Summary
RPPA muliggjør protein uttrykk for hundrevis av prøver, trykt på nitrocellulose lysbilder å bli avhørt samtidig, ved hjelp av fluorescensmerkede antistoffer. Denne teknikken har blitt anvendt for å studere effekten av medikamentbehandling heterogenitet innenfor klarcellet nyrekarsinom.
Abstract
Foreløpig er det ingen kurativ behandling for metastatisk klarcellet nyrecellekreft, den vanligste varianten av sykdommen. En nøkkelfaktor i denne behandlingen resistens er antatt å være den molekylære kompleksitet sykdom 1. Målrettet terapi som tyrosinkinasehemmer (TKI)-sunitinib har blitt utnyttet, men bare 40% av pasientene vil reagere, med overveldende flertall av disse pasientene fikk tilbakefall innen ett år 2. Som sådan spørsmålet om egenverdi og ervervet resistens i nyre celle kreftpasienter er svært relevant 3.
For å studere motstand mot TKIs, med det endelige mål om å utvikle effektive, personlige behandlinger, sekvensiell vev etter en bestemt periode målrettet terapi nødvendig, en tilnærming som hadde vist seg vellykket i kronisk myelogen leukemi 4. Men anvendelsen av en slik strategi i nyrecellekarsinom kompliseres av det høye nivået av bOTH inter-og intratumoral heterogenitet, som er et trekk av nyrecellekarsinom 5,6 samt andre solide tumorer 7. Intertumoral heterogenitet grunn transcriptomic og genetiske forskjeller er godt etablert, selv hos pasienter med lignende presentasjon, scene og grad av tumor. I tillegg er det klart at det er stor morfologiske (intratumoral) heterogenitet i RCC, som er sannsynlig å representere enda større molekylær heterogenitet. Detaljert kartlegging og kategorisering av RCC svulster ved kombinert morfologisk analyse og Fuhrman gradering tillater valg av representative områder for proteomikk analyser.
Protein analyse av RCC 8 er attraktiv på grunn av sin utbredte tilgjengeligheten i patologi laboratorier, men kan sin søknad være problematisk på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av spesifikke antistoffer 9. På grunn av dot blot natur omvendt fase Protein Arrays (RPPA), antistoffspesifisitet må be pre-validert, slik streng kvalitetskontroll av antistoffer som brukes er av overordnet betydning. Til tross for denne begrensningen dot blot format tillater analysen miniatyrisering, noe som åpner for utskrift av hundrevis av prøver på et enkelt nitrocellulose lysbilde. Trykte lysbilder kan deretter bli analysert på en lignende måte til Western analyse med bruk av target spesifikke primære antistoffer og fluorescensmerkede sekundære antistoffer, slik at for multipleksing. Differensiell proteinekspresjon tvers av alle prøvene på et lysbilde kan da bli analysert samtidig ved å sammenligne den relative nivået av fluorescens på en mer kostnadseffektiv og high-throughput måte.
Protocol
1. Identifikasjon av morfologiske og molekylære Tumor heterogenitet
- Svulster fjernet fra -80 ° C fryser og holdt på tørris.
- Dele svulster i seksjoner på ca 1 cm 3. Kartlegge utgangsposisjonen av hver tumor seksjon i forhold til hverandre og etikett med et unikt navn. Oppbevar prøvene i enkelte kryorør ved -80 ° C til den er klar til bruk.
- Pels prøver i oktober og kutte i en kryostaten ved -22 ° C.
- Prøvene farges ved hjelp Hematoxylin og Eosin kontrafarging metoden.
- Mikroskopi analyse av frosne deler for å sikre at de er av ccRCC natur, levedyktig svulst og for gradering (lav karakter, høy klasse eller blandet lav / høy klasse, utfordrende å skille Fuhrman grad 1 til 4 på frosne delen). Figur 1 a & b (H & E flekker av høy lav og blandet klasse).
- Velge opptil 4 prøver fra hver morfologisk ulik region innen hver tumor for protein utvinning.
2. Protein Extraction fra tumorprøver
- Skjær svulst prøve fra oktober
- Plass 50-75 mg av vev inn i 2 ml rør med 990 pl av lyseringsbuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCl] supplert med aprotinin (Sigma A6279) (10 mg / ml), fosfatase-inhibitor cocktail 2 (Sigma, P5716), fosfatase-inhibitor 3 cocktail (Sigma, P0044) og en protease inhibitor cocktail (Roche, 11836153001).
- Legge til et enkelt 5 mm stålkule til hvert rør og homogenisere ved 50Hz for 5 minutter to ganger ved hjelp av en TissueLyser, kontrollere nivået av homogenisering etter hver 5 min periode.
- Overføre homogenisert prøve til ny 2 ml tube med pipette forlater stål ball bak.
- Tilsett 10 pl av Triton X-100 til hver prøve før sentrifugering ved 13.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
- Overføre supernatanter til ferske mikrosentrifugerør.
- Bestem proteinkonsentrasjon hjelp BCA analyse (Figur 2).
- Normalisere protein konsentrasjoner på 1 mg / ml.
3. Antistoff Validering
- Forbered proteinprøver (ekstrahert fra egnede cellelinjer eller vev) for Western blot og kjørt på en 10% SDS-PAGE-gel.
- Overføre prøvene på nitrocellulose membran over natten ved 4 ° C.
- Blokker membranen i Li-Cor Odyssey Blocking Buffer (fortynnet 50:50 i PBS) i 1 time ved romtemperatur.
- Fortynne de primære antistoffer i Li-Cor Odyssey Blokkering Buffer (fortynnet 50:50 i PBS) på produsentene anbefalte fortynning typisk 1 i 1000.
- Inkuber membran i primære antistoffer over natten ved 4 ° C.
- Utgjør 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 1 ml Tween20 / 1L PBS).
- Vask membran i PBS-T ved romtemperatur i 5 minutter (x3).
- Fortynn fluorescently-merket sekundære antistoffer i Odyssey Blokkering Buffer (fortynnet 50:50 i PBS) 0.01% SDS ved 1:10.000 fortynning (1,5 μl/15 ml).
- Inkuber membran i videregåendeantistoffer ved romtemperatur i 45 minutter med forsiktig risting - det er viktig å beskytte membranen fra lyset inntil det er endelig skannet.
- Vask membran i PBS-T ved romtemperatur i 5 minutter (x3), og holder membranen i mørket.
- Vask membranen i PBS ved romtemperatur i 5 minutter (x3) for å fjerne gjenværende Tween20, igjen holde membranen i mørket.
- Ligg membran flatt på et stykke filterpapir i mørket og lufttørke - tillater membranen tørke kan forsterke signalet og redusere bakgrunnsstøy men gjøre den ubrukelig for stripping og re-sondering.
- Skanne membran på Licor Odyssey skanneren. Hold membranen i mørket inntil det har blitt skannet.
- Bare velge antistoffer som genererer en enkelt dominerende bånd på riktig molekylvekt. Figur 3 viser eksempler på akseptable og uakseptable antistoffer for bruk med RPPA.
4. RPPA Printing
- Protein lysates ble oppdaget på nitrocellulose-belagte glassplater (Fastslides-Whatman) ved hjelp av en MicroGrid II robot spotter. Lysbildene som brukes inneholdt 2 pads på hvor prøvene ble oppdaget. Hver blokk ble flekket med identiske prøver, i dette tilfellet 100 prøver. Andre tilgjengelige formater inkluderer 1, 8 og 16 pad lysbilder. Jo høyere antallet av elektrodene mindre antall prøver som kan sees på hver.
- En serie på fem 2-fold fortynninger ble laget av hver prøve og hver ble deretter flekket i triplikat (resulterer i totalt 15 flekker per prøve).
5. RPPA Protein Detection
- Våte lysbilder i overkant Licor Blokkering Buffer (fortynnet 50:50 i PBS). Inkuber ved RT i 1 time på en gyngende plattform.
- Forbered 800 pl av primære antistoffer i licor Blokkering Buffer (fortynnet 50:50 i PBS) ved de ønskede konsentrasjoner og holde på is.
- Monter lysbildene i enten (i) enkeltbilde Chip Clipeller (ii) den 'FastFrame' fire bay lysbildeholder slik at en tett forsegling dannes mellom lysbildet og inkubering kammeret.
