Summary
Citrobacter rodentium enfeksiyonu enterik bakteriyel enfeksiyonlar çalışma yanı sıra farelerde bağışıklık yanıtları ve kolit barındırmak için değerli bir model sunar. Bu protokol bariyer bütünlüğünü, patojen yük ve murin infeksiyöz kolit patojen ve konak katkıların tam karakterizasyonu izin histolojik hasar ölçümü özetliyor.
Abstract
Bu protokol, bulaşıcı hastalığı ve ülseratif sağlam bir model üretmek için gerekli adımları, aynı zamanda farelerdeki Citrobacter rodentium enfeksiyon karakterize etmek için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. C. rodentium yakından klinik olarak önemli insan patojenleri enteropatojenik E. ile ilgili bir gram negatif, murin spesifik bakteriyel patojen coli ve Enterohemorrhagic E. coli. C ile bulaştıktan sonra rodentium, bağışıklık fareler mütevazı ve geçici kilo kaybı ve ishal muzdarip. Histolojik olarak, bağırsak kript uzama, bağışıklık hücre infiltrasyonu ve goblet hücre tükenmesi gözlenmektedir. Enfeksiyon Açıklık 3-4 hafta sonra elde edilir. Enfeksiyonu sonrası farklı zaman noktalarında intestinal epitel bariyeri bütünlüğünün, bakteri yükü ve histolojik hasarın ölçülmesi, enfeksiyona karşı duyarlı fare suşlarının karakterizasyonu izin verir.
Virülans mekanizmasıs bakteriyel patojenler onların ana yanı sıra, bu tür enfeksiyonlara karşı savunma özel ana yanıtların bağırsak kolonize olan göre tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, C. enterik bakteriyel enfeksiyon rodentium modeli bu süreçleri anlamamıza yardım etmek için değerli bir araç olarak hizmet vermektedir. Enterik bakteriler de İnflamatuvar Bağırsak Hastalıkları (İnlamatuar bağırsak) ile bağlantılı olmuştur. Bu İBH hastalarında görülen uyumsuz kronik enflamatuvar yanıtları enterik bakteriler intestinal mukozal bağışıklık sisteminin anormal maruz kaldıktan sonra genetik olarak yatkın kişilerde gelişir olduğu öne sürülmektedir. Bu nedenle, enfeksiyöz kolit modelleri çalışmada enterik bakterilerin potansiyel patojen konakçı tepkileri tanımlamak için önemli bir potansiyel sunmaktadır. C. rodentium indüklenen kolit İBH patogenezinde potansiyel mekanizmaları hakkındaki bilgilerimizi geliştirerek, enterik bakterilerin konak yanıtların analizi için olanak sağlayan bir tür nadir bir modeldir;yeni önleyici ve terapötik tedavilerinin geliştirilmesi önemlidir.
Introduction
Enterik bakteriyel patojenler tarafından Enfeksiyon gastrointestinal (Gİ) iltihabı yanı sıra, ishal ve intestinal epitel bariyeri disfonksiyonu dahil intestinal patoloji ve patofizyolojisi, tetikler. Bakteriyel patojenler kendi hosts, yanı sıra enfeksiyonlara karşı savunmak belirli bir host yanıtların gastrointestinal kolonize hangi virülans mekanizmalar yeterince anlaşılmamaktadır, enterik bakteriyel enfeksiyonların modellemede Ancak son gelişmeler bu süreçleri anlamamıza yardım etmeye başlamışlardır. Enterik bakteriler de İnflamatuvar Bağırsak Hastalıkları (İnlamatuar bağırsak) ile bağlantılı olmuştur. İnlamatuar bağırsak Crohn Hastalığı (CD) ve UC kronik intestinal inflamasyon ve doku hasarı ile karakterize etyolojisi bilinmeyen karmaşık hastalıklar vardır. Böyle dekstran sodyum sülfat (DSS) ve d gibi bileşikler, kimyasal sorunlara, fareler - / - bağırsak iltihabı birçok fare modelleri, IL10 gibi genetiği değiştirilmiş suşları, spontan inflamasyon, mevcutinitrobenzene sülfonik asit (DNBS) 1. Bu İBH hastalarında mevcut uyumsuz kronik enflamatuvar yanıtları enterik bakteriler intestinal mukozal bağışıklık sisteminin anormal pozlama 2, bu nedenle bulaşıcı kolit modelleri çalışma aynı zamanda potansiyel patojen konak tanımlanması için önemli bir potansiyel sunmaktadır üzerine genetik olarak yatkın kişilerde gelişir olduğu öne sürülmüştür . enterik bakteriler yanıtları Citrobacter rodentium indüklenen kolit enterik bakteriler ve İBH patogenezinde olası mekanizmaların daha iyi anlaşılması için ev sahibi yanıtların analizi için izin de 1,3 karakterize edilmiştir infeksiyöz kolit ender modellerden biridir; önemli bir adım yeni önleyici ve iyileştirici tedavileri geliştirmek.
