) 0,01% SDS a 1:10.000 diluizione (1,5 μl/15 ml).
- Incubare membrana secondariaanticorpi a temperatura ambiente per 45 minuti con agitazione delicata - è importante proteggere la membrana dalla luce fino a quando è stato finalmente scansione.
- Lavare membrana in PBS-T a temperatura ambiente per 5 min (x3), mantenendo la membrana al buio.
- Lavare membrana in PBS a temperatura ambiente per 5 min (x3) per rimuovere residui Tween20, mantenendo ancora la membrana al buio.
- Lie membrana piatta su un pezzo di carta da filtro al buio e lasciare asciugare all'aria - permettendo la membrana ad asciugare può migliorare il segnale e ridurre il fondo, ma renderlo inutile per mettere a nudo e ri-sondaggio.
- Scansione della membrana sullo scanner Odyssey licor. Mantenere la membrana al buio fino a quando non è stato analizzato.
- Solo selezionare anticorpi che generano una singola banda predominante il peso molecolare corretta. Figura 3 mostra esempi di anticorpi accettabili e inaccettabili per l'utilizzo con RPPA.
4. RPPA Printing
- Lisati proteici sono stati avvistati su nitrocellulosa rivestite con lastre di vetro (Whatman Fastslides-) con un microgrid II robot spotter. Le slide utilizzate conteneva 2 pastiglie su cui sono stati avvistati i campioni. Ogni pad è stata vista con campioni identici, in questo caso 100 campioni. Altri formati disponibili sono 1, 8 e 16 slide pad. Maggiore è il numero di pastiglie minore è il numero dei campioni che possono essere macchiati su ciascuna.
- Una serie di cinque 2-diluizioni sono state effettuate da ciascun campione e ciascun stato poi notato in triplicato (per un totale di 15 punti per campione).
5. RPPA proteine di rilevamento
- Vetrini bagnati nel buffer Licor eccesso di blocco (50:50 diluito in PBS). Incubare a temperatura ambiente per 1 ora su una piattaforma oscillante.
- Preparare 800 ml di anticorpi primari nel tampone Licor blocco (50:50 diluito in PBS), alle concentrazioni desiderate e tenerla in ghiaccio.
- Montare i vetrini in (i) la clip singolo chip corniceo (ii) l''FastFrame' quattro portavetrini baia modo che una tenuta stagna è formata tra la slitta e la camera di incubazione.
- Rimuovere i residui di tampone da pozzi e aggiungere 600 microlitri anticorpo primario rispettivi pozzetti.
- Posizionare il vetrino e la camera in una scatola sigillata bagnato e incubare in ballo piattaforma per una notte a 4 ° C.
- Costituiscono 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 pl Tween 20/100 ml PBS).
- Togliere i vetrini dalla camera fredda e rimuovere con attenzione gli anticorpi primari da ogni pozzetto.
- Aggiungere 600 pl di PBS-T e lavare i vetrini sulla piattaforma oscillante a temperatura ambiente per 5 min (X3).
- Preparare fluorescente marcati anticorpi secondari diluendo nel tampone Odyssey blocco (50:50 diluito in PBS) 0,01% SDS a 1:2.000 diluizione (1 pl / 2 ml) in prima istanza.
- Rimuovere tampone da pozzi e aggiungere 600 microlitri fluorescente-anticorpi marcati secondarie rispettivi pozzetti. Anticorpi secondari incubare a temperatura ambiente per 45 minuti con agitazione moderata - èè importante proteggere la membrana dalla luce fino a quando non è stato definitivamente scansione.
- Rimuovere anticorpi secondari da lavare bene e brevemente (x3) in 600 microlitri di PBS-T a temperatura ambiente. Rimuovere il vetrino dal vettore, trasferire in un contenitore adatto e lavare in eccesso PBS-T per 15 minuti, mantenendo la membrana al buio.
- Rimuovere PBS-T e membrana ulteriore lavaggio con PBS a temperatura ambiente per 15 minuti per rimuovere residui di Tween-20, mantenendo ancora la membrana al buio.
- Asciugare il Fastslide forno in 50 ° C per 10 minuti e quindi eseguire la scansione sul Li-Cor scanner Odyssey. Tenere il vetrino al buio fino a quando non è stato analizzato.
- Scansione del vetrino a 680 nm e / o 800 nm in funzione del anticorpo secondario / anticorpi utilizzati. Per i due colori di rilevamento utilizzare sempre altamente anticorpi secondari cross-adsorbite per ridurre al minimo di reattività crociata. Accurata selezione di anticorpi primari e secondari è necessario per due colori rilevamento. Di primaria importanza è la selezione didifferenti specie (es. coniglio e mouse) per i due anticorpi primari. In questo modo la discriminazione da anticorpi secondari anti-coniglio e anti-topo che sono contrassegnati con colorante con spettri di emissione facilmente distinguibili.
- I file di immagine vengono salvati come file TIFF.. Figura 4 (immagine di file sottoposti a scansione).
6. Analisi dei dati
- Lanciare il software MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).
- Aprire file di immagine. TIFF contenente la scansione della diapositiva RPPA.
- Selezionare un file modello predefinito che avrà una griglia per sovrapporre l'immagine della diapositiva RPPA.
- Fare clic sul definire le regioni di interesse (ROI) il pulsante, per visualizzare la griglia.
- Posizionare la griglia sopra le macchie RPPA. Figura 6a (immagine della griglia sopra l'immagine).
- Fare clic sul pulsante Seleziona tutto per evidenziare tutto il ROI.
- Fare clic su Trova tutti. MicroVigene si AUTOMticamente trovare il ROI, trovare i punti, sottrarre il fondo, rimuovere la polvere e quantificare i punti.
- Fare clic sul pulsante Visualizza Curve di diluizione per far apparire i risultati per tutti i campioni della diapositiva RPPA.
- Fare clic su Salva dati di diluizione.
- Dato che ciascun campione è stampato in 5 punti ciascuna diluizione in triplicato ci sono 15 punti da analizzare, che riduce il rischio di errori e migliora la qualità del montaggio di curva. MicroVigene produce un 4 parametri logistic-log modello di algoritmo "Supercurve" (Figura 6b), che incorpora tutti i punti di produrre una curva sigmoide di antigene-anticorpo cinetica di legame. Il presupposto è che lo stesso anticorpo-antigene cinetica di legame si svolge in ogni punto del campione, anche nei diversi campioni, quindi prendendo tutti i punti su un array per adattarsi a una curva di risposta comune può aumentare la fiducia del raccordo curva 10,11
Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
dove x è il dilution fattore e Y rappresenta l'intensità del segnale.
I campioni possono essere comparativamente analizzati utilizzando il valore y0, che nella nostra analisi corrispondeva al valore y nel punto medio dei valori di x dopo la mappatura quelli sul supercurve. - Esportare i dati in Microsoft Excel e trama y0 come in figura 7.
- Varianza proteina intratumorale è stato calcolato separatamente per i pazienti trattati non trattati e di quelli trattati in un quadro ANOVA. Distribuzioni varianza combinando i dati di tutte le proteine analizzati sono stati confrontati con un test Mann-Whitney (MWT). Varianze intratumorale di singole proteine sono stati confrontati con un F-test in cui le ipotesi di normalità e omoschedasticità tenuto, rispettivamente, valutati secondo i Lillefours e le prove Fligner; tasso di scoperta false (FDR) la correzione è stata applicata 12. Proteina espressione differenziale tra i campioni trattati e trattato è stato testato per ogni proteina usando studente t-test dove normalità e assunzione omoschedasticitàs sono state soddisfatte, altrimenti MWT è stata eseguita; FDR è stato applicato su valori combinati t-test e MWT 12. Significato dell'espressione proteica e varianza di correlazione di Pearson per le proteine sono state stimate utilizzando un approccio standard [R di riferimento] e FDR applicata 12.
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Representative Results
Un esempio di una diapositiva digitalizzata RPPA può essere visto in Figura 4 (i) sia con 680 e 800 nm canali visualizzati. Separate le immagini dalla lunghezza d'onda, la figura 4 (ii) permette a ciascun pad sul vetrino RPPA da analizzare e proteina espressione individuale determinato Figura 4 (iii). Come si può vedere nella Figura 4 (iii) l'espressione di proteine individuali attraverso i campioni è unico con Gelsolin ha un alto livello di espressione attraverso la diapositiva rispetto cMYC che ha una espressione della proteina molto inferiore, ma ancora universalmente espresso in tutti i campioni testato. In contrasto CD10 dato espressione variabile, con alcuni campioni dando un alto livello di espressione nonostante altri campioni aventi espressione poco o non rilevabile. Infine pJAK2 riuscito a produrre qualsiasi espressione della proteina rilevabile sopra il livello di sfondo. Da una prospettiva di controllo della qualità dei risultati di pJAK2 sarebbe inaccettabile mentre quelli diCD10 sarebbe accettabile a causa dei livelli di proteine rilevate espressione di un numero di campioni sul vetrino. Figura 5 mostra evidenzia la mancanza di reattività crociata tra anticorpi secondari e gli anticorpi primari di un'altra specie. Un esempio del Supercurve utilizzato per calcolare campioni attraverso una singola diapositiva può essere visto in Figura 6. Queste curve sono usati per produrre relativi dati di espressione basati su proteine come in Figura 7 (ac). Figura 7a mostra i livelli di espressione di una proteina rappresentativo di tutti i tre slitte RPPA evidenziando come RPPA può rilevare differenze tra i campioni trattati e non trattati. Figura 7b concentra sui livelli differenziali proteina espressione dopo i campioni di figura 7a sono stati raggruppati in base a trattamento, con espressione proteica superiore essendo risultata nel pretrattamento. Figura 7c concentra sulla intratumorale superiorevarianza per i campioni post trattamento dopo che i campioni sono stati raggruppati sulla base di trattamento, con una maggiore varianza essere trovati nei campioni post trattamento.
Figura 1a. Tessuto mappa campione di tessuto pre-trattamento con associata colorazione H & E di sezioni congelate
Figura 1b. Tissue mappa campione di tessuto dopo il trattamento con associato colorazione H & E di sezioni congelate
Figura 2. Predisposizione per il saggio Bradford per la determinazione delle proteine, icurva di calibrazione ncluding, tabella dei risultati e 96 formato pozzetti. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Esempi di anticorpi primari idonei e non idonei per l'uso con RPPA
Figura 4. Schema di flusso del processo di scansione RPPA. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6a. Montaggio della griglia su punti di scorrimento dei RPPA. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6b. Esempio di SuperCurve che viene utilizzato per l'analisi comparativa di tutti i campioni sulla diapositiva RPPA. Macchie verdi rappresentano "accettareabili "macchie e rosse rappresentano" outliers "basato su limiti predefiniti nel software di analisi.
Figura 6c. Esempio della riproducibilità dei campioni macchiati, nell'esempio illustrato include le macchie triplicato delle 5 diluizioni di un singolo campione oltre al vuoto.
Figura 7a. Tipica RPPA dati per una proteina (MLH1), rispetto più diapositive. Ciascun campione corrisponde ad una regione sub tumore.
Figura 7b. DifferentiAl espressione proteica per MLH1 per i campioni di trattamento pre e post.
Figura 7c. Varianza nel MLH1 espressione tra i campioni di trattamento pre e post.
