Быстрое колориметрических тестов на качественно Различают РНК и ДНК в биомолекулярных образцов

Summary

Набор колориметрических тестов описан быстро отличительной белков, РНК, ДНК, и вновь ducing сахара в потенциально гетерогенных образцов биомолекул.

Abstract

Биохимические эксперименты как правило, требует точного знания, на ранней стадии, в состав нуклеиновых кислот, белков и других компонентов биомолекулярной в потенциально гетерогенных образцов. Нуклеиновые кислоты могут быть обнаружены через несколько устоявшиеся подходы, включая аналитические методы, которые спектрофотометрического (например, _260), флуорометрической (например, связывания флуоресцентных красителей), или колориметрическим (нуклеозид конкретных хромогенных химических реакций). ¹ Хотя это не легко отличить РНК от ДНК, ₂₆₀ / A ₂₈₀ отношение обычно используется, так как она предлагает простой и быстрый ² Оценка относительного содержания нуклеиновых кислот, которые поглощают преимущественно вблизи 260 нм и протеина, который поглощает в основном вблизи 280 нм. Коэффициенты <0,8 принимаются как показатель «чистые» образцы белка, в то время как чистая нуклеиновой кислоты (NA) характеризуется отношение> 1,5 ^3.

HoWever, существуют сценарии, в которых белок / NA содержание не может быть столь же четко и надежно вывести из простого UV-VIS спектрофотометрического измерения. Например, (я) образцы могут содержать один или несколько белков, которые являются относительно лишенной ароматические аминокислоты отвечают за поглощение при ≈ 280 нм (Trp, Tyr, Phe), как и в случае с некоторыми малыми РНК-связывающие белки, и (II), образцы могут проявлять промежуточные A ₂₆₀ / A ₂₈₀ соотношения (~ 0.8 <~ 1.5), где белок / NA содержание гораздо менее ясен и даже может отражать некоторые высоким сродством связь между белком и Н. А. компонентов. Для такого сценария, мы опишем здесь набор колориметрические анализы быстро отличать РНК, ДНК, и снижение сахара в потенциально смешанного образца биомолекул. Методы опираются на различную чувствительность пентоз и других углеводов, чтобы Бенедикта, Bial (в орцинола), и Дише (в дифениламина) реагентов; обтекаемой протоколов может быть комзавершена в течение нескольких минут, без каких-либо дополнительных шагов от того, чтобы изолировать компоненты. Анализы могут выполняться параллельно проводить различие между ДНК и РНК, а также указывают на наличие свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза и (рис. 1).

Introduction

Большая часть клеточной биологии происходит через молекулярные взаимодействия с участием ДНК и РНК. ⁴ Эти естественные нуклеиновых кислот (НО) взаимодействуют друг с другом, ⁵ с белками, ⁶ и с множеством малых молекул соединений и лигандов в естественных условиях (например, двухвалентных катионов ^7). Взаимодействия могут быть кратко-или долгосрочных (кинетически), могут варьироваться от умеренных до высоких к низким сродством (термодинамические силы), а также может обладать существенным изменением химических свойств и специфики - некоторые ассоциации являются достаточно специфическими (например, ДНК · · факторы транскрипции, РНК · · · факторы сплайсинга), в то время как другие взаимодействия обязательно являются гораздо более общие (например, ДНК · · · бактериальный гистона-подобных белков HU ^8). Non-специфическими взаимодействиями с НСБУ может иметь практические последствия для лабораторного эксперимента с участием смесей biomolecules, как это возможно, и даже вероятно, что некоторые ВПЛ будут ассоциировать с биомолекул интерес, по крайней мере в некоторое подмножество экспериментальных условиях используются (ионной силы, рН раствора и т.д.).

Рассмотрим, например, производство белка интереса (POI) через гетерологичных чрезмерной экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia культуре клеток кишечной; такая процедура обычно выполняется практически в любой лаборатории структурной биологии ⁹ В подготовкой для дальнейших экспериментов, например. как биохимическая / биофизических характеристик, кристаллизация, и т.д.., первоначальные усилия правило, сосредоточены на получении достаточного количества POI в качестве чистой, по возможности, идеально, как химически однородной и биофизически монодисперсных образцов. После разрушения клеток-хозяев, на ранних стадиях типичный рабочий процесс очистки стремиться изолировать POI из E. палочки белков, нуклеиновых кислот, мусор клеточной стенки,и другие компоненты клеточных лизатов. Тем не менее, хозяин NAS может совместно очищают с POI в течение нескольких физико-химических причин - очень основной POI могут неспецифически выпадающего хозяин ДНК / РНК; POI могут иметь общие NA-связывающей активности (например, вышеупомянутый HU); POI может быть достаточно конкретным NA-связывающего белка, но экспонат перекрестной реактивности с принимающей РНК или ДНК, принимающих NAS может взаимодействовать с матрицей хроматографии и тем самым просто совместно элюируются с POI, и так далее. Неизбирательное, высокое сродство связывания хозяин NAs к POI могут представлять неприятная проблема, потому что НС примесей, скорее всего, мешают вниз по течению экспериментов (например, анализы флуоресценции анизотропии POI • связывание РНК ^10). Кроме того, непредвиденные POI · · · НС ассоциации также могут быть просмотрены случайно, так как такое взаимодействие освещения нуклеиновой кислоты связывающей способности POI автора. В любом случае, независимо от того НАН Украины являются ключевыми компонентами или загрязняющих веществ, нужно сначала количественно иопределить тип (ДНК, РНК) совместной очистки НАН Украины в подготовке к вниз по течению экспериментов.

