מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

Summary

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

Abstract

ניסויים ביוכימיים בדרך כלל דורשים ידע מדויק, בשלב מוקדם, של חומצות הגרעין, חלבונים ומרכיבים אחרים בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות. חומצות גרעין ניתן לאתר באמצעות כמה גישות הוקמו, כולל שיטות אנליטיות שspectrophotometric (למשל, _260), fluorometric (למשל, כריכה של צבעי ניאון), או colorimetric (תגובות כימיות chromogenic nucleoside ספציפיים). ¹ למרות שאנחנו לא יכולים להבחין RNA מ-DNA, _260/280 יחס מועסק בדרך כלל, כפי שהוא מציע ² הערכה פשוטה ומהירה של התוכן היחסי של חומצות גרעין, אשר סופגות בעיקר ליד 260 ננומטר וחלבונים, אשר סופגים בעיקר ליד 280 ננומטר. יחסים <0.8 נלקחים כמצביעות על דגימות חלבון "טהורות", ואילו חומצת גרעין טהורה (NA) מאופיינת ביחסים> 1.5 ^3.

הוwever, יש תרחישים שבם תכולת החלבון / אנ לא יכולה להיות ברורה או מהימן להסיק ממדידות spectrophotometric UV-VIS פשוטות. לדוגמה, (אני) דגימות עשויות להכיל חלבונים אחד או יותר שהם יחסית נטולי החומצות האמינו ארומטיים האחראיות על ספיגה ב≈ 280 ננומטר (TRP, Tyr, Phe), כפי שקורה עם כמה חלבונים קטנים RNA-מחייבים, ו (Ii) דוגמאות ניתן להציג ביניים A ₂₆₀ / A ₂₈₀ יחסים (~ 0.8 <~ 1.5), שבו תכולת החלבון / NA הרבה פחות ברור, ואף עלול משקפות חלק-זיקה גבוה קשר בין מרכיבי החלבון ואנ. לתרחישים כאלה, נתאר להלן חבילה של מבחני colorimetric מהירות להבחין RNA, DNA, והפחתת סוכרים במדגם פוטנציאלי מעורב של ביומולקולות. השיטות להסתמך על רגישות ההפרש של pentoses ופחמימות אחרות לבנדיקט, יאל של (orcinol), והמגיבים של Dische (diphenylamine); הפרוטוקולים היעילים יכול להיות completed בעניין של דקות, ללא כל פעולה נוספת שיש לבודד את הרכיבים. את המבחנים ניתן לבצע במקביל להבחנה בין רנ"א ודנ"א, כמו גם להעיד על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, וריבוז (1 איור).

Introduction

הרבה מביולוגיה של תא מתרחשות באמצעות אינטראקציות מולקולריות המעורבות DNA ו-RNA. ⁴ חומצות גרעין באופן טבעי אלה (NAS) אינטראקציה זה עם זה, ^{5, 6} עם חלבונים ועם שורה של תרכובות מולקולה קטנה וligands in vivo (למשל, קטיונים divalent ^7). האינטראקציות עשויות להיות קצרים או ארוך חיים (ודינג), עשוי לנוע בין גבוה עד בינוני לזיקה נמוכה (כוח התרמודינמית), וגם יכול להציג וריאציה משמעותית בתכונות כימיות וסגולית - כמה עמותות הן ספציפיות (למשל, ה-DNA · · גורמי תעתוק, RNA · · · גורמי שחבור), ואילו אינטראקציות אחרות הן בהכרח הרבה יותר כללי (למשל, ה-DNA · · · חלבונים חיידקיים היסטון דמויים הו ^8). אינטראקציות לא ספציפיות עם NAS יכולות להיות השלכות מעשיות לניסויים במבחנה מעורבת תערובות של biomolecules, כפי שזה אפשרי, בסבירות גבוהה, כי חלק NAS יקשר עם ביומולקולות של עניין, לפחות תחת משנה חלק מתנאי הניסוי בשימוש (חוזק יוני, pH פתרון, וכו ').

קח, לדוגמה, ייצור של חלבון של עניין (POI) באמצעות ביטוי יתר של חלבון Heterologous רקומביננטי בתרבית תאי חיידקי Escherichia; הליך כזה מבוצע באופן שגרתי כמעט בכל מעבדת ביולוגיה מבנית ⁹ בהכנות לניסויים נוספים, כאמור. כאפיון ביוכימי / biophysical, התגבשות, וכו '., מאמצים ראשוניים בדרך כלל להתמקד בהשגת כמות מספקת של נקודתי העניין בצורה טהורה ככל האפשר, באופן אידיאלי כדגימה כימית הומוגנית וbiophysically monodisperse. לאחר ההפרעה של תאים פונדקאיים, בשלבים המוקדמים של עבודת טיהור טיפוסית שואפים לבודד את נקודת העניין מE. חלבונים, חומצות גרעין coli, פסולת דופן תא,ורכיבים אחרים של lysate הסלולרי. עם זאת, המארח NAS עשוי לשתף לטהר עם POI מכמה סיבות physicochemical - POI הבסיסי ביותר עשוי הלא במיוחד נפתח DNA מארח / רנ"א; POI יכול להיות פעילות הגנרית NA-מחייבת (לדוגמה, HU הנ"ל); POI יכול להיות חלבון ספציפי למדי NA-מחייב אבל תערוכת תגובה צולבת עם RNAs המארח או DNAs; המארח NAS עלול ליצור אינטראקציה עם מטריצת כרומטוגרפיה ובכך פשוט שיתוף elute עם POI, וכן הלאה. ללא הבחנה, בעלת זיקה גבוהה מחייב של המארח NAS לPOI יכול להוות בעיה מציקה, כי זיהומי NA סביר יפריעו ניסויים במורד זרם (לדוגמה, מבחני אנאיזוטרופיה קרינה של POI • RNA מחייב ^10). לחלופין, POI בלתי צפוי · · · עמותות NA גם ניתן לראות במקרה, כאינטראקציות כאלה להאיר קיבולת חומצת גרעין המחייב של נקודת העניין. כך או כך, בין אם הם מרכיבי NAS או מזהמים עיקריים, צריך לכמת ראשון ולזהות את הסוג (DNA, RNA) של שיתוף מטהר NAS בהכנה לניסויים במורד זרם.

מספר שיטות אנליטיות קיימות לאיתור וquantitating NAS במדגם. רוב השיטות הזמינות באופן מהותי או spectrophotometric (למשל, ₂₆₀ ערכי ספיגה _ו260 / A ₂₈₀ ratios), fluorometric (למשל, מחייב thiazole כתום או צבעי ניאון אחרים לנ"א), או colorimetric (רגישות של נוקלאוזידים לתגובות כימיות שchromophores תשואת קליטה באזור UV-VIS של הספקטרום האלקטרומגנטי), כפי שתואר לאחרונה על ידי דה מיי et al. ^{1 עם} זאת, הצעד החיוני לזיהוי הסוג של polynucleotide כRNA או DNA הוא מעבר להיקף של רבים מאלה quantitation גישות. כאן אנו מספקים סדרה של מבחני colorimetric לזהות במהירות את סוגי רכיבי NA במדגם חלבוניים.

הפרוטוקולים מתוארים כאן גיבוצע ביעילות ללא צעדים נוספים של בידוד זיהומי NA הפוטנציאליים, ולהסתמך על הבדיקה של בנדיקט להפחתת סוכרים ^11, assay orcinol לpentoses ^12,13, ותגובות של diphenylamine ^14,15 2'-deoxypentoses (תרשימי 1 ו 2) . מבחנו של בנדיקט (איור 2a) מנצל את היכולת של השרשרת הפתוחה (אלדהיד) הטופס ליניארי, של סוכר aldose להפחית Cu ^{2 +,} עם חמצון קשור של קרבוניל של הסוכר למחצית carboxylate וייצור של Cu ₂ O כ משקע אדום מסיס. תגובה זו תהיה מבחן חיובית עם הפחתת סוכרים חינם כגון aldoses וketoses (אשר להמיר לaldoses המתאים דרך ביניים enediol), אך לא עם סוכרי פנטוז שנעולים בצורה מחזורית כחלק מעמוד השדרה קוולנטי של DNA או RNA polynucleotide. בגלל הדרישה של מינימליסטי פונקציונלי hemiacetal חופשי, שיתוף אחרmpounds שיכולים בדיקה חיובית בבדיקה זו - ולכן יפעל כinterferents פוטנציאלי - כולל α-hydroxy-קטונים ואוליגוסכרידים קצרים (מלטוז disaccharide למשל). שניהם יאל של orcinol (האיור 2b) ותגובות diphenylamine של Dische (איור 2 ג) מבוססות על הרס ראשוני של עמוד שדרת polynucleotide, דרך depurination של nucleoside וחומצה או עוד יותר הידרוליזה בסיס קטליזאטור של נוקלאוטידים ההורי, כדי להניב furan-2 -Carbaldehyde (furfural) נגזרים; הנגזרים האלה אז להגיב עם או polyhydroxy פנול כגון orcinol (יאל של) או diphenylamine (Dische של) ריאגנטים ליצירת מוצרי עיבוי צבעוניים של מבנה כימי הידוע ברובם. דנ"א לעומת רנ"א ספציפי של assay של Dische נובע מהעובדה שסוכר הפנטוז חייב להיות 2'-deoxygenated כדי להיות רגיש לחמצון לאלדהיד ω-hydroxylevulinyl, אשר עוד מגיב עם diphenylamineתחת תנאים חומציים להניב בהירים כחולים מעובים (איור 2 ג). שימוש בפרוטוקולים היעילים שתוארו כאן, יש לנו מצאנו שתגובות colorimetric סוכר ספציפיים אלה יכולים להבחין בין רנ"א ודנ"א, וגם מצביעות על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, או ריבוז במדגם biomolecular.

