Summary
RPPA möjliggör proteinexpression av hundratals prover, tryckta på nitrocellulosa objektglas som skall utfrågas samtidigt, med fluorescensmärkta antikroppar. Denna teknik har tillämpats för att studera effekten av läkemedelsbehandling heterogenitet inom klarcellig njurkarcinom.
Abstract
För närvarande finns ingen botande behandling för metastaserande klarcellig njurcellscancer, den vanligaste varianten av sjukdomen. En viktig faktor i denna behandling motstånd tros vara den molekylära komplexiteten av sjukdomen 1. Targeted therapy såsom tyrosinkinashämmare (TKI)-sunitinib har utnyttjats, men endast 40% av patienterna kommer att svara med den överväldigande majoriteten av dessa patienter fick återfall inom 1 år 2. Som sådan frågan om inneboende och förvärvad resistens i njurcancerpatienter är högst relevant 3.
För att studera resistens mot TKIs, med det yttersta målet att utveckla effektiva och individuellt anpassade behandlingar är sekventiell vävnad efter en viss period av targeted therapy krävs en strategi som har visat sig vara framgångsrik i kronisk myeloisk leukemi 4. Men tillämpningen av en sådan strategi i njurcellscancer kompliceras av den höga bOTH tvär-och intratumoral heterogenitet, som är en funktion av njurcellscancer 5,6 samt andra solida tumörer 7. Intertumoral heterogenitet på grund av transcriptomic och genetiska skillnader är väl etablerad även hos patienter med liknande presentation, scen och grad av tumör. Dessutom är det tydligt att det finns en stor morfologiska (intratumoral) heterogenitet i RCC, som sannolikt kommer att representera ännu större molekylär heterogenitet. Detaljerad kartläggning och kategorisering av RCC tumörer genom kombinerad morfologisk analys och Fuhrman gradering möjliggör val av representativa områden för proteomik analys.
Protein analys av RCC 8 är attraktiv på grund av dess omfattande tillgänglighet i patologi laboratorier, men kan tillämpningen vara problematisk på grund av den begränsade tillgången på specifika antikroppar 9. På grund av dot blot natur Reverse Arrays fasprotein (RPPA), antikroppar specificitet måste be förväg godkänd, som sådan strikt kvalitetskontroll av begagnade antikroppar är av största vikt. Trots denna begränsning dot blot-formatet gör att analysen miniatyrisering, vilket möjliggör tryckning av hundratals prover på en enda nitrocellulosa bild. Tryckta objektglas kan sedan analyseras på ett liknande sätt som Western-analys med användning av målspecifika primära antikroppar och fluorescent märkta sekundära antikroppar, vilket möjliggör multiplexering. Differentiellt proteinuttryck över alla prover på en slid kan sedan analyseras samtidigt genom att jämföra den relativa nivån av fluorescens i en mer kostnadseffektiv och hög genomströmning sätt.
Protocol
1. Identifiering av morfologiska och molekylära tumör Heterogenitet
- Tumörer avlägsnades från -80 ° C frys och hölls på torr is.
- Dela tumörer i sektioner av ungefär 1 cm 3. Kartlägga det ursprungliga läget för varje tumör sektion i förhållande till varandra och etikett med ett unikt namn. Förvara proverna i enskilda kryokärl vid -80 ° C tills redo för användning.
- Coat prover i oktober och skär i en kryostat vid -22 ° C.
- Prover färgades med hematoxylin och eosin motfärgning metod.
- Mikroskopi analys av frusna delar för att säkerställa att de är av ccRCC natur, livskraftig tumör och betygssättning (låg kvalitet, hög kvalitet eller blandade låg / hög kvalitet, utmanande att skilja Fuhrman kvaliteter från 1 till 4 på fryst avsnitt). Figur 1 A & B (H & E färgning hög låg och blandad kvalitet).
- Välj upp till 4 prover från varje morfologiskt olika region inom varje tumör för protein extraktion.