Некоторые аналитические методы для обнаружения и количественного НАН Украины в образце. Большинство из доступных методов принципиально либо спектрофотометрический (например, A ₂₆₀ значения абсорбции и ₂₆₀ / A ₂₈₀ коэффициентов), флуорометрической (например, связывание тиазола оранжевого или других флуоресцентных красителей НС), или колориметрическим (восприимчивость нуклеозидов в химических реакциях что выход хромофоров поглощающие в УФ-VIS области электромагнитного спектра), а недавно описаны де Мей и др. ^1. Тем не менее, важным шагом в определении типа полинуклеотид как РНК или ДНК, выходят за рамки многих из этих количественного подходы. Здесь мы предлагаем набор колориметрических тестов для быстрого выявления типов компонентов НС в белковой образца.

Протоколов, описанных здесь сбыть эффективно выполнены без дополнительных мер изоляции потенциальных примесей NA, и полагаться на анализ Бенедикта для снижения сахара ^11, орцинола анализа для пентоз ^12,13 и ^14,15 реакции дифениламина 2'-deoxypentoses (рис. 1 и 2) . Тест Бенедикт (рис. 2а) использует способность линейной, открытой цепью (альдегид) форма альдозы сахара снизить Cu ^{2 +,} с сопутствующей окисление карбонильных сахара в карбоксилат фрагмент и производства Cu ₂ O в качестве нерастворимого красного осадка. Эта реакция будет положительной реакцией с бесплатным снижения сахара, такие как альдоз и кетоз (которые преобразуют в соответствующие альдоз через enediol промежуточные продукты), но не с пентозы сахара, которые зафиксированы в циклической форме, как часть ковалентной основу ДНК или РНК полинуклеотида. В связи с минималистичным требование свободного полуацеталь функциональность, другие сотрудничествеmpounds, которые могли бы положительный результат в этом тесте - и, следовательно, выступать в качестве потенциальных мешающих - включают α-гидрокси-кетоны и коротких олигосахаридов (например, дисахарид мальтозу). И Bial в орцинола (рис. 2б) и Дише в дифениламина (рис. 2, в) реакции основаны на начальном разрушение полинуклеотида позвоночника, через депуринизации нуклеозида и дальнейшего кислоты или основания катализируемого гидролиза родителей нуклеотида, с получением фуран-2 -карбальдегида (фурфурол) производные; эти производные затем реагировать либо с полигидрокси фенола, такие как орцинола (Bial) или дифениламина (Дише автора) реагентами с образованием окрашенных продуктов конденсации в значительной степени неизвестной химической структуры. ДНК по сравнению с РНК специфика анализа Дише проистекает из того факта, что пентозы сахара должно быть 2'-венозная для того, чтобы быть восприимчивым к окислению ω-hydroxylevulinyl альдегид, который далее реагирует с дифениламинав кислых условиях с получением ярко-синий конденсата (рис. 2). Использование обтекаемой протоколов, описанных здесь, мы обнаружили, что эти сахара конкретных колориметрических реакций могут дифференцироваться между РНК и ДНК, а также будет свидетельствовать о наличии свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза или в молекулярно-биологических образцов.