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Discussion
Il metodo RPPA qui presentato rappresenta una valida alternativa ad alta velocità per il ampiamente utilizzato, ma relativamente basso tecnica blot velocità occidentale di analisi delle proteine. Il metodo permette centinaia di campioni da semi-quantitativamente analizzato e confrontato simultaneamente consentendo confronto diretto delle proteine chiave attraverso un'ampia selezione di linee cellulari e campioni di tessuto. Multiplexing con diverse specie anticorpali aumenta ulteriormente la potenza della tecnica che permette anticorpi multipli da utilizzare contemporaneamente. Nell'esempio qui presentato sottolinea la capacità di RPPA nello studio della eterogeneità tumorale e l'effetto della terapia mirata sulla eterogeneità.
Come tecnica RPPA ha un numero di fasi critiche di cui selezione anticorpo è fondamentale. A causa della natura dot blot della specificità dell'anticorpo tecnica non può essere confermata durante l'analisi e deve essere accertata prima dell'uso. In questo studio 83 anticorpi erano validicreati su Western blot di cui solo 58 passati (fail tasso di ~ 30%). Di questi 58, 55 anticorpi dato risultati accettabili quando le analisi su RPPA (95% di successo). Altri passi critici comprendono la selezione di una concentrazione di individuare campioni sulla RPPA scivola e uniformità di spotting. Una concentrazione più elevata darà risultati più sensibili, ma può comportare un minor numero di campioni di essere individuati a causa di carenze proteiche essere presenti. La quantità minima di tessuto, che forniscono proteine sufficiente per RPPA spotting è tumore dipendente. RCC per un minimo di 50 mg è stato usato che permetteva più sottosezioni di un tumore da analisi mentre ancora mantenuto una concentrazione individuazione di 1 mg / ml. Uniformità di spotting è anche la chiave come l'analisi presuppone che tutti i campioni sono macchiati ad un'unica concentrazione, anche se questo può essere verificata utilizzando un anticorpo totale di proteine dopo diapositiva spotting. La considerazione finale è l'uso di un campione di controllo da utilizzare quando i numeri campioni sono così alti chenon possono essere individuate su una singola diapositiva come era il caso negli esempi qui. Nell'esempio qui utilizzato abbiamo incorporato proteine da una linea di cellule renali e da una linea di cellule HUVEC come controlli. L'uso di proteine linea cellulare consente grandi quantità di proteine di essere estratto ed utilizzato per diapositive. Il controllo compensa qualsiasi errore intrinseco a causa di spotting o anticorpo incubazione e compensa le deviazioni dovute a diversi utenti e diapositive utilizzati in giorni diversi.
RPPA come tecnica è flessibile per quanto riguarda il numero di campioni da utilizzare. Gli esempi illustrati di seguito utilizzato ~ 300 campioni da 45 campioni tumorali che sono state distribuite su tre diapositive, con 2 cuscinetti su ogni diapositiva. In alternativa, il formato corrente potrebbe essere stato avvistato in una singola diapositiva con 1 pad. Come tale, il formato può essere adattato alle esigenze individuali degli esperimenti, le pastiglie più di una diapositiva gli anticorpi più possono essere utilizzati contemporaneamente, ma limitare il numero di samPLE.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il lavoro di autori FCO, DF, JN, DJH e GDS di cui sopra è finanziato dall'Ufficio Chief Scientist, un numero di concessione: ETM37 e sostenuto dal Centro di Cancer Research UK Medicina sperimentale sul cancro. Il lavoro di AL è finanziato dal Royal College of Surgeons di Edimburgo Robertson, il trust Melville per la cura e la cura del cancro e del Medical Research Council. IO è sostenuto da una borsa di studio della Royal Society di Edimburgo governo scozzese cofinanziato Azioni Marie Curie e il Medical Research Council britannico. Gli autori desiderano ringraziare SCOTRRCC co-candidati e collaboratori per le loro discussioni utili su alcuni degli argomenti trattati in questo documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
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