Protocol

1. Assay של בנדיקט להפחתת סוכרים

1. הכן כמות מתאימה של ריאגנט של בנדיקט - קרבונט 940 מ"מ נטול מי נתרן, מייבשי ציטרט הנתרן mM 588, 68 מ"מ נחושת pentahydrate (II) סולפט. ריאגנט זה ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר (RT) לפחות שישה חודשים ללא שינוי ניכר בתגובתיות.
2. מגיב לעיל הוא 6x. כך, 600 תגובות μl, להוסיף 100 μl של ריאגנט של בנדיקט לצינור נקי 1.5 מ"ל microcentrifuge (למשל, אפנדורף מותג), לפי המדגם שassayed.
3. הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה; הנפח האופטימלי ניתן לקבוע על סמך העצמה של היווצרות צבע בהרצה ראשונית. אם מדגם מספיק זמין אז להתחיל בניסויים כאלה בנפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חמש שישיות מעוצמת התגובה הכוללת, 500 μl של דגימה במקרה זה), ואז לדלל במבחנים הבאים.
4. הוסף DDH ₂ O לטויהיה להביא את הנפח הסופי עד 600 μl; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting.
5. דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח.
6. הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות.
7. צנטריפוגה צינור הדגימה ב> 9300 XG (~ 10000 סל"ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים.
8. Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי.
9. Blank ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים.
10. מדוד את הספיגה של מדגם זה ב475 ננומטר.

2. Assay Orcinol של יאל לסוכרי פנטוז

1. הכן כמות מתאימה של ריאגנט של יאל הטרי - קריאטין מונוהידראט 24.2 המ"מ orcinol (ראה איור 2b למבנה של תרכובת זו), 6 M HCl, 0.025% hexahydrate כלוריד הברזל w / v הערה.:לאחסון ממושך, המגיב של יאל יכול להיות מוכן כמו שני פתרונות נפרדים מלאי: (i) מגיבים [0.05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O בריכוז HCl] וכן (ii) מגיב monohydrate orcinol B מ"מ [422 הכין ב95 אתנול%]. מגיב יכול להיות מאוחסן בRT במשך שישה חודשים; B המגיב ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך חודש אחד, מכוסה בנייר כדי לצמצם את חשיפת אור. פתרוני מניות אלה מעורבים ב15 (א): 1 (ב) יחס לפני השימוש v / v.
2. מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ"ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של יאל לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל, לפי המדגם שassayed.
3. הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם.
4. הוסף DDH ₂ O לצינור להביא fנפח inal ל 1.0 מ"ל; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting.
5. דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח.
6. הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות.
7. צנטריפוגה צינור הדגימה ב> 9300 XG (~ 10000 סל"ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים.
8. Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית.
9. לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב660 ננומטר.

3. Assay Diphenylamine של Dische לסוכרים 2'-deoxypentose

1. הכן כמות מתאימה של ריאגנט diphenylamine של Dische - 60 המ"מ diphenylamine, חומצה אצטית קרחונית ז 11, חומצה גופרתית 179 מ"מ, 62% v / v אתנול. מגיב זה יכול להיות מראשpared מראש ולאחסן בRT במכל כהה, או מכוסה בנייר כסף, כדי להגביל את החשיפה לאור. בשל רגישות לאור מגיב לא צריך להיות מאוחסן ללא הגבלה זמן, אף שבפועל זה יכול להיות מוכן בכל שנים עד שלושה חודשים, ללא שינוי ניכר בתגובתיות.
2. מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ"ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של Dische לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל, לפי המדגם שassayed.
3. הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם.
4. הוסף DDH ₂ O לצינור להביא נפח הסופי למיליליטר 1.0; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting.
5. דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח.
6. הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה וallow לו להתקרר בRT למשך 10 דקות.
7. צנטריפוגה צינור הדגימה ב> 9300 XG (~ 10000 סל"ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים.
8. Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית.
9. לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב 600 ננומטר.

4. הערות שימוש נוספות

1. המחלקות הבאות של מולקולות הן תרכובות התייחסות מתאימות לבקרת תגובות חיוביות ושליליות לכל assay:
   • של בנדיקט - חיובי = החופשי ריבוז, פרוקטוז, גלוקוז; השלילי = רנ"א, דנ"א, ATP, וכו '. (כל saccharide החסר פונקציונלית סוכר הפחתה חינם)
   • יאל של - החיובי = רנ"א (תמצית השמרים של האופה לדוגמה), ריבוז, ה-ATP, UMP; השלילי = השור serאממ אלבומין (BSA) או כל חלבון אחר
   • Dische של - חיובי = DNA (למשל העגל התימוס); שלילי = רנ"א, ATP, וכו '. (כל הלא 2'-deoxygenated נוקלאוטיד)
2. מבחנים אלה נמצאו להיות די גמישים לתרכובות המשמשות לעתים קרובות בטיהור חלבונים: למשל, מלחים נפוצים כגון NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, ו-K ₂ SO ₄ לא התערב, והתגובות מופיעות בדרך כלל אינן מושפעות את התוכן של ממס. חומרי ניקוי או סוכני chaotropic כגון אוריאה עשויים להשפיע על תגובתיות של המבחנים אם pH הוא בסיסי ביותר, וניטראלי לטווח pH חומצי הוא בדרך כלל אופטימלי ביותר למבחנים של Dische יאל של ובגלל כימית התגובה הבסיסית (ראה את הטקסט ואת הפרוטונים באיור 2b, ג). תנאים לא טובים עלולים להיות תגובה, interferents חשוד, וכו '. צריך להיבדק על בסיס מקרה לפי מקרה, תוך שימוש חיובי ושלילי שליטת הניסויים wתרכובות התייחסות ith.

Representative Results

תוצאות מוצגות באיור 3 ליישום מבחנים אלה לcolorimetric תרכובות התייחסות ידועה. מידע איכותי יציג מוצגים ל( ב), והמבחנים של בנדיקט (א), של יאל orcinol של Dische diphenylamine (ג), ועקומות רגילות לשלושת מבחנים אלה מוצגים באיור 4. בלוחות 3 (AC), לוחות השמאל להראות ניסויים שליטים חיוביים / שליליים באמצעות analytes כראוי תגובתי / unreactive; תוצאות חזותיות אלו מוצגים באתר, בcuvettes כמתואר בפרוטוקולי 1-3 (לעיל). זכות תתי פנלים להראות סדרת טיטרציה עבור כל אנליטי המתאים. בבדיקה של בנדיקט (), השליטה החיובית היא ריבוז (0.42 מ"ג / מ"ל), בעוד שאמצעי בקרה שלילית הן מים, חלבון גנרית (0.75 מ"ג / המ"ל BSA), ושני סוכרים שאינם הפחתה (DNA ב0.75 מ"ג / מ"ל ו-RNA על 12.5 מ"ג / מ"ל). בבדיקת orcinol (ב), פקדים החיוביים הם ריבוז (0.15 מ"ג / מ"ל), רנ"א (7.5 מ"ג / מ"ל), וה-DNA (0.45 מ"ג / מ"ל), בעוד שבמים וBSחלבון (0.45 מ"ג / מ"ל) הם פקדים שליליים. בבדיקת diphenylamine (ג), העגל התימוס דנ"א (0.45 מ"ג / מ"ל) מוצג כביקורת חיובית, ומים, שמרי התמצית רנ"א (7.5 מ"ג / מ"ל), ריבוז (0.15 מ"ג / מ"ל), וBSA (0.45 מ"ג / מ"ל) ישמש כקבוצת ביקורת שלילית. לבסוף, פנל (ד) ממחיש את איתנותם של מבחנים על ידי הצגת התגובה של Dische עם דגימות של משתנה ההטרוגניות: שני ריכוזים של DNA מוצגים כביקורת חיובית בשני מדגם השמאל (cuvettes 1-2), דנ"א + רנ"א תערובות ( ביחסים שונים) מוצג בשלוש הדוגמות הבאות (3-5), והשלוש דגימות דנ"א הסופיות להראות בהעדר (מדגם 6) או הנוכחות (דוגמאות 7-8) של החלבון 'Hfq' חומצות הגרעין המחייב. ¹⁶ הערה שהתוצאה החיובית של הבדיקה של Dische נשמרה עבור ה-DNA המכיל דגימות אפילו בנוכחות של RNA 'מזהמים' או חלבון.