Protocol

1. Бенедикт анализа для редуцирующих сахаров

1. Подготовить соответствующее количество реагентов Бенедикта - 940 мм безводного карбоната натрия, 588 мМ цитрат натрия дигидрат, 68 мм меди (II) сульфата пентагидрата. Этот реагент можно хранить при комнатной температуре (RT) в течение по крайней мере шести месяцев без заметного изменения реактивности.
2. Данный реагент 6x. Таким образом, для 600 мкл реакции, добавить 100 мкл реагентов Бенедикта в чистом 1,5 мл микроцентрифужных трубки (например, Eppendorf бренда), на пробу, чтобы быть проанализированы.
3. Добавить в пределах от 10 мкл до 500 мкл образца к этой трубе; оптимальный объем может быть определен, исходя из интенсивности цвета образование в начальной пробного пуска. Если достаточное образец доступен затем начать такие испытания при максимальном возможном объеме выборки (т.е. пять шестых от общего объема реакцию, 500 мкл образца в данном случае), а затем разбавить в последующих анализах.
4. Добавить DDH ₂ O в тубыть направлена ​​на конечного объема до 600 мкл; смешивать раствор встряхиванием или пипетки.
5. Инкубируйте образцы в течение 20 мин в кипящую водяную баню.
6. Снимите с подогревом образца из ванны и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Центрифуга образцов труб при температуре> 9300 мкг (~ 10000 оборотов в минуту в FA45-24-11 Эппендорф с фиксированным углом ротора) в течение 5 мин для того, чтобы осадить любого сыпучего материала; этот шаг является более важным для количественных, а не качественных исследований.
8. Алиготе супернатант из этой трубки в чистую кювету.
9. Пустым UV-VIS спектрофотометр с водой.
10. Измеряют поглощение этого образца при 475 нм.

2. Орцинола Bial в Пробирной для пентозные сахара

1. Подготовить соответствующее количество реагентов свежие Bial автора - 24,2 мм орцинола моногидрат (см. рис 2b для структуры этого соединения), 6 М HCl, 0,025% вес / объем гексагидрат хлорида железа Примечание.:Для длительного хранения реагента Bial может быть подготовлен в виде двух отдельных решений складе: (I) Реагент [0,05% вес / объем FeCl3 • 6H ₂ O в концентрированной HCl] и (II) Реагент B [422 мм орцинола моногидрат подготовлены в 95 % этанола]. Реагент можно хранить при комнатной температуре в течение шести месяцев; реагент B можно хранить при температуре 4 ° С в течение одного месяца, покрытый фольгой, чтобы ограничить освещенности. Эти растворы смешивают в 15 (A): 1 (B) / об соотношении перед применением.
2. Данный реагент 2x. Таким образом, в течение 1,0 реакций мл, добавить 500 мкл реагента Bial на чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл на пробу, чтобы быть проанализированы.
3. Добавить в пределах от 10 мкл до 500 мкл образца к этой трубе. По сведению 1,3 (выше), если достаточное образец доступен затем начать судебное разбирательство реакций с использованием максимально возможного объема образца (то есть, половина общего объема реакцию, 500 мкл образца в данном случае) и разбавить оттуда.
4. Добавить DDH ₂ O в трубу довести FИнал объеме 1,0 мл; смешивать раствор встряхиванием или пипетки.
5. Инкубируйте образцы в течение 20 мин в кипящую водяную баню.
6. Снимите с подогревом образца из ванны и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Центрифуга образцов труб при температуре> 9300 мкг (~ 10000 оборотов в минуту в FA45-24-11 Эппендорф с фиксированным углом ротора) в течение 5 мин для того, чтобы осадить любого сыпучего материала; этот шаг является более важным для количественных, а не качественных исследований.
8. Алиготе супернатант из этой трубки в чистую кювету для визуального осмотра.
9. Для полуколичественного анализа, пустой UV-VIS спектрофотометр с водой и измеряют оптическую плотность образца кювете при 660 нм.

3. Дифениламин Дише в Пробирной для 2'-deoxypentose Сахара

1. Подготовить соответствующее количество реагентов дифениламина Дише - 60 мМ дифениламина, 11 M ледяной уксусной кислоты, 179 мм серной кислоты, 62% об / об этанола. Этот реагент может быть предварительнопо сравнению заранее и хранить при комнатной температуре в темном контейнере, или покрыта фольгой, чтобы ограничить освещенности. Из-за чувствительности к свету реагентов не должны храниться на неопределенный срок, хотя на практике она может быть подготовлен каждые два-три месяца без видимых изменений реактивности.
2. Данный реагент 2x. Таким образом, в течение 1,0 реакций мл, добавить 500 мкл реагента Дише на чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл на пробу, чтобы быть проанализированы.
3. Добавить в пределах от 10 мкл до 500 мкл образца к этой трубе. По сведению 1,3 (выше), если достаточное образец доступен затем начать судебное разбирательство реакций с использованием максимально возможного объема образца (то есть, половина общего объема реакцию, 500 мкл образца в данном случае) и разбавить оттуда.
4. Добавить DDH ₂ O к трубке, чтобы принести окончательный объем в мл 1,0; смешивать раствор встряхиванием или пипетки.
5. Инкубируