Summary
זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לייצר מודל חזק של מחלה מדבקת וקוליטיס, כמו גם את השיטות כדי לאפיין Citrobacter זיהום rodentium בעכברים. ג rodentium הוא הפתוגן גרם שלילי, עכברי ספציפי חיידקים הקשור באופן הדוק לחשיבות קלינית האנושי פתוגנים enteropathogenic E. coli וenterohemorrhagic E. coli. עם ההידבקות בג עכברי rodentium, immunocompetent סובלים מירידה במשקל צנוע וחולפת ושלשולים. ביסטולוגיה, התארכות מעי קריפטה, חדירה לתא חיסוני, ודלדול תא גביע הם נצפו. חיסול של זיהום מושג לאחר 3 עד 4 שבועות. מדידה של יושרת מעי אפיתל מכשול, עומס חיידקים, וניזק היסטולוגית בנקודתי זמן שונים לאחר הדבקה, מאפשרת אפיון של זני עכברים רגישים לזיהום.
מנגנון הארסיותזה שבו חיידקים פתוגנים ליישב את המעי של מארחיהם, כמו גם תגובות מארחות ספציפיות המגנות מפני זיהומים כאלה הם הבינו היטב. לכן ג מודל rodentium של זיהום חיידקי enteric משמש ככלי חשוב כדי לסייע בהבנה של תהליכים אלה שלנו. חיידקי enteric נקשר גם למחל מעי דלקתיות (IBDs). זה כבר שער שהתגובה הדלקתית הכרונית הסתגלותי ראתה בחולי IBD לפתח אצל אנשים רגישים גנטיים לאחר חשיפה לא תקינה של מערכת החיסון ברירית המעי לחיידקי enteric. לכן, המחקר של מודלים של קוליטיס המדבק מציע פוטנציאל משמעותי להגדרת פוטנציאל תגובות מארחות פתוגניים לחיידקי enteric. ג rodentium המושרית קוליטיס היא דגם נדיר אחד כזה שמאפשר ניתוח של תגובות מארחות לחיידקי enteric, קידום ההבנה של מנגנונים אפשריים של IBD פתוגנזה שלנו;חיוני בפיתוח טיפולים מונעים וטיפוליים חדשניים.
Introduction
זיהום על ידי חיידקים פתוגנים enteric מעורר דלקת במערכת עיכול (GI), כמו גם פתולוגיה במעיים ופתופיזיולוגיה, כולל שלשולים ובעיות בתפקוד מחסום אפיתל במעי. המנגנונים הארסיים שבו חיידקים פתוגנים ליישב במערכת העיכול של מארחיהם, כמו גם תגובות מארחות ספציפיות המגנות מפני זיהומים כאלה הם הבינו היטב, אך ההתקדמות האחרונה בדוגמנות של זיהומים חיידקיים enteric החלה לסייע להבנה של תהליכים אלה שלנו. חיידקי enteric נקשר גם למחל מעי דלקתיות (IBDs). המחלות של IBDs קרוהן (CD) והאוניברסיטה קליפורניה הן מחלות מורכבות של מסיבות לא ברור, המתאפיינות בדלקת מעיים כרוניות וניזק לרקמות. מודלי עכבר רבים של דלקת מעיים קיימים, מדלקת ספונטנית בזנים מהונדסים גנטי, כגון IL10 - / - עכברים, לאתגרים עם תרכובות כימיים, כגון נתרן גופרתי dextran (DSS) ודinitrobenzene חומצת sulfonic (DNBS) 1. זה כבר שער שהתגובה הדלקתית הכרונית הסתגלותי בהווה בחולי IBD לפתח באנשים רגישים גנטי עם חשיפה לא תקינה של מערכת החיסון ברירית המעי לחיידקי enteric 2, ולכן המחקר של מודלים של קוליטיס המדבק גם מציע פוטנציאל משמעותי להגדרת פוטנציאל מארח פתוגניים . תגובות לחיידקי enteric Citrobacter rodentium המושרה קוליטיס היא האחד הדגמים הנדירים של קוליטיס המדבק שכבר אפיינו 1,3 היטב, ומאפשרים לניתוח של תגובות מארחות לחיידקי enteric והבנה נוספת של מנגנונים אפשריים של היווצרות מחלת מעי דלקתי; צעד חיוני בפיתוח טיפולים מונעים וטיפוליים חדשניים.
ג rodentium הוא מצרף גרם שלילי והשתפשפות (/ E) הפתוגן, עכברי ספציפי חיידקים הקשור באופן הדוק לאדם החשובפתוגנים enteropathogenic E. coli (EPEC) וenterohaemorrhagic E. coli (EHEC) 3-8. משפחתו של פתוגנים / E אינטימית לצרף קרום התא המארח הקודקוד של האפיתל cecal ומעי גס, ויצרה מבנה לא פולשנית דום דמוי בתא הפונדקאי. אתגר אוראלי עם ג rodentium של 10 8 -10 9 אורגניזמים מייצר דגם חזק של קוליטיס המדבק מתאפיין היפרפלזיה או התארכות מעי של מאורות, חדירה לתא חיסוני mononuclear וירידה בכמות תאי גביע 3,4. האתר הראשוני של קולוניזציה, כמה שעות אחרי אתגר, הוא בתיקון cecal, ואחרי התקדמות למעי גס דיסטלי 2 עד 3 ימים לאחר ההדבקה 3. בזני עכברי immunocompetent, אישור של הפתוגן מושגת 3 עד 4 שבועות לאחר ההדבקה 1,3,4. עם זאת, זנים רבים מהונדסים גנטי, כלומר גן לקוי או נוקאאוט (- / -) עכברים, נמצא להצגת increased רגישות לזיהום וכתוצאה מכך לניזק מוגזם ו / או דלקת ודלקת כרונית 9-14. השימוש במודל זה קוליטיס המדבק בנוקאאוט הזנים האלה, חסרי חלבוני איתות מולדות רבות, היה הכרחי בחושפים כמה חלבונים מארחים אינטגרליים לרזולוציה של זיהום ודלקת מעיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Citrobacter rodentium הבידוד וGavage האוראלי של עכברים
- הכן וחיטוי לוריא Bertani מרק (LB).
- השג ג קיימא rodentium ממניות גליצרול קפוא ופס על הצלחת אגר LB באמצעות לולאת סטרילי inoculating או קצה פיפטה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחסן 3 מ"ל של מרק LB סטרילי בצינור תרבות בז עם מושבות מצלחת LB באמצעות לולאה או inoculating קצה פיפטה. הכנת הבידוד צריך להיעשות תוך שימוש בטכניקות אספטיים.
- דגירת ג תרבות rodentium אירובי על 37 מעלות צלזיוס בלילה בbenchtop דגירה ייקר ב 200 סל"ד. מרק LB המחוסן אמור להופיע לאחר מעונן תרבות הלילה.
- השתמש בנורה הטתה מחט gavage קיבה מחוברת למזרק 1 מ"ל לgavage כל עכבר עם 100 μl של ג הלילה תרבות rodentium. בעדינות את עורף העכבר, תוך כדי אחיזה בעור הרפוי בחוזקה את הצוואר ובגבועם אגודל ואצבעות. משוך את ראשו של בעל החיים עם האצבע שלך כדי לשתק את הראש וליישר את הוושט להחדרה של מחט gavage.
- שמור על העכבר בתנוחה זקופה ולכוון את קצה הנורה של מחט gavage בצד של הפה שלו ועל לשונו. בעדינות להעביר את המחט לאורך הגג של הפה ולקדם אותו לוושט. אם קיימת התנגדות הרגישה במהלך הליך זה, להסיר את מחט gavage מחדש להכניס אותו.
- לאט לאט להזריק 100 μl של בידוד החיידקים ועדינות להסיר את מחט gavage. לפקח על קצב נשימה ובהתנהגות של העכבר לאחר החזרתו לכלוב שלו.
הערות:
- בשלבי 2 ו 3, גם להכין צינור תרבות בז באמצעות טכניקות אספטיים עם 3 מ"ל של מרק LB סטרילי כדי להיות מתורבת לילה כדי לוודא שאין זיהום חיידקים של המרק עצמו. מרק LB צריך להופיע ברור לאחר תרבות הלילה.
- תרבות לינה אמורה להיות מושלכת אם הוא כבר מחוסן במשך 24 שעות.
- הכל ג זיהומי rodentium ודיור של חיות נגועות צריכים להתבצע ברמת בטיחות ביולוגית מתקן 2.
2. מדידת חדירות המחסום אפיתל במעי ג עכברים נגועים rodentium
- מדוד שלמות המחסום לאחר פגיעת נקודת זמן רצוי.
- ביום של assay, להכין מספיק 4 isothiocyanate kDa fluorescein (FITC)-dextran מומסת בנאגר מלוח פוספט (PBS) לריכוז של 80 מ"ג למ"ל -1 gavage כל עכבר עם 150 μl ולהכין את עקומת הסטנדרט.
- עורף העכבר וgavage עם 150 μl של FITC-dextran. למשוך אוכל מכלוב בשלב זה.
- הרדם עכברים 4 שעות אחריgavaging ולאסוף כמה שיותר דם ככל האפשר (~ 450 μl) דרך לנקב לב. הוסף את הדם לריכוז סופי של 3% דקסטרוז החומצה ציטראט בצינור microcentrifuge להרתיע קרישה. להרדים את העכברים ולאסוף רקמות מעי גסות בPBS לספירת חיידקים (שלבים 3.1-3.5) ושל 10% בפורמלין לקיבוע רקמה וסופו של דבר צביעת immunofluorescence (שלבים 4.1-4.8).
- לסובב את דגימות הדם ב1000 XG ל12 דקות בצנטריפוגה ב 4 ° C. לאסוף הסרום ולדלל ל 1/10 ו1 / 100 ב PBS. הוסף 100 μl של כל דגימה בשני הדילולים האלה לצלחת גם 96 במשכפל.
- כדי להכין את עקומת הסטנדרט, לדלל המקורי 80 מ"ג המ"ל -1 FITC-dextran משמש לgavage העכברים בPBS לריכוזים הבאים: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, ו 0 מיקרוגרם / מ"ל . הוסף 100 μl של כל ריכוז לצלחת גם 96 בשלושה העתקים.
- לכמת את הקרינה של כל דגימה באמצעות fluorometer בעירור wavelength של 485 ננומטר וגל פליטה 535 ננומטר.
- לנתח את נתוני הגלם ידי התוויית עקומת הסטנדרט. את הנתונים הגולמיים לכל דגימה למשוואה של הקו שנוצר על ידי עקומת הסטנדרט כדי לקבוע את הריכוז של FITC-dextran בכל מדגם קלט.
הערות:
- מגיל 4 ואילך צעד, לשמור דגימות דם על קרח ולצמצם את החשיפה לאור.
- כאשר מודדים את שלמות המחסום אפיתל זמן נקודה, או לפני, 7 ימים לאחר הפגיעה הם אופטימליים, כניזק לרקמות חמור מתרחש לאחר נקודה זו. מדידת יושרת מכשול בטרם התרחשות ניזק חמורה מאפשרת לך לקבוע את ההבדלים בחדירות מקסימאליים במהלך ג זיהום rodentium בין הזנים של עכברים.
- ודא שעכברי בקרה נגועים גם נבדקים לשלמות מחסום האפיתל.
3. מדידה של עומס חיידקים ברקמות של ג עכברים נגועים rodentium
- הוסף 1 המ"ל סטרילי PBSND מתכת חרוז לסיבוב autoclaved שפל צינור צנטריפוגה מ"ל 2 באמצעות טכניקת aseptic. רקמות בודדות שנאספו מכל חיה תהיינה ממוקמות בצינורות PBS נפרדות. לשקול את הצינורות לפני תוספת של הרקמה.
- הסר את cecum ומעי הגס מהעכבר. הפרד cecum מהמעי הגס ודוחף החוצה את תוכן luminal באמצעות מלקחיים. הוסף את התוכן לצינור PBS. לאחר שנפרד 0.5 סנטימטר מסעיפים במעי הגס וcecum דיסטלי לקיבעון פורמלין 10%, חתך את המעי הגס וcecum נותר longitudinally ולשטוף עם PBS סטרילי לפני נחת צינורות ברקמות.
- לשקול את צינורות PBS עם רקמה ולאחר מכן הומוגני את הדגימות באמצעות מקצף חרוז 6 דקות ליום 30 רץ.
- באמצעות שימוש בטכניקות אספטיים, להוסיף 180 PBS סטרילי μl להיטב לצלחת גם 96. הוסף 20 μl של כל מדגם הומוגני לבאר הראשונה בכל שורה. מערבב היטב ולדלל סדרתי, והוסיף 20 μl מכל קודם גם להשיג דילולים מ -10 -1 (ראשוןLL) ל10 -6. 10 μl הצלחת של כל דילול מכל מדגם בשלושה עותקים בצלחת LB תחתית מרובעת עם רשת. דגירת הלילה בשעת 37 ° C.
- ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU), אז ממוצע של 3 ספירות, ולהקליט את הדילול שבכל דגימה שנספרה. הכפל CFU הממוצע של 50, כמו 20 μl של מדגם המ"ל המקורי 1 היה בשימוש, ועל ידי גורם הדילול שבמדגם נספר כתוצאה CFU / מ"ל. לבסוף, לחלק לפי משקל הרקמה כדי לקבוע CFU / g.
4. הערכה היסטולוגית וכתמי immunofluorescence של רקמות נגועות קולון
- איסוף רקמות כמו בשלב 3.2. רקמות חנות בלילה פורמלין, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול 70%. שבץ רקמות בפרפין ולחתוך 5 חלקי מיקרומטר לכתמים. כתם עם hematoxylin & eosin להערכה היסטולוגית ולהמשיך לשלבים הבאים להכתמת immunofluorescence.
- לdeparaffinize רקמות לפני הצביעה, מחליק במקוםצנצנת מכתימה Coplin ולשים באמבט מי 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בשלב בא, שקופיות מקום בקסילן במשך ארבע כביסות של 2 דקות כל אחד. שקופיות אז יש rehydrated עם שתי כביסות 5-דקות באתנול 100%, ואחרי 5 דקות לשטוף 1 בכל אחד מאלה: אתנול 95%, 75% אתנול ו DH 2 0. שטיפות אלו צריכות להיעשות במנדף להימנע מחשיפה לאדים מזיקים.
- שקופיות מקום בצנצנת Coplin עם חיץ מראש התחמם נתרן ציטראט ולאחר מכן למקום ספינה למשך 30 דקות, אז תנו לו לשבת 30 דקות. תהליך זה מפרק את חלבון קישורי צלב עשוי קיבעון פורמלין אחזור אתרי antigenic פוטנציאליים.
- לשטוף עם PBS יזיד למשך 5 דקות, שלוש פעמים. מגלשות יבשות ושטח סביב סימן רקמות עם עט PAP כדי ליצור מחסום הידרופובי, שמירה על ריאגנטים המכתים מותאמים ברקמות.
- רקמה חסומה לשעה 1 בטמפרטורת חדר עם חיץ חסימה (למשל α תיש סרום) בתא לחות immunostaining.
- דלל חסודנוגדן ארי לריכוז רצוי באמצעות חיץ דילול נוגדן. יוצק את חסימת חיץ ולהוסיף 50-100 μl של נוגדן ראשוני לרקמות. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
- לשטוף עם PBS יזיד למשך 5 דקות, שלוש פעמים. הוסף 50-100 μl של נוגדן משני דילול בחיץ דילול נוגדנים לרקמות ו הדגירה בטמפרטורת החדר למשך השעה 1 בחושך. לשטוף עם DH 2 O למשך 5 דקות, שלוש פעמים.
- מייבש שקופיות, להוסיף DAPI להאריך בינוני זהב הרכבה ולהחיל coverslip. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערות:
- PBS יזיד ניתן להחליף עם PBS המוכן טרי כאלטרנטיבה, כדי למנוע התפתחות חיידקים במדיום השטיפה מ4 ואילך צעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במהלך ניסוי זיהום רגיל, עכברים נגועים בכ -2.5 x 10 CFU 8 עד gavage של 100 ג לילה μl תרבות rodentium. זיהום של עכברי C57BL / 6 עם ג תוצאות rodentium בירידה במשקל צנוע וחולפת ושלשולים. אמנם נדיר עם C57BL / 6 עכברים, בעלי חיים עלולים להיות חולים ודורשים euthanization. לכן, עכברים צריכים להיות במעקב למידה של ירידה במשקל ותסמינים של מצוקה כגון פרוות piloerect ויציבה כפופה, כדי לקבוע את המידה שבה זנים שונים מושפעים מהזיהום.
תוצאות מוצגות באיורי 1 עד 4 הן נציג של זיהום נעשה באמצעות תרבות לילה שהוכנה ממניות גליצרול קפוא. ב7 ימים לאחר פגיעה, עכברים היו מורדמים ודם נאסף באמצעות לנקב לב. איור 1 מציג FITC-dextran נמדד בסרוםשל עכברי C57BL / 6, כמו גם מאגרה כמו עכברי נוקאאוט הקולטן 2 (TLR2), אשר בעבר כבר נמצאו להפגין יושרת המחסום אפיתל לקוי במהלך הזיהום 9. בנוכחות של מחסום אפיתל במעי שלם, 4 kDa FITC-dextran הוא גרוע חדיר דרך שכבה זו. לכן, רמות גבוהות של FITC-dextran בסרום מצביעות ירידת ערך של שלמות המחסום אפיתל במעי במהלך הדבקה ומאפשרת מולקולה זו לדלוף פני. כביקורת, רמות בסרום בעכברים נגועים gavaged עם FITC-dextran מוצגות גם.
לאחר פגיעה בשבוע אחד, המון חיידקים במעי הגס נמצאו לשיא סביב 10 9 CFU / g 3,4. המון חיידקים יכולים להימדד בנקודות לאחר פגיעת זמן רצוי כדי לאשר זיהום, כמו גם להעריך אם עכברי נוקאאוט שונים סובלים מעומס חיידקים עלו או ירדה. כג rodentium הוא הפתוגן שיכול luminal אינטימי adhפה לתאי אפיתל במעי, המון חיידקים בתוכן, luminal cecal, ורקמות מעי גסות ניתן למדידה. איור 2 מראה המון חיידקים טיפוסיים נמדד לאחר הפגיעה 7 רקמות cecal ומעי גסים, כמו גם ביום בתוך חלל מעי C57BL / 6 עכברים.
רוב הפתולוגיה נצפתה במהלך ג זיהום rodentium בעכברי C57BL / 6 מתרחש ב2 סנטימטר דיסטלי של colon11. Macroscopically של 7 ימים לאחר פגיעה, עיבוי של רירית המעי, כמו גם קיצור באורך של המעי הגס נצפה, עם ניזק גלוי קטן ראה בC57BL / 6 עכברים. בדרך כלל במהלך הדבקה, C57BL / 6 עכברים סובלים דלקת מתונה בלבד ומאופיינת ביסטולוגיה פתולוגיה על ידי חדירה של תאים חיסונית, התארכות של מאורות מעי גסים וירידה בכמות תאי גביע (איור 3).