2. Proteinextraktion från tumörprover
- Skär tumörprov från oktober
- Placera 50-75 mg vävnad i 2 ml rör med 990 pl lysbuffert [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCl] kompletterat med aprotinin (Sigma A6279) (10 mg / ml), fosfatas-inhibitor cocktail 2 Sigma (, P5716), fosfatas-inhibitor cocktail 3 (Sigma, P0044) och en proteasinhibitorcocktail (Roche, 11836153001).
- Lägg till en enstaka kula 5 mm stål till varje rör och homogenisera vid 50Hz under 5 minuter två gånger med en TissueLyser, kontroll av nivån av homogenisering efter varje 5 minuters period.
- Överför homogeniserade provet till ny 2 ml rör med pipett lämnar stålkulan bakom.
- Tillsätt 10 | il Triton X-100 till varje prov före centrifugering vid 13.000 xg i 30 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanterna till nya mikrocentrifugrör.
- Bestäm proteinkoncentrationen med BCA-analys (figur 2).
- Normalisera proteinkoncentrationer vid 1 mg / ml.
3. Antikropp Validering
- Förbered proteinprover (extraherat från lämpliga cellinjer eller vävnad) för western blöt och kördes på en 10% SDS-PAGE-gel.
- Överför proverna till nitrocellulosamembran natten vid 4 ° C.
- Blockera membranet i Li-Cor Odyssey Blocking Buffer (utspädd 50:50 i PBS) under 1 timme vid rumstemperatur.
- Späd de primära antikropparna i Li-Cor Odyssey blockeringsbuffert (utspädd 50:50 i PBS) vid tillverkarens rekommenderade utspädnings typiskt 1 i 1.000.
- Inkubera membran i primära antikroppar över natten vid 4 ° C.
- Make up 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T, 1 ml Tween 20 / 1L PBS).
- Tvätta membran i PBS-T vid rumstemperatur under 5 minuter (x3).
- Späd fluorescensmärkt sekundära antikroppar i Odyssey Blocking Buffer (utspädd 50:50 i PBS) 0,01% SDS vid 1:10.000 utspädning (1,5 μl/15 ml).
- Inkubera membran i sekundärantikroppar vid rumstemperatur under 45 minuter med försiktig skakning - det är viktigt att skydda membranet från ljuset tills det har äntligen skannats.
- Tvätta membran i PBS-T vid rumstemperatur under 5 minuter (x3), varvid membranet i mörker.
- Tvätta membran i PBS vid rumstemperatur under 5 minuter (x3) för att avlägsna kvarvarande Tween 20, återigen hålla membranet i mörker.
- Lie membran platt på en bit filterpapper i mörker och låt lufttorka - låta membranet torka kan öka signalen och minska bakgrunden men göra den oanvändbar för strippning och åter sondering.
- Skanna membranet på licor Odyssey skannern. Förvara membranet i mörker tills det har skannats.
- Bara välja antikroppar som genererar en enda dominerande band vid den korrekta molekylvikten. Figur 3 visar exempel på acceptabla och oacceptabla antikroppar för användning med RPPA.
4. RPPA Printing
- Proteinlysat sågs på nitrocellulosa-belagda objektglas (Fastslides-Whatman) med en mikronät II robot spotter. De använda bilderna innehöll 2 kuddar på vilka proverna sågs. Varje kudde sågs med identiska prover, i detta fall 100 prover. Andra tillgängliga format inkluderar 1, 8 och 16 glider pad. Ju högre antalet dynor det mindre antalet sampel som kan upptäckas på varje.
- En serie av fem 2-faldiga utspädningar gjordes från varje prov och varje därefter spotted i tre exemplar (resulterar i totalt 15 fläckar per prov).
5. RPPA protein detektion
- Våta bilder utöver licor blockeringsbuffert (utspädd 50:50 i PBS). Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme på en gungande plattform.
- Bered 800 il primära antikroppar i licor blockeringsbuffert (utspädd 50:50 i PBS) vid de önskade koncentrationerna och hålla på is.
- Montera bilderna i antingen (i) den enda bildruta Chip Clipeller (ii) "FastFrame" fyra fack hållare så att en tät försegling bildas mellan bild och inkubationskammaren.
- Avlägsna återstående buffert från brunnarna och tillsätt 600 pl primär antikropp till respektive brunnar.
- Placera bilden och kammaren i en förseglad våt ruta och inkubera på gungande plattform över natten vid 4 ° C.
- Make up 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T, 100 ^ Tween 20/100 ml PBS).
- Ta bilder från kylrum och ta försiktigt bort de primära antikropparna från varje brunn.
- Lägg 600 pl PBS-T och tvätta objektglas på svängbara plattformen vid RT under 5 minuter (X3).
- Förbered fluorescensmärkta sekundära antikroppar genom utspädning i Odyssey Blocking Buffer (utspädd 50:50 i PBS) 0,01% SDS vid 1:2000 spädning (1 pl / 2 ml) i första hand.
- Avlägsna buffert från brunnarna och tillsätt 600 pl fluorescent-märkta sekundära antikroppar till respektive brunnar. Inkubera sekundära antikroppar vid rumstemperatur under 45 min med försiktig skakning - detär viktigt att skydda membranet från ljus tills den slutligen har skannats.
- Avlägsna sekundära antikroppar från väl och kortfattat tvätt (x3) i 600 pl PBS-T vid rumstemperatur. Ta bild från bärare, överför till en lämplig behållare och tvätta i överskott PBS-T för 15 minuter, hålla membranet i mörker.
- Avlägsna PBS-T och vidare tvätt membran med PBS vid rumstemperatur under 15 min för att avlägsna kvarvarande Tween-20, återigen hålla membranet i mörker.
- Torka Fastslide i 50 ° C ugn i 10 min och sedan scanna på Li-Cor Odyssey skanner. Håll bilden i mörker tills den har skannats.
- Skanna bilden vid 680 nm och / eller 800 nm beroende på den sekundära antikroppen / använda antikroppar. För två-färgavkänning alltid högt över adsorberade sekundära antikroppar för att minimera korsreaktivitet. Noggrant urval av primära och sekundära antikroppar är nödvändig för tvåfärgad upptäckt. Av primär betydelse är valet avolika värdarter (t.ex. kanin och mus) för de två primära antikropparna. Detta gör diskriminering av anti-kanin och anti-mus sekundära antikroppar som är märkta med färg med lätt urskiljbara emissionsspektra.
- Bildfiler sparas som. TIFF-filer.. Figur 4 (bild av skannade filer)
6. Dataanalys
- Starta MicroVigene Software (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).
- Öppna. Tiff-bildfil innehåller skanningen av RPPA bilden.
- Välj en fördefinierad mall fil som kommer att ha ett rutnät att överlagra på bilden för RPPA bilden.
- Klicka Definiera områden av intresse (ROI) knappen för att få upp nätet.
- Placera rutnät över RPPA fläckar. Figur 6a (bild av rutnät över bilden).
- Klicka på knappen Markera alla för att markera alla ROI.
- Klicka på Sök alla. MicroVigene kommer Autommatiskt hitta ROI, hitta fläckarna, subtrahera bakgrunden, ta bort damm och kvantifiera fläckar.
- Klicka på knappen Visa spädningskurva att få upp resultaten för alla prover på RPPA bilden.
- Klicka på Spara Utspädning data.
- Eftersom varje prov skrivs ut över 5 utspädning poäng vardera i tre exemplar finns 15 poäng att analysera, vilket minskar risken för fel och förbättrar kvaliteten på kurvan montering. MicroVigene producerar en 4-parameters logistisk-log modell "Supercurve" algoritmen (figur 6b), som införlivar alla fläckar för att producera en sigmoid kurva av antigen-antikropp-bindande kinetik. Antagandet är att samma antikropp-antigen bindande kinetik sker vid varje prov plats, även i de olika proverna, vilket genom att alla fläckar på en rad för att passa en gemensam responskurva kan öka förtroendet för kurvanpassning 10,11
Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
där x är dilutioN faktor och Y är signalintensiteten.
Prover kan jämförelsevis analyseras med hjälp av y0 värde, vilket i vår analys motsvarade y-värdet vid mittpunkten av x värden efter mappning dem på supercurve. - Exportera data i Microsoft Excel och tomt y0 som i Figur 7.
- Intratumoral protein varians beräknades separat för obehandlade och behandlade patienter i en ANOVA ram. Variance distributioner kombinera data från alla analyserade proteiner jämfördes med en Mann-Whitney-test (MWT). Intratumoral avvikelser för enskilda proteiner jämfördes med ett F-test, där antaganden om normalitet och homoscedasticity hålls, värderade respektive använder Lillefours och tester Fligner, falska upptäckt ränta (FDR) korrigering tillämpades 12. Differentiell proteinexpression mellan obehandlade och behandlade patientprover testades för varje protein med användning av Students t-test, där normalitet och homoscedasticity antagandes var uppfyllda, annars MWT utfördes, FDR applicerades över kombinerade t-test och MWT värden 12. Betydelse av proteinuttryck och varians Pearson korrelation för proteinerna uppskattades med hjälp av en standardiserad metod [R referens] och FDR tillämpas 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på en scannad bild RPPA kan ses i figur 4 (i) med både 680 och 800 nm visas kanaler. Separera bilderna från våglängden, figur 4 (ii) kan varje pad på RPPA bilden som ska analyseras och individuella proteinuttryck bestämd Figur 4 (iii). Såsom kan ses i Figur 4 (iii) uttrycket av individuella proteiner över proverna är unik med Gelsolin har en hög nivå av expression över sliden jämfört med cMYC som har en mycket lägre proteinexpression, men ändå allmänt uttryckt i alla prover testas. I motsats CD10 gav variabel uttryck, med vissa prover ger en hög nivå av uttryckning trots andra prover med liten eller ingen detekterbar uttryckning. Slutligen pJAK2 misslyckades att producera något detekterbart proteinuttryck över bakgrundsnivån. Ur en kvalitetskontroll perspektiv resultaten av pJAK2 skulle vara oacceptabelt medan deCD10 skulle vara acceptabelt på grund av de detekterade protein uttrycksnivåer av ett antal prover på objektglaset. Figur 5 visar belyser bristen av korsreaktivitet mellan sekundära antikroppar och primära antikroppar av en annan art. Ett exempel på Supercurve används för att beräkna prover över en enskild bild kan ses i figur 6. Dessa kurvor används för att producera relativa proteinbaserade uttryck data såsom i fig. 7 (ac). Figur 7a visar uttrycksnivåer av en representativ protein över de tre RPPA objektglasen belyser hur RPPA kan upptäcka skillnader mellan behandlade och obehandlade prover. Fokuserar Figur 7b på de differentiella proteinuttryck nivåer efter proverna från figur 7a har grupperats baserat på behandling, med högre proteinexpression befinns vara vid förbehandlingen. Figur 7c fokuserar på högre intratumoralavarians för efterbehandling proverna efter proven har grupperats utifrån behandling med högre varians som finns i efterbehandlingen prover.
Figur 1a. Vävnadsprov karta över förbehandling vävnad med tillhörande H & E-färgning av frysta sektioner
Figur 1b. Vävnadsprov karta över efter behandling vävnad med tillhörande H & E-färgning av frysta sektioner
Figur 2. Ställ upp för Bradford analysen för proteinbestämning, jagncluding kalibreringskurvan resultattabellen och 96 brunnar format. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Exempel på lämpliga och olämpliga primära antikroppar för användning med RPPA
Figur 4. Flödesdiagram för RPPA skanningen. Klicka här för att se större bild .
Figur 6a. Montering Grid på RPPA slide fläckar. Klicka här för att se större bild .
Figur 6b. Exempel på SuperCurve som används för jämförande analys av alla prover på RPPA bilden. Gröna fläckar representerar "accepterasom kan "fläckar och röda representerar" avvikare "bygger på fördefinierade gränser i analysprogram.
Figur 6c. Exempel på reproducerbarheten av de prickiga proverna, innefattar visade exemplet trefaldiga fläckar av de 5 utspädningar av ett enda prov utöver ämnet.
Figur 7a. Typisk RPPA data för ett protein (MLH1), jämfört flera bilder. Varje prov motsvarar en tumör delregionen.
Figur 7b. Difal-protein uttryck för MLH1 för före och efter behandling prover.
Figur 7c. Varians i MLH1 uttryck mellan före och efter behandling prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den RPPA metoden som presenteras här är en hög genomströmning alternativ till den allmänt använda, men jämförelsevis låg genomströmning western blot teknik proteinanalys. Metoden tillåter hundratals prover att vara semi-kvantitativt analyseras och jämförs samtidigt möjliggör direkt jämförelse av viktiga proteiner över ett brett urval av cellinjer och vävnadsprover. Multiplexering med olika antikroppar arter ytterligare ökning av effekt av tekniken så att flera antikroppar kan användas samtidigt. Exemplet som presenteras här belyser förmågan hos RPPA i studien av tumör heterogenitet och effekten av riktade terapi på heterogenitet.
Som en teknik RPPA har ett antal kritiska steg som antikroppar val är av största vikt. På grund av dot blot-karaktär av tekniken antikroppen specificitet kan inte bekräftas vid analysen och måste fastställas före användning. I den aktuella studien 83-antikroppar var giltigapade på western blöts av vilka bara 58 dras (misslyckas andelen ~ 30%). Av dessa 58 gav 55 antikroppar acceptabla resultat när analyser RPPA (95% framgång). Andra kritiska steg inkluderar valet av en koncentration att upptäcka prover på RPPA glider liksom enhetliga spotting. En högre koncentration kommer att ge mer känsliga resultat, men kan leda till färre prover att upptäckas på grund av otillräcklig protein som är närvarande. Den minsta mängd vävnad som kommer att ge tillräckligt med protein för RPPA spotting är tumör beroende. För RCC minst 50 mg användes som tillät flera sub sektioner av en tumör som analyser medan fortfarande upprätthålls en spotting koncentration av 1 mg / ml. Enhetlighet spotting är också nyckeln eftersom analysen utgår ifrån att alla prover är fläckig vid en enda koncentration, även om detta kan verifieras med hjälp av en totalprotein antikropp efter bild spotting. Den sista fråga är användningen av ett kontrollprov som skall användas när prover nummer är så höga attde kan inte upptäckas på en enda bild, vilket var fallet i exemplen här. I exemplet används här vi införlivat protein från en renal cellinje samt från en HUVEC cellinje som kontroller. Användningen av cellinjen proteinet tillåter stora mängder av proteiner kan extraheras och användas för flera bilder. Kontrollen kompenserar för eventuell inneboende fel på grund av fläckar eller antikropp inkubationer och kompenserar för avvikelser på grund av olika användare och diabilder som används på olika dagar.
RPPA som en teknik är flexibel med avseende på antalet prover som skall användas. De exempel som presenteras här används ~ 300 prover från 45 tumörprover som spreds över tre objektglas, med 2 dynor på varje objektglas. Alternativt aktuellt format skulle ha setts på en bild med en pad. Som sådan formatet kan anpassas till individuella behov experimenten, desto fler kuddar på en bild för mer antikroppar användas samtidigt men begränsa antalet sampel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet med författare FCO, DF, JN, DJH och GDS ovan finansieras av Chief Scientist kontoret, licensnummer: ETM37 och stöds av Cancer Research UK Experimentell Cancer Medicin Centre. Arbetet med AL finansieras av Royal College of Surgeons i Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust för vård och bota cancer och Medicinska forskningsrådet. IO stöds av en Royal Society of Edinburgh skotska regeringens Fellowship samfinansieras av Marie Curie-åtgärderna och den brittiska Medical Research Council. Författarna vill tacka SCOTRRCC medsökande och medarbetare för deras nyttiga diskussioner om några av de ämnen som diskuteras i detta dokument.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aprotinin | Sigma | A6279 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame' four bay slide holder | Whatman | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman | 10485317 | |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