- Fjerne rester buffer fra brønner og legge 600 ul primære antistoff mot respektive brønner.
- Plasser lysbildet og kammeret i en forseglet boks våt og inkuber på rock plattform over natten ved 4 ° C.
- Gjøre opp 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 ul Tween 20/100 ml PBS).
- Fjern lysbilder fra kjølerommet, og fjern forsiktig den primære antistoffer fra hver brønn.
- Legg 600 pl PBS-T og vask lysbilder på rock plattform ved RT i 5 min (X3).
- Forbered fluorescently-merket sekundære antistoffer ved å fortynne i Odyssey Blokkering Buffer (fortynnet 50:50 i PBS) 0.01% SDS ved 1:2,000 fortynning (1 pl / 2 ml) i første omgang.
- Fjern buffer fra brønner og legge 600 ul fluorescently-merket sekundære antistoffer mot respektive brønner. Inkuber sekundære antistoffer ved romtemperatur i 45 minutter med forsiktig risting - deter viktig å beskytte membranen fra lyset inntil det er endelig skannet.
- Fjern sekundære antistoffer fra brønn og kort vask (x3) i 600 pl PBS-T ved romtemperatur. Fjern lysbilde fra transportør, overføre til en egnet beholder og vask i overkant PBS-T i 15 min, holde membranen i mørket.
- Fjern PBS-T og videre vask membran med PBS ved romtemperatur i 15 minutter for å fjerne gjenværende Tween-20, igjen holde membranen i mørket.
- Tørk Fastslide i 50 ° C ovnen i 10 min og deretter skanne på Li-Cor Odyssey skanner. Hold lysbilde i mørket før den har blitt skannet.
- Skanne lysbildet på 680 nm og / eller 800 nm avhengig sekundært antistoff / antistoffer som brukes. For to-fargegjenkjenning alltid bruker svært tvers adsorberte sekundære antistoffer for å minimere kryssreaksjon. Nøye utvalg av primære og sekundære antistoffer som er nødvendig for to-farge deteksjon. Av avgjørende betydning er utvalget avforskjellige vertssystemer arter (f.eks kanin og mus) for de to primære antistoffer. Dette tillater diskriminering av anti-kanin-og anti-mus sekundære antistoffer som er merket med fargestoff med lett skjelnes emisjons spektra.
- Bildefiler lagres som. Tiff-filer. Figur 4 (bilde av skannede filer).
6. Dataanalyse
- Start MicroVigene Software (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).
- Åpne. Tiff image-fil som inneholder skanning av RPPA lysbildet.
- Velg en forhåndsdefinert mal fil som vil ha et rutenett for å legge over bildet av RPPA lysbildet.
- Klikk Define Regions of Interest (ROI)-knappen for å få opp Grid.
- Plasser rutenett over RPPA flekker. Figur 6a (bilde av rutenett over bildet).
- Klikk på Velg alle for å markere hele avkastningen.
- Klikk Søk etter alle. MicroVigene vil autommatisk finne ROI, finne spots, trekke bakgrunnen, fjerne støv og kvantifisere flekker.
- Klikk på Vis Fortynning Curve-knappen for å få opp resultatene for alle prøvene på RPPA lysbilde.
- Klikk på Lagre Fortynningskrav Data.
- Som hver prøve er trykt over 5 fortynning poeng hver i tre eksemplarer er det 15 poeng å analysere, noe som reduserer risikoen for feil og forbedrer kvaliteten på kurvetilpasning. MicroVigene produserer en 4-parameter logistisk-log modellen "Supercurve" algoritmen (figur 6b), som inkorporerer alle flekker å produsere en sigmoid kurve av antigen-antistoff-binding kinetikk. Forutsetningen er at de samme antistoff-antigenbindende kinetikk foregår på hvert prøvetidspunkt spot, selv i de forskjellige prøver, og dermed ved å ta alle flekker på en matrise slik at den passer en vanlig reaksjon kurve kan øke tilliten til kurvetilpasning 10,11
Y = a + ((BA) / (1 + e (c * d-ln (x)))
der x er dilution faktor og Y er signalintensiteten.
Prøver kan forholdsvis analyseres ved hjelp av y0 verdi, som i vår analyse tilsvarte y verdien på midtpunktet av x-verdiene etter kartlegge dem på supercurve. - Eksportere data i Microsoft Excel og tomten y0 som i Figur 7.
- Intratumoral protein variansen ble beregnet separat for ubehandlet og behandlet pasienter behandlet i en ANOVA rammeverk. Varians distribusjoner som kombinerer data fra alle de analyserte proteiner ble sammenlignet med en Mann-Whitney test (MWT). Intratumoral avvik for enkelte proteiner ble sammenlignet med en F-test hvor forutsetninger til normalitet og homoscedasticity holdt, vurderes henholdsvis bruker Lillefours og Fligner tester, falsk funnrate (FDR) korreksjon ble brukt 12. Differential protein expression mellom ubehandlet og behandlet pasientprøver ble testet for hvert protein ved hjelp av student t-test der normalitet og homoscedasticity forutsetnings ble møtt, ellers MWT ble utført, FDR ble lagt over kombinerte t-test og MWT verdier 12. Betydningen av protein uttrykk og varians Pearson korrelasjon for proteinene ble estimert ved hjelp av en standard tilnærming [R referanse] og FDR brukt 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på en skannet RPPA lysbilde kan sees i Figur 4 (i) med både 680 og 800 nm kanaler vist. Skille bildene ved bølgelengde, figur 4 (ii) gjør at hver blokk på RPPA lysbildet som skal analyseres og individuell protein ekspresjon bestemmes Figur 4 (iii). Som kan sees i figur 4 (iii) ekspresjon av individuelle proteiner tvers prøvene er unikt med Gelsolin har et høyt nivå av ekspresjon over lysbildet sammenlignet cMYC som har en mye lavere protein ekspresjon, men fortsatt universelt uttrykt på tvers av alle prøvene testet. I motsetning CD10 ga variabel uttrykk, med visse prøver gir et høyt nivå av ekspresjon til tross for andre prøver med liten eller ingen ekspresjon påvisbar. Endelig pJAK2 ikke klarte å produsere noen påviselig protein uttrykk over bakgrunnsnivå. Fra et kvalitetskontroll perspektiv resultatene av pJAK2 ville være uakseptabelt, mens de avCD10 ville være akseptabelt på grunn av de oppdagede protein expression nivåer av en rekke prøver på lysbildet. Figur 5 viser fremhever manglende kryssreaktivitet mellom sekundære antistoffer og primære antistoffer av en annen art. Et eksempel på Supercurve brukes til å beregne prøvene over et enkelt lysbilde kan sees i figur 6. Disse kurvene er brukt til å produsere relativ proteinbaserte uttrykk data som i fig 7 (AC). Figur 7a viser uttrykket nivåer av et representativt protein over tre RPPA lysbilder utheving hvordan RPPA kan oppdage forskjeller mellom behandlede og ubehandlede prøver. Figur 7b fokuserer på differensial protein expression nivåer etter prøvene fra figur 7a er gruppert basert på behandling, med høyere protein ekspresjon blir funnet å være i forbehandling. Figur 7c fokuserer på høyere intratumoralvarians for de etter behandlingen prøver etter at prøvene er gruppert basert på behandling, med høyere varians blir funnet i innlegget behandling prøvene.
Figur 1a. Vevsprøve kart over pre behandling vev med tilhørende H & E farging av frosne seksjoner
Figur 1b. Vevsprøve kart over etterbehandling vev med tilhørende H & E farging av frosne seksjoner
Figur 2. Sett opp for Bradford analysen for protein besluttsomhet, jegncluding kalibreringskurve, resultater bord og plate med 96 brønner format. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Eksempler på egnede og uegnet primære antistoffer for bruk med RPPA
Figur 4. Flow diagram av RPPA skanning prosess. Klikk her for å se større figur .
Figur 6a. Montering rutenettet på RPPA lysbilde Spots. Klikk her for å se større figur .
Figur 6b. Eksempel SuperCurve som brukes for sammenlignende analyse av alle prøvene på RPPA lysbildet. Grønne flekker representerer "godtastand "flekker og røde representerer" outliers "basert på forhåndsdefinerte grenser i analysen programvare.
Figur 6c. Eksempel på reproduserbarheten flekket prøvene omfatter eksempel vist triplikate flekker av de 5 fortynninger av en enkelt prøve i tillegg til den tomme.
Figur 7a. Typisk RPPA data for et protein (MLH1), sammenlignet på tvers av flere lysbilder. Hver prøve tilsvarer en svulst sub region.
Figur 7b. Differensiertal protein uttrykk for MLH1 for pre og post behandling prøver.
Figur 7c. Varians i MLH1 uttrykk mellom før og etter behandling prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den RPPA metoden presentert her representerer en høy gjennomstrømning alternativ til den mye brukte men relativt lav gjennomstrømming Western blot teknikk av protein analyse. Fremgangsmåten tillater hundrevis av prøver for å være semi-kvantitativt analysert og sammenlignet samtidig muliggjør direkte sammenligning av sentrale proteiner over et bredt utvalg av cellelinjer og vevsprøver. Multipleksing med forskjellige antistoff arter øker ytterligere effekten av teknikken slik at flere antistoffer som skal brukes samtidig. Eksempelet presenteres her fremhever evne RPPA i studiet av svulsten heterogenitet og effekten av målrettet terapi på heterogenitet.
Som en teknikk RPPA har en rekke kritiske trinnene hvorav antistoff utvalget er akutt. Grunnet til dot blot natur teknikken antistoffspesifisitet kan ikke bekreftes under analysen og må fastslås før bruk. I denne studien 83 antistoffer var gyldigrerte på vestlige blots av hvor kun 58 passert (fail hastighet på ~ 30%). Av disse 58, ga 55 antistoffer akseptable resultater når analysene på RPPA (95% suksess rate). Andre kritiske trinn omfatter valg av en konsentrasjon å oppdage prøver på RPPA glir samt ensartethet spotting. En høyere konsentrasjon vil gi mer sensitive resultater, men kan resultere i færre prøver blir oppdaget på grunn av utilstrekkelig protein er til stede. Det minste beløpet av vev som vil gi tilstrekkelig protein for RPPA fange er svulst avhengige. For RCC minimum 50 mg ble brukt som tillot flere sub seksjoner av en svulst for å være analyser samtidig opprettholdt et spotting konsentrasjon på 1 mg / ml. Ensartethet av spotting er også viktig som analysen forutsetter at alle prøvene er oppdaget i en enkel konsentrasjon, selv om dette kan bekreftes ved hjelp av en total protein antistoff etter lysbilde fange. Endelig vederlag er bruken av en kontrollprøve for å brukes når prøver tallene er så høye atde kan ikke bli oppdaget på et enkelt lysbilde som var tilfellet i eksemplene her. I eksempelet som er brukt her innlemmet vi protein fra en renal cellelinje samt fra en HUVEC cellelinje som kontroller. Bruken av cellelinje protein kan store mengder av proteiner som skal trekkes og brukes for flere lysbilder. Kontrollen kompenserer for eventuelle egenverdi feil på grunn av småblødninger eller antistoff inkubasjoner og kompenserer for avvik som skyldes ulike brukere og lysbilder som brukes på ulike dager.
RPPA som en teknikk er fleksibel med hensyn til hvor mange prøver som skal brukes. Eksemplene som presenteres her brukes ~ 300 prøver fra 45 tumorprøver som ble spredt over tre lysbilder, med 2 pads på hvert lysbilde. Alternativt gjeldende format kunne ha blitt sett på et enkelt lysbilde med en pad. Som sådan formatet kan skreddersys til den enkeltes behov forsøkene, kan flere pads på et lysbilde jo flere antistoffer brukes samtidig, men begrense antall samsipper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Arbeidet med forfatterne FCO, DF, JN, DJH og GDS nevnt ovenfor er finansiert av Chief Scientist Office, prosjekt nummer: ETM37 og støttes av Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre. Arbeidet med AL er finansiert av Royal College of Surgeons i Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust for omsorg og helbredelse av kreft og Medical Research Council. IO er støttet av en Royal Society of Edinburgh skotske regjeringen Fellowship cofunded av Marie Curie Actions og Storbritannia Medical Research Council. Forfatterne ønsker å takke SCOTRRCC co-søkere og samarbeidspartnere for deres nyttige diskusjoner om noen av temaene i denne artikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