ניתוח הכמותי: טווחי הדילול באיור 3 (AC) פנלים להשתנות כי כלתגובה יש גבול גילוי ראייה ברור, תלוי בסוג של להיות assayed סוכר. Spectrophotometric, ולא חזותיים, זיהוי יכול לשמש כדי לשפר את טווחי מדידה, למשל, כפי שמוצגים באיור 4 ל() בנדיקט, (ב) יאל של, ו (ג) של מבחני Dische. למרות שהפרוטוקולים שתוארו כאן נועדו בעיקר כמבחנים איכותיים, ביחס באר למברט בין ספיגה וריכוז מאפשר לפחות הערכה חצי כמותית של הסוכר או תוכן חומצות גרעין. כדוגמה לעקומת סטנדרט לכיול של הבדיקה של בנדיקט, מתאים ליניארי רגרסיה של ספיגה (475 ננומטר) נגד ריכוז ריבוז מוצג באיור 4 (א); ברי שגיאה מצביעים על סטיית התקן של n = 3 חזרות, ו מקדם מתאם בריבוע מסופק. הסטייה מליניאריות בריכוזים נמוכים מאוד ריבוז (למשל 0.28 נתון mM) משקפת את הרגישות המוגבלת של בדיקה זו. למרות כאומר מיועדים בעיקר למחקרים איכותניים, ההנחיות הבאות מוצעות לניתוח חצי כמותית:

• עבור assay של בנדיקט (איור 4 א): readout התגובה _(475nm) נמצא יניארי לפחות מעל הטווח 0.04 → אנליטי 0.5 מ"ג / מ"ל, כפי שבוצע בשלושה עותקים.
• עבור assay של יאל (איור 4 ב): נתוני הספיגה _(660nm) היו ליניארי לפחות מעל הטווח 0 → 0.5 מ"ג / אנליטי המ"ל (שמרי RNA של האופה), הבדיקה שבוצע בשלושה עותקים (R ² = 0.99 רגרסיה לינארית מקדם). למרות שדגימות centrifuged לבירור לפני מדידות ספיגה, לא מזרז נמצא בריכוזים נמוכים אלה של אנליטי ולכן צעד צנטריפוגה לא היה נחוץ ביותר. הבדיקה חורגת מליניאריות בריכוזים אנליטי מעבר לטווח זה.
• עבור assay של Dische (איור 4 ג'): _600nm 2 = 0.99). העלילה של ספיגה לעומת [אנליטי] החל ברמה 0.90 מ"ג / המ"ל DNA, המציין את גבולו של אזור התגובה ליניארית.
• שיקולים מעשיים לניתוח כמוני או חצי כמותית: כדי להוציא חומר זרז שאחרת להפריע לקריאות ספיגה כל שלושת המבחנים דורשים צנטריפוגה במהירויות מקסימליים (25000 XG, או כל מגבלה ניתן עמד על ידי צינורות microfuge) לאורכי זמן סבירים (לדוגמה, 20 דקות); זה חשוב במיוחד בריכוזים גבוהים יותר אנליטי. לאחר צנטריפוגה, דגימות הבהירו ניתן להעביר קובט או microplate (למשל, צלחות microtiter 96-כן) למדידות ספיגה נוחות.

איור 1. עץ החלטות ליישום של המבחנים. החל מדגם פוטנציאלי הטרוגנית של ביומולקולות (למשל, מlysates כל התאים), מבחני colorimetric המתוארים כאן יכולים לשמש כדי לקבוע אם התערובת מכילה סוכרים שאינה הפחתה (המבחן של בנדיקט). אם כן, אז מבחן orcinol של יאל נוסף מגלה אם האוכלוסייה של סוכרים שאינם מכילה הפחתת טבעות פנטוז (כמו בDNA או RNA), לעומת hexoses (למשל, גלוקוז, pyranoses האחר) ואולי עדיין aldoses אחר. לבסוף, אם המדגם מכיל לפחות חלק מתון של ה-DNA ואז הטבעת 2'-deoxyribose תגיב (על החמצה וחימום) עם ריאגנט diphenylamine של Dische, מניבי מוצר עיבוי בעליל כחול. שימו לב שתרשים זה הוא עץ החלטה, לא תרשים זרימה: ההיגיון של תוצאות assay הוא מוקרןerially, אבל את המבחנים ניתן לבצע במקביל.

איור 2. תגובות כימיות שבבסיסם מוצגים למבחני colorimetric, עם המוצר בצבע לזיהוי מצוין לצד התגובות המתאימות. (א) משקע לא מסיס, אדום של Cu ₂ O הוא התוצאה החיובית של הבדיקה של בנדיקט להפחתת סוכרים. (ב) עם החימום וההחמצה, המכילים סוכרי טבעות פנטוז מתפרקים לfurfural, אשר לאחר מכן מגיב עם orcinol (מגיב של יאל) להניב adduct מסיס כחול ירוק. בבדיקה של Dische, חוסר substituent הידרוקסיל בעמדה 2 'מאפשרת תגובת חמצון טבעת פתיחה, המוצר של אלדהיד נוסף אשר מגיב עם diphenylamine [(Ph) ₂ NH] להניב מוצר כחול בהיר. הכימיה structures אינו ידוע למוצרים הגדולים, רבת טבעת העיבוי (ב) ו תגובות orcinol diphenylamine (ג).

איור 3. יישום של מבחני colorimetric לתרכובות התייחסות ודגימות הטרוגניות. תוצאות לדוגמה מוצגות לבנדיקט (א), יאל של (ב), ו (ג) מבחני colorimetric של Dische. ב() → (ג), את תת פנלי שמאל להציג את הפקדים חיוביים / שליליים באמצעות analytes כראוי תגובתי / unreactive וזכות תתי פנלים להראות סדרת טיטרציה עבור כל אנליטי. מוצג גם הוא פנל המחשה של תגובות Dische (ד) שבו משתנה בהטרוגניות אנליטי - או דנ"א בלבד (משמאל), תערובות DNA / RNA של יחסים שונים (באמצע), או DNA בנוכחות חלבון חומצות גרעין הקשורים ( 'Hfq'). אלו פנליםעוד מתואר בסעיף תוצאות הנציג של הטקסט.

איור 4. עקומות סטנדרטיות ממבחנים עם תרכובות התייחסות. עקומות כיול מוצגות לבנדיקט (א), (ב), ו (ג) של מבחני יאל של Dische, מתארות חלק נציג של האזור ליניארי תגובה לכל assay. רגרסיה לינארית מתאימה ומקדמי מתאם מתאימים מצוינים עבור כל בדיקה. שמרי RNA של תקן האופה (ב) ועגל התימוס דנ"א (ג) היה analytes באלה סדרת טיטרציה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

מבחני colorimetric מוצגים כאן מציעים גישה פשוטה במהירות כדי להעריך את האופי הכימי של תערובות biomolecular, כגון הם נתקלו בעת טיהור חלבונים, RNAs או מתחמים מlysate כל התאים בהכנה למחקרים נוספים. כביולוגיה מבנית רודפת מכלולים נוספים יליד דמוי, אתגרים גדולים יותר בהדרגה, כגון הטרוגניות מדגם, יהיה נשקף מהמתחמים מסובכים ורבי מרכיבים. מכלולים מולקולריים הם לעתים קרובות רק באופן שולי יציבים, והבידוד המוצלח שלהם עשוי לדרוש תנאים פחות מחמירים טיהור (למשל, כפי שנמצא למתחמי snRNP spliceosomal ^17,18). בתנאים כאלה קלים יותר גם POI האותנטי והמזויף · · · אינטראקציות NA נוטות יותר להתמיד ובכך מתערב במבחני מורד עם חלבון מטרה או חומצות גרעין. צעד ראשון הכרחי הוא זיהוי הסוגים של מרכיבים כימיים בדגימות אלה.

ve_content "> שיטות לאיתור רנ"א, דנ"א, וחלבון משתנות בהתאם לכמות וריכוז של analytes, משאבים זמינים ואילוצי זמן, ואולי הכי חשובה, הידע של אחד מוקדם על ההרכב הכימי הצפוי של analytes. חומרים חלבוניים יכול להיות מזוהה על ידי שיטות מבוססות היטב רבות, כולל אלה שספקטרוסקופיות _(280), הידרודינמית (אלקטרופורזה ג'ל), כימי / colorimetric ¹⁹ (למשל, בדיקת biuret לאג"ח פפטיד) ו, ברגישות ובדייקנות רבות, באמצעות ספקטרומטריית מסות. דומה, NAS ניתן להבחין באמצעות ספקטרוסקופיות _(260), fluorometric, או כימי (מבחנים שתואר כאן). כל סוג של שיטת תכונות חוזק וחולשה אופייני. למשל, PicoGreen, SYBR-זהב, וצבעי ניאון אחרים cyanine מבוסס די רגישים ל חומצות גרעין (הזמנות רבות של גודל מעבר למבחני colorimetric), מפגינות דרגות שונות של הסלקטיביות (למשל, PICoGreen לגדילי הדנ"א כפול, SYBR-הזהב נקשר ביותר NAS), וכולל גם טווחים דינמיים רחבים למטרות quantitation. עם זאת, גישות הללו הן לא בלי גבולות: את הצבעים דורשים ציוד מתקדם יותר לאיתור (transilluminators לג'לים, spectrofluorometers לדגימות יצוו), לעומת readout החזותי פשוט של מבחני colorimetric; את צבעי מטופלים כmutagens, בדומה לרומיד ethidium; ושם הגבלות על תנאי assay (למשל, טווח מומלץ pH של 7-8.5 לSYBR-זהב; הפחתה של 30% מעוצמת אות PicoGreen ב> 200 המ"מ NaCl). לפיכך, מבחני colorimetric ופלואורסצנטי מבוססים משלימים: צבעי חומצות גרעין יכולים להיות שימושיים במיוחד במקרה של תוצאות שליליות עם מבחני colorimetric המהירים, או כדרך לזהירות רבה יותר (כמותית) להרחיב על תוצאות ראשוניות ממבחני colorimetric. יתרון בסיסי של פרוטוקולי NA colorimetric, בנוסף לפשטות שימוש, הוא שהם מסתמכים אך ורק על השיתוף הפנימימבנה ערכי של NAS ולא מבני fold/3D, reactivities, או כל המאפיין אחר של biopolymer שעשוי להשתנות עם רצף.

הפרוטוקולים שתוארו כאן הם חזקים מול מרבית הקשיים, במיוחד כאשר היא מבוצעת עם בדיקה ויזואלית פשוטה של ​​מוצרי התגובה; טיפול מיוחד יש לנקוט על ניתוחים כמותיים (spectrophotometric) יותר. לדוגמה, בבדיקה של בנדיקט המזרז האדומה (ppt) שמיוצר בנוכחות ריכוזים גבוהים של ריבוז יש להסיר לפני ניתוח spectrophotometric; זו מושגת בקלות באמצעות צנטריפוגה. עבור assay של Dische, התוספת של מגיב diphenylamine מלווית בהיווצרות ppt הלבן שניתן solubilized על ידי חימום; ירוק ppt שטפסים בנוכחות DNA עלולים להפריע למדידות spectrophotometric ויש להסיר לפני הניתוח הכמותי. בנוסף, כל בדיקה מבוססת על תגובות כימיות שהם רגישיםלinterferents הפוטנציאלי, כאמור במבוא ובהמשך מפורט להלן. לבסוף, תציינו, כי ריכוז יחסי גבוה של RNA בתערובת ה-DNA / RNA יכול להסוות את התוצאה החיובית הצפויה של assay של Dische; זה שלילי כוזב לדנ"א נובע מהעובדה שחלק שומה גבוה של רנ"א גם מגיב, דרך ביניים furfural, עם חומרים כימיים של Dische, אבל מניב מוצר חסר צבע ולא adduct הכחול המיוצר על ידי תגובה עם סוכר 2'-deoxypentose של ה-DNA.

Interferents האפשרי: מעבר למקרה הברור של סוכרים, שומנים וחלבונים הם שתי ביומולקולות אחרת שיכולים לגרום לבעיות באופן היפותטי מבחני colorimetric אלה בשל תגובה צולבת (חיוביים שגוי) או תגובתיות רעולה פנים (נגטיבי שווא). באופן עקרוני, מספר סוגים של שומנים סלולריים יוכלו אולי להתערב, כולל glycosylglycerols וglycerolipids האחר מצומדות לסוכרים, glycosphingolipids (למשל, cerebrosides), saccharolipids (למשל, גלוקוזאמין נגזרים), lipopolysaccharides, וכן הלאה. בפועל, שיעורים אלה של שומנים אינם צפויים להוות בעיה בעבודה עם חלבוני lipophilic כי הם נדירים יחסית, מול הרבה יותר שופעים פוספוליפידים, ולכן מתחת לתחום הגילוי של המבחנים שלנו. מכיוון שברוב השומנים הסלולריים הנ"ל נבנו על hexoses (גלקטוז, גלוקוז) ולא pentoses, הם לא צריכים להתערב כחיוביים מדומים במבחנים של Dische יאל של או. מונוסכרידים חינם שעשוי מסר חיוביים שגוי כוללים פרוקטוז, galactofuranose, או furanoses אחר. בהקשר הזה, התערבות לא רצויים מסוכרים יכולה להיות בעיה עבור חלבונים רקומביננטיים הביעו עם חלבון תגי מלטוז מחייבים (MBP). בכרומטוגרפיה הזיקה פעם מדרגות לטהר מבני היתוך כאלה, מלטוז משמש לelute חלבון, וניתן לשער כי מלטוז שייר בהכנות מורד זרם עלול להפריע להבדיקה של הדואר בנדיקטוס (זה כללי ביותר / ספציפי של המבחנים; יחידות הגלוקוז של מלטוז לא צריכות להגיב ביאל של או Dische של). לפיכך, יהיה צורך לנקוט בזהירות בשלבים שלאחר chromatographic כדי להבטיח שמלטוז שיורים לא הניב תוצאות מזויפות. אנחנו עדיין לא נבחנו חלבוני glucosylated או גליקופרוטאינים אחרים, אבל אנחנו חושדים שזה יהיה קשה להשיג תוצאה חיובית ברורה לנוכחות של סוכרים בחלבונים כאלה (או glycolipid, גליקן, או glycoconjugates האחר) משום שאנו מצפים שmoieties glycan היית לשכב מתחת לגבול הרגישות של המבחנים שלנו. באופן עקרוני, פתרון המכיל aldohexose חופשי כמו גלוקוז, ששוחרר מחלבון glucosylated באמצעות הידרוליזה חומצה, היה מבחן חיובי על ידי assay של בנדיקט; דומה, פנטוז גליקופרוטאין-נגזר, כגון קסילוז, אמור להניב תוצאה חיובית ביאל של assay. עם זאת, בפועל תוצאה חיובית לגליקופרוטאינים תדרוש מאוד h ריכוזי IGH חלבון, אפילו לפוליפפטידים מתרבים מסוכרים, בגלל יחס הסוכר / חלבון הנמוך הטוחן.

פרוטוקולי assay המתוארים כאן יכולים להיות מורחבים ומותאמים לטיפול במגבלות גודל מדגם קטן - קטנים, כרכי IE או ריכוזים נמוכים של analytes. לכמויות מדגם מוגבלות שמצאנו כי התגובות יכולות להיות מדורגות עד הטווח 100-μl (למשל, באמצעות צינורות PCR וthermocycler לשלבי הדגירה). לדגימות קטנות בנפח בריכוזים נמוכים (בסמוך לגבול הגילוי), ספקטרופוטומטר מצויד בצלחת קורא יכול לשמש; בתרחישים כאלה, הקושי הצפוי רק יהיה הסרה כל מזרז לא רצוי לפני מדידות ספיגה. למרות טווח הגילוי המוגבל של בדיקה ויזואלית פשוטה, יתרונה של הגישה שתוארה כאן הוא היעילות והמהירות שלו, עם דגימות שמסוגלות להיות מנותח מייד עם חימום.

"<יישומים של הפרוטוקולים שהוצגו כאן כולל זיהוי של תרכובות שיתוף טיהור, הערכה של RNA או DNA, טוהר וזיהוי של NA שייר או זיהום סוכר בדגימות חלבון. לדוגמה, אנ לא רצוי זוהה על ידי המבחנים שלנו ניתן להסיר מן הכנת חלבון באמצעים כימיים (הידרוליזה למשל, אלקליין של רנ"א) או עיכול אנזימטי (למשל, טיפול nuclease). למרות שיש גישות חלופיות ליישומים כגון, השיטות שתוארו כאן הן יעילות ביותר במונחים של זמן ועלות, ויכולה לכן ניתן לשלב בקלות לתוך זרימת עבודה ניסיונית. זיהוי המוקדם של תרכובות שיתוף טיהור כללא סוכר צמצום, רנ"א, דנ"א, או חלבון יכול להנחות את העיצוב של שלבים לטיהור במורד זרם, לעומת משפט מייגע ומחקרי שגיאה. צעד משותף בעקבות הפרוטוקולים שלנו יכול להיות הבידוד של RNA מ-DNA וחלבון, באמצעות מיצוי thiocyanate-פנול כלורופורם, או שחזור של ה-DNA האלוןדואר (לא כולל על ידי thiocyanate). ²⁰ על מנת להעריך את טוהר NAS תוצאה מעקירות פנול כלורופורם, מבחני colorimetric אלה יכולים לשמש כאלטרנטיבה פשוטה לאלקטרופורזה או טיפול DNase. במובנים אלה ואחרים, את מבחני colorimetric המתוארים כאן יכולים להיות משולבים עם שיטות מבוססות היטב לחלבון ונחישות כדי להשיג NA מערכת מהירה וחזקה להבהרת רנ"א, דנ"א, חלבונים ורכיבים בדגימות biomolecular הטרוגניות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.