C. rodentium yakından önemli insan ile ilgili bir (A / D) gram takılarak negatif ve effacing, murin spesifik bakteriyel patojenpatojenler enteropatojenik E. coli (EPEC) ve enterohemorajik E. coli (EHEC) 3-8. A / E patojenlerin ailesi yakından konak hücre üzerinde bir non-invaziv kaide-benzeri bir yapı oluşturan, çekal ve kolonik epitelin apikal konak hücre zarının eklemek. C. ile Oral meydan 10 8 -10 9 organizmaların rodentium kript, mononükleer immün hücre infiltrasyonu ve goblet hücre tükenmesi 3,4 kolon hiperplazi veya uzaması ile karakterize enfeksiyöz kolit sağlam bir model üretir. Kolonizasyon ilk site, birkaç saat uyarımı sonrası, çekal yama az 2 ila 3 gün enfeksiyon sonra 3 distal kolon ilerleme takip etmektedir. Immünkompetan fare suşları olarak, patojen temizlenmesi 3 ila 4 hafta enfeksiyon 1,3,4 sonra elde edilir. Bununla birlikte, birçok genetik olarak değiştirilmiş suşları, örneğin gen eksik veya nakavt (- / -) farelerde önemli ölçüde artar göstermek için tespit edilmiştirabartılı hasar ve / veya kronik enfeksiyon ve inflamasyon 9-14 sonuçlanan enfeksiyona yatkınlık sed. Bu nakavt suşları bu infeksiyöz kolit modelinde kullanılması, doğuştan gelen sinyal proteinlerin eksik çok, bağırsak enfeksiyonu ve inflamasyonu çözünürlüğü ayrılmaz birkaç ana proteinlerin açığa vazgeçilmez olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Citrobacter rodentium İnokulum ve Fare Oral Gavaj hazırlanması
- Hazırlayın ve Luria Bertani broth (LB) otoklavlamayın.
- Canlı C. edinin Steril bir inokülasyon döngü veya pipet kullanarak LB agar plaka üzerine donmuş bir gliserol stok ve çizgi gelen rodentium. 37 ° C de bir gece inkübe edin. Bir inokülasyon döngü veya pipet kullanarak LB plaka kolonileri ile bir şahinin kültürü tüp içinde steril LB broth 3 ml inoküle edin. Inokulum hazırlanması aseptik teknikler kullanılarak yapılması gerekir.
- C. inkübe rodentium kültürü aerobik 37 ° C'de 200 rpm'de bir benchtop inkübasyon çalkalayıcı geceleme. Inoküle LB broth gecede kültürü sonra bulanık görünmelidir.
- Bir ampul kullanın gecede C. 100 ul her fare gavaj için 1 ml şırınga bağlı gastrik gavaj iğne uçlu rodentium kültürü. Sıkıca boyun ve sırt üzerinde gevşek deri tutarak hafifçe ense fare,başparmak ve parmaklar ile. Kafasını hareketsiz ve gavaj iğne yerleştirilmesi için özofagus düzeltmek için parmağı ile hayvanın başını geriye doğru çekin.
- Dik konumda fare koruyun ve onun ağız kenarı boyunca ve onun dil üzerinde gavaj iğne ampul ucu yönlendirin. Yavaşça ağız çatı boyunca iğne geçmek ve yemek borusu aşağı ilerlemek. Bu işlem sırasında hissettim bir direnç varsa, gavaj iğneyi çıkarın ve yeniden takın.
- Yavaşça bakteriyel inokulum 100 ul ekleme ve yavaşça gavaj iğneyi çıkarın. Onun kafes onu döndükten sonra fare solunum hızı ve davranış izleyin.
Notlar:
- Adım 2 ve 3'te, et suyu kendisi hiçbir bakteri kirlenmesi olmasını sağlamak için gece boyunca kültive edilmesi için steril LB et suyu, 3 ml ile aseptik teknikler kullanılarak bir doğan kültür tüp hazırlanır. LB broth gecede kültürü sonrası net görünmelidir.
- Eğer 24 saat aşkın inoküle edilmiş ise gecede kültürü atılmalıdır.
- Tüm C. Enfekte hayvanların rodentium enfeksiyonları ve konut Biyogüvenlik Seviyesi 2 tesisinde yapılmalıdır.
2. C. Kolon Epitel Bariyeri Geçirgenliği Ölçüm rodentium-enfekte Fare
- İstediğiniz zaman noktası sonrası enfeksiyon az bariyer bütünlüğünü ölçün.
- Tahlil gününde, 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran 150 ul her bir fare için gavaj ve standart eğri hazırlamak için 80 mg ml-1 arasında bir konsantrasyonda salin (PBS) ile fosfat tamponlu içinde çözüldü yeterli hazırlayın.
- FITC-dekstran 150 ul Scruff fare ve gavaj. Bu sefer kafes gıda çekin.
- Sonra farelerde 4 saat uyuşturgavaging ve kardiyak ponksiyon yoluyla mümkün olduğunca çok kan (~ 450 ul) olarak toplamak. Pıhtılaşma engellemek için bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 3-asit sitrat dekstroz bir son konsantrasyon için kan ekleyin. Fareler Euthanize ve bakteri sayımı (adımları 3,1-3,5) için PBS içinde kolon doku toplamak ve doku fiksasyonu formalin ve sonuçta immünfloresan boyama% 10 (adımlarla 4,1-4,8) olarak.
- 4 ° C'de santrifüj içinde 12 dakika için 1000 x g'da kan örnekleri Spin Serum toplayın ve PBS içinde 1/10 ve 1/100 seyreltilmiş. Çoğaltır içinde bir 96 plakası, bu iki dilüsyonlarda her bir numunenin 100 ul ekle.
- Standart eğri hazırlamak için, ilk 80 mg ml-1 FITC-dekstran aşağıdaki konsantrasyonları için PBS içinde farelere gavajla için kullanılan seyreltik: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, ve 0 ug / ml . Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plaka için her konsantrasyon 100 ul ekle.
- Bir uyarım wav bir flüorometre kullanılarak her bir numunenin floresans sayısal485 nm ve 535 nm emisyon dalga elength.
- Standart eğri çizerek ham verileri analiz edin. Girdi her bir numune içinde FITC-dekstran konsantrasyonunun tespit edilmesi için standart eğri tarafından üretilen denkleminin her bir numune için ham veriler.
Notlar:
- 4. adımda itibaren, buz üzerinde kan örnekleri tutmak ve ışığa maruz kalma en aza indirmek.
- Şiddetli doku hasarına Bu noktadan sonra oluşacak bir zaman noktasında, ya da daha önce epitel bariyeri bütünlüğünün ölçerken, 7 gün sonrası enfeksiyon, en uygunudur. Ağır hasar oluşma önce bariyeri bütünlüğünün ölçülmesi C. sırasında geçirgenliği maksimal farklılıkları belirlemek için izin verir fare suşları arasındaki rodentium enfeksiyonu.
- Bulaşmamış kontrol fareler ayrıca epitel bariyeri bütünlüğünün test emin olun.
3. C. Doku Bakteriyel Yük Ölçümü rodentium-enfekte Fare
- 1 ml steril PBS bir eklend yuvarlak boncuk bir otoklavlanmış metal aseptik teknik kullanılarak 2 ml santrifüj tüpüne netleşti. Her hayvan için toplanan bireysel dokuları ayrı PBS tüpler yerleştirilir. Doku ilave edilmeden önce, tüpleri tartılır.
- Fare çekum ve kolon çıkarın. Kolon çekum ayırın ve forseps kullanarak lümen içeriğinin dışarı itin. PBS tüp içeriğini ekleyin. % 10 formalin fiksasyonu için distal kolon ve çekum 0.5 cm bölümleri ayırdıktan sonra, uzunlamasına kalan kolon ve çekum kesip ve tüplerde doku yerleştirmeden önce steril PBS ile yıkayın.
- Doku ile PBS tüpleri tartılır ve daha sonra 30 Hz, 6 dakika boyunca damla çırpıcı kullanılarak örnekleri homojen hale getirilir.
- Aseptik teknikler kullanarak, bir 96 plaka kuyu başına 180 ul steril PBS ekleyin. Her satırda ilk kuyuda her homojenize örnek 20 ul ekleyin. İyice karıştırın ve seri (ilk biz 10 -1 seyreltmeler elde etmek için de her önceki 20 ul ekleyerek, seyreltik10 -6) ll. Bir kılavuz ile kare alt LB plaka üzerinde üç nüsha halinde her örnekten her seyreltme Levha 10 ul. 37 gece inkübe ° C
- Sonra ortalama koloni oluşturan birim (CFU), 3 sayıları sayın ve her örnek sayıldı hangi seyreltme kaydedin. Orijinal 1 ml numune 20 ul kullanıldığı gibi, 50 tarafından ortalama CFU çarpın, ve numune CFU / ml elde sayılır edildiği seyreltme faktörüyle. Son olarak, CFU / g belirlemek için doku ağırlığı ile bölün.
4. Histolojik Değerlendirilmesi ve Enfekte Kolon Dokularında immünofloresan Boyama
- Adım 3.2 olarak dokuların toplayın. Formalin gecede Mağaza dokular, daha sonra% 70 etanol ile yıkayın. Parafin doku gömme ve boyanması için 5 mikron bölümleri kesmek. Histolojik değerlendirme için hematoksilen ve eozin ile Leke ve immünofloresan boyama için aşağıdaki adımlara devam edin.
- Boyamadan önce dokuların deparaffinize için, yerde slaytlar65 10 dakika süreyle ° C su banyosunda bir Coplin boyama kavanoz ve koydu. Daha sonra, 2 dakika, her biri dört yıkama için ksilen içinde yer kayar. % 95 etanol,% 75 etanol ve dH 2: 0 Slaytlar bir 5 dakika sonra, aşağıdaki her yıkama, ardından% 100 etanol içinde iki adet 5 dakikalık bir yıkama, ile sulandırılır olmalıdır. Bu yıkama zararlı buharlar maruz kalmaktan kaçınmak için, bir davlumbaz yapılmalıdır.
- 30 dakika için bir gemi içine önceden ısıtılmış sodyum sitrat tampon ve ardından yer Coplin kavanoza koyun slaytlar, sonra 30 dakika bekletin. Bu süreç protein potansiyel antijenik siteleri almak formalin fiksasyonu oluşturduğu çapraz bağlantıları keser.
- 5 dk, üç kez PBS azid ile yıkayın. Kuru slaytlar ve doku üzerinde lokalize boyama reaktifleri tutarak, bir hidrofobik bariyer oluşturmak için bir PAP kalem ile doku çevresindeki işareti alan.
- Bir immüno nem odasında bloke etme tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat (örneğin, α-keçi serumu) için Blok doku.
- Prim seyreltinary antikor istenilen konsantrasyona antikor seyreltme tamponu kullanılarak. Tampon engelleme kapalı dökün ve dokulara primer antikor 50-100 ul ekleyin. 4 2 saat boyunca ° C gecede ya da oda sıcaklığında inkübe edin.
- 5 dk, üç kez PBS azid ile yıkayın. Karanlıkta 1 saat oda sıcaklığında inkübe doku ve antikor seyreltme tamponu içinde seyreltilmiş sekonder antikor, 50-100 ul ekle. 5 dk, üç kez dH 2 O ile yıkayın.
- DAPI Altın montaj orta Prolong ve lamel uygulamak eklemek, slaytları kurutmak. Bir floresan mikroskop altında slaytlar görüntüle.
Notlar:
- PBS azid adım 4 itibaren, yıkama ortamı içinde bakteri büyümesini önlemek için bir alternatif olarak, taze hazırlanmış PBS ile ikame edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Standart bir enfeksiyon deneme sırasında, fareler 100 ul gecede C. gavaj yoluyla yaklaşık 2,5 x 10 8 CFU ile enfekte rodentium kültürü. C olan C57BL / 6 fareler enfeksiyonu mütevazı ve geçici kilo kaybı ve ishal rodentium sonuçlar. C57BL / 6 fareler ile nadir bir olay, hayvanlar hasta olur ve euthanization gerektirebilir rağmen. Bu nedenle, farelerin farklı suşlar enfeksiyon etkilenen ölçüde belirlemek için, kilo kaybı ve böyle piloerect kürk ve kambur duruş gibi sıkıntı belirtileri derecesi açısından takip edilmelidir.
4, Şekil 1'de sunulan sonuçlar donmuş bir gliserol stok hazırlanan bir gecede kültürü kullanılarak yapılan bir enfeksiyon temsilcisi vardır. 7 gün sonrası enfeksiyon anda fareler uyutulduktan kan kardiyak ponksiyon yoluyla toplanmıştır. Şekil 1 FITC-dekstran serumda gösterirC57BL / 6 fareler ve aynı zamanda daha önce 9 enfeksiyon sırasında zarar epitel bariyerini bütünlük arz tespit edilmiştir reseptörü 2 (TLR2) knockout fareleri gibi Toll. Bozulmamış bir bağırsak epitel bariyerini varlığında, 4 kDa FITC-dekstran bu tabaka sayesinde kötü geçirgendir. Bu nedenle, serum FITC-dekstran seviyelerindekiartış bu molekülün boyunca sızmaya izin enfeksiyonu sırasında intestinal epitel bariyeri bütünlüğünün düşüklüğü öneririz. Bir kontrol olarak, FITC-dekstran zorla ağız yolundan verilmiştir enfekte olmayan farelerde serum düzeyleri de sunulmuştur.
Bir hafta sonrası enfeksiyon olarak, kolon içinde bakteri yüklerini 10 9 CFU / g 3,4 civarında zirve ile tespit edilmiştir. Bakteriyel enfeksiyon yükleri onaylamak için, yanı sıra farklı nakavt fareler artmış ya da azalmış bakteriyel yükü muzdarip eğer değerlendirmek için istenen zaman noktalarında sonrası enfeksiyon ölçülebilir. C. rodentium yapabilirsiniz yakından adh bir lümen patojenbağırsak epitel hücreleri, luminal içeriği, çekal, ve kolonik dokularda bakteri yükleri ere ölçülebilir. Şekil 2, C57BL / 6 bağırsak lümeninde azından 7 gün sonrası enfeksiyon çekal ve kolonik dokularda hem de ölçülen tipik bakteri yükü göstermektedir fareler.
Patoloji çoğu C. sırasında gözlemlenen C57BL / 6 fareler içinde rodentium enfeksiyon colon11 distal 2 cm oluşur. Makroskopik 7 gün sonrası enfeksiyon, kolonik mukozada bir kalınlaşma hem de kolon uzunluğunda bir katı C57BL / 6 farelerinde görülen az hasar ile açık görülür. Normalde enfeksiyon sırasında, C57BL / 6 farelerin bağışıklık hücre infiltrasyonu, kolon kript ve goblet hücre tükenmesi (Şekil 3) uzama ile histolojik olarak karakterize sadece ılımlı iltihabı ve patoloji muzdarip.
Şekil 3, H & E bölümlerinde de görüldüğü gibi, çeşitli konakçı tepkileri dur monte edilmiştirC ile ing enfeksiyonu rodentium. Daha bu değişiklikleri karakterize etmek için immünofloresan boyama, proliferasyon belirteçleri, hücre ölümü, ya doğal ve adaptif immün yanıtları gibi ilgi proteinlerin değişiklikler, incelemek için kullanılabilir. Immünofloresan boyaması gibi enfekte doku içindeki lokalizasyonu gibi bakteriyel yanıt yönleriyle incelenmesini de değerlidir. Bu boyama tekniği bir örnek, bir ana protein Ki67 (kırmızı), hücre çoğalması ve C için bir işaretleyici incelenmesi Günde 12 bakteriyel yerelleştirme incelemek rodentium protein tir, yeşil, enfeksiyon sonrası Şekil 4'te verilmiştir.