כפי שניתן לראות בסעיפי H & E באיור 3, מספר תשובות מארחות הם רכובים during זיהום עם ג rodentium. כדי להמשיך לאפיין את השינויים הללו, כתמי immunofluorescence יכולים להיות מנוצלים כדי לבחון את השינויים בחלבונים של עניין, כגון סמנים של תפוצה, מוות של תאים, או תגובות חיסוניות מולדות ומסתגלות. מכתים immunofluorescence הוא גם ערך לבחינת היבטים של תגובת החיידקים, כגון הלוקליזציה שלה בתוך הרקמה הנגועה. דוגמה לטכניקת צביעה זו, בוחנת מארח חלבון ki67 (אדום), מרקר לשגשוג תאים וג rodentium החלבון טיר, ירוק, לבחון לוקליזציה חיידקים ביום 12 לאחר הפגיעה מוצג באיור 4.
איור 1. מדידה של סרום FITC-dextran להעריך שלמות מחסום האפיתל. עכברים היוgavaged עם 4 kDa FITC-dextran תנאים נגועים ולאחר 7 ימים לאחר פגיעה, לאחר שרמות סרום FITC-dextran נקבעו. C57BL / 6 עכברים (WT) מפגינים עלייה זניחה ברמות FITC-dextran סרום ב7 ימים לאחר פגיעה בהשוואה לתנאים נגועים. לעומת זאת, TLR2 - / - עכברים גדלו רמות של FTIC-dextran בסרום באופן משמעותי בהשוואה לתחילת מחקר המצביע על יושרה נפגעת קשה מכשול בזן זה בג זיהום rodentium, כפי שהוכח בעבר.
איור 2. ג עומס rodentium בלומן, cecum, ומעי הגס של C57BL הנגוע / 6 עכברים ב7 ימים לאחר פגיעה. לומן, cecal, ורקמות מעי נאספו, הומוגני, ומצופה בדילול סדרה על אגר LB. כל גircle מייצג מדגם יחיד שנאסף מבעלי חיים בודדים. קווים מלאים מצביעים על הממוצע הגיאומטרי ואילו עמודות אנכיות שגיאה מצביעים SEM.
איור 3. ניתוח היסטולוגית של ניזק הנגרם על ידי C. זיהום rodentium. על ידי חדירה של 7 ימים לאחר פגיעה מתונה חיסונית תא, כמו גם התארכות של מאורות, דלדול תא גביע ובצקת קלה הוא ציין לעומת שליטת רקמה נגועה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. מכתים immunofluorescence על נגועה והיום 12 לאחר infecרקמות tion של עכברי C57BL / 6. רקמות מעי גסת דיסטלי מוכתמות למארח חלבון ki67 (אדום) וג rodentium החלבון טיר (ירוק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר לחקר מחלות וקוליטיס בעכברים מדבקים. מודל ייחודי זה מאפשר אפיון של שתי התגובות המארחות, כמו גם את התכונות של חיידקים פתוגניים. השלבים מתוארים בפירוט בפרוטוקול זה שימוש המוצלח של דגם זה.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה כדי לזכור בעת גרימת קוליטיס ומנתח את התשובות. ראשית, ההכנה טרי ג לילה בידוד rodentium במרק LB נדרש לזיהום מוצלח של עכברים. כמו במנה של 10 8 -10 9 אורגניזמים נדרשה להדביק רוב הזנים של עכברים, אם נשאר בבידוד ייקרו או על גבי הספסל בטמפרטורת חדר לתקופות ממושכות, לא יהיו מספיק אורגניזמים קיימא שנותרו בתרבות כדי לגרום לדלקת מעי גס על זיהום. חשוב גם כדי להתסיס בידוד החיידקים לפניטעינת המזרק לזיהום, על מנת להבטיח שכל עכבר מקבל מינון שווה של חיידקים. כאשר איסוף רקמות על תחנה סופית של הזיהום, להשלים שקיעה של רקמות המעי הגסות בנפח גדול של 10% פורמלין נדרש לקיבוע רקמה תקין להתרחש. הוא הציע כי רקמות תתווספנה לפורמלין בבקבוקון מ"ל 5, ולא לתוך צינורות microcentrifuge כ10:01 יחס מקבע לרקמות מומלצות. קיבעון נכון הוא חיוני לניתוח מאוחר יותר היסטולוגית, כמו גם כתמי immunofluorescence של רקמות אלה. כמו כן, חשוב לזכור כי זני נוקאאוט שונים יהיו שונים תגובות על אינדוקציה של ג קוליטיס rodentium. כשמדביק זן חדש בפעם הראשונה, עכברים צריכים להיות במעקב מקרוב כדי לקבוע נקודת סיום הומאני לניסוי, במידת צורך. נקודתי זמן לניתוח של יושרת אפיתל מכשול, המון חיידקים, והיסטולוגיה ניתן להגדיר בהתבסס על התגובה של העכברלהתאמץ עניין לזיהום.
כציפוי של homogenates רקמות על צלחות LB כדי לקבוע המון חיידקים הוא לא שיטה כל סלקטיבית, ביצוע PCR לג גן ספציפי rodentium על מושבות חיידקים ניתן לעשות כדי לבדל ג rodentium מbacterialcolonies האחר בצלחת. אפשרות נוספת היא homogenates רקמות הצלחת אגר על MacConkey, כמדיום הזה הוא סלקטיבית יותר לג rodentium מ אגר LB. גישה חלופית היא להשתמש סטרפטומיצין ג עמיד פראי מסוג instead.Substitution המתח rodentium עם זן עמיד סטרפטומיצין יגרום אינדוקציה מאותו דגם קוליטיס מתואר בפרוטוקול זה. היתרון של שימוש בזן העמיד לסטרפטומיצין הוא ניתוח קל יותר של עומסי חיידקים, כhomogenates רקמות מזיהומים אלה ניתן מצופה על אגר LB בתוספת סטרפטומיצין במקום אגר LB לבד. זה ימנע צמיחה פוטנציאלית של commחיידקי ensal על הצלחת, מה שהופך את תהליך ספירת CFU קל יותר ומדויק יותר. חלופה נוספת תוך מדידת עומסי חיידקים, היא לדגירת צלחות לאחר ציפוי דילולים של homogenates רקמות על אגר LB באו 37 מעלות צלזיוס למשך לילה או בטמפרטורת חדר במשך 2-3 ימים, וכתוצאה מהתפתחות חיידקים איטיות יותר, לפני הספירה.
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לייצר מודל חזק של קוליטיס המדבק, כמו גם השיטות המשמשות לאפיון ג זיהום rodentium בעכברים. מלבד שימוש במודל זה כדי לבחון אינטראקציות פתוגן מארחים ותגובות חיסוניות, זה יכול לשמש גם כדי ללמוד איך זיהום חיידקים יכול להגביר את הסיכון לסרטן המעי גס. ניתן לעשות זאת על ידי חשיפת ג rodentium נגוע עכברים לazoxymethane המסרטן, או על ידי הלימוד כיצד משפיע זיהום על התפשטות תאים אפיתל, או על גני המעורבים בהתמיינות תאי אפיתל או התפתחות גידולים 15. לנוing מודל קוליטיס המדבק המפורטים בפרוטוקול זה, מספרי חיידקים יכולים גם להיות מוערכים באתרים נוספים ומעיים, כגון בלוטות לימפה, טחול mesenteric והכבד. מספרים גבוהים יותר באיברים אלה עלולים להצביע על כך שעכבר הזן הנבדק הוא רגיש מאוד לזיהום. שימוש בטכניקת צביעת immunofluorescence תארה, מספר בלתי מוגבל של מנגנונים בתגובה לזיהום יכול להיות חוקר. ברגע שמכיר את הטכניקות המפורטות כאן, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי לאסוף רקמות למדוד נקודתי קצה אחרות, כגון להפקה והערכה של רמות ביטוי גני RNA, יותר ביסודיות כדי לאפיין תגובות לג rodentium זיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים תפעוליים BAV מקרוהן וקוליטיס קרן של קנדה (CCFC) והמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). GB מומן על ידי מלגת לימודים לתואר שנייה מCIHR. BAV הוא הילדים עם הפרעות מעיים וכבדים (ילד) יו"ר קרן לחקר מחלת מעי דלקתי בילדים וקנדה מחקר קתדרת הילדים גסטרואנטרולוגיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