Şekil 1. Epitel bariyeri bütünlüğünü değerlendirmek için serum FITC-dekstran. Fare Ölçümü vardıSerum FITC-dekstran düzeyleri ölçüldü ve bunun ardından, bulaşmamış koşullarda 4 kDa FITC-dekstran ve enfeksiyon sonrası 7 günde zorla ağız yolundan. C57BL / 6 (WT), fareler ile karşılaştırıldığında enfekte olmayan koşullar 7 gün sonrası enfeksiyon de FITC-dekstran serum seviyelerinde bir artış ihmal edilebilir sergiler. Buna karşılık, TLR2 - / - farelerde belirgin C. sırasında bu zorlanma bazal düşündüren ciddi derecede bozulmuş bariyeri bütünlüğünün karşılaştırıldığında serum FTIC-dekstran düzeyleri artmıştır rodentium enfeksiyonu, daha önce gösterildiği gibi olmuştur.
Şekil 2. C. rodentium lümen, çekum yük ve enfekte C57BL / 7 gün sonrası enfeksiyon az 6 farelerde kolon. çekal Lumen, ve kolon dokuları homojenize, toplanan ve LB agar üzerinde seri seyreltme kaplama yapılmıştır. Her cIrcle bireysel hayvanlardan toplanan tek bir örnek temsil eder. Dikey hata çubukları SEM işaret ederken Katı çizgiler geometrik ortalama göstermektedir.
Şekil 3,. C. yol açtığı hasar histolojik analizi rodentium enfeksiyon. Gün 7 sonrası enfeksiyon orta immün hücre infiltrasyonu yanı sıra kript, goblet hücre tükenmesi ve hafif ödem uzama gözlenebilir bulaşmamış doku kontrol karşılaştırılır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Bulaşmamış ve günün 12 sonrası enfeksiyon üzerine immünofloresan boyamasıC57BL / 6 farelerin tion dokuları. Distal kolon dokusunda ana proteini Ki67 (kırmızı) ve C için lekeli rodentium protein tir (yeşil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Citrobacter rodentium enfeksiyon hastalığı ve farelerde kolit hem de çalışma için değerli bir model sağlamaktadır. Bu özgün model hem konakçı tepkileri, bakteriler gibi patojenik özellikleri karakterizasyonu için olanak sağlar. Adımlar bu protokolü detaylı olarak bu modelin başarılı kullanımı sıraladı.
Kolit ve yanıtları analiz ederken akılda tutulması gereken bu protokolü birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, bir gece boyunca taze C hazırlanması LB et suyu içinde rodentium inokulum farelerde başarılı bir enfeksiyon için gereklidir. 10. 8 -10 9 organizmaların bir doz inokulum çalkalayıcı içinde ya da uzun süreler boyunca oda sıcaklığında tezgah üstüne bırakılırsa, farelerin çoğu suşunun bulaştırmak için gerekli olduğu gibi, kültür içinde kalan canlı organizma yeterli olmayacak enfeksiyon üzerinde kolit ikna etmek. Daha önce bakteriyel inokulum kışkırtmak için de önemlidirHer bir fare bakterilerin bir eşit doz almasını sağlamak için, enfeksiyon için şırınga yükleme. Enfeksiyon terminus üzerine doku toplama zaman, meydana uygun doku tespit için gerekli olan formalin% 10 oranında bir geniş hacimde kolon dokularının dalma tamamlar. Bu dokular oldukça doku için sabitleştirici tavsiye edilmektedir bir 10:1 oranını olarak mikrosantrifüj tüpleri içine göre bir 5 ml şişeye, formalin içinde ilave edilmesi tavsiye edilir. Uygun tespit daha sonra histolojik analiz yanı sıra, bu dokuların immunofloresan boyanması için gereklidir. Farklı nakavt suşlar C. indüksiyonu üzerine tepkileri değişen var aklınızda tutmak için de önemlidir rodentium kolit. Gerekirse ilk kez yeni bir gerginlik bulaşmasını zaman, farelerin yakından deney için son nokta insancıl belirlemek için izlenmelidir. Epitelyal bariyeri bütünlüğünün, bakteriyel yükleri ve histoloji analizi için zaman noktaları fare yanıta göre tanımlanabilirenfeksiyon ilgi süzün.
Bakteriyel yükleri belirlemek için LB plakalar üzerinde doku homojenatlarının kaplama bir C PCR gerçekleştirirken, tamamen seçici bir yöntem değildir gibi bakteri kolonileri üzerine rodentium özgü gen C. farklılaştırmak için neler yapılabilir plaka üzerinde diğer bacterialcolonies gelen rodentium. Bu orta C. için daha seçici olduğu gibi bir başka seçenek, MacConkey agar plaka doku homojenatlarında etmektir LB agar daha rodentium. Alternatif bir yaklaşım, bir streptomisin dirençli yabani-tip C kullanmaktır Bir streptomisin dirençli suşu ile rodentium suşu instead.Substitution bu protokolü açıklanan aynı kolit model indüksiyon neden olur. Bu enfeksiyonlar doku homojenatlarında oldukça yalnız LB agar daha streptomisin ile desteklenmiş LB agar üzerinde kaplama yapılabilir gibi streptomisin dirençli suş kullanmanın yararı, bakteriyel yüklerin daha kolay analiz için. Bu comm büyüme potansiyeli önlerCFU sayma işlemi daha kolay ve daha doğru hale plaka ensal mikroplar. Diğer bir alternatif, bakteri yüklerini ölçme, 37 ya da LB agar üzerinde doku homojenatları seyreltmeleri sonra kaplama plakaları inkübe etmek için ise ° C de bir gece ya da saymadan önce, daha yavaş bir bakteri büyümesi ile sonuçlanan 2-3 gün boyunca oda sıcaklığında, at.
Bu protokol, bulaşıcı kolit sağlam bir örnek üretmek için gerekli adımlar özetlenir yanı sıra C. karakterize etmek için kullanılan yöntemler farelerde rodentium enfeksiyonu. Yanı sıra patojen-konakçı ilişkileri ve bağışıklık yanıtlarını incelemek için bu model kullanılarak, aynı zamanda, bir bakteriyel enfeksiyon, kolon kanseri riskini arttırabilir nasıl incelemek için kullanılabilir. Bu, C. maruz bırakarak gerçekleştirilebilir rodentium veya epitel hücre proliferasyonu üzerine veya genler üzerindeki enfeksiyon etkileri epitel hücre farklılaşması veya tümör gelişimi 15 dahil nasıl inceleyerek kanserojen azoxymethane fareler etkilemiştir. BizeBu protokolde belirtilen enfeksiyöz kolit modelinde ing, bakteri sayılarının ayrıca mezenter lenf düğümleri, dalak ve karaciğer gibi ekstra-intestinal siteler de tespit edilebilir. Bu organlarda Yüksek sayılar test edilen fare zorlanma enfeksiyona karşı çok duyarlı olduğunu gösteriyor olabilir. Açıklanan immünofloresan boyama tekniği kullanarak, enfeksiyonuna yanıt olarak mekanizmaları neredeyse sonsuz sayıda keşfedilebilir. Burada ayrıntılı teknikleri ile tanıdık, protokolü daha iyice C. yanıtları karakterize etmek gibi RNA ekstraksiyonu ve gen ekspresyon düzeylerinin değerlendirilmesi için diğer uç noktaları, ölçmek için doku toplamak için modifiye edilebilir rodentium enfeksiyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Crohn ve Kanada Kolit Vakfı (CCFC) ve Sağlık Araştırması (CIHR) için Kanada Enstitüleri BAK için işletim bağışları ile desteklenmiştir. GB CIHR mezun öğrencilikle tarafından finanse edildi. BAV Bağırsak ve Karaciğer Hastalıkları (ÇOCUK) Pediatrik Gastroenteroloji Pediatrik İBH Araştırma ve Kanada Araştırma Başkanı Vakfı Başkanı olan çocuklar olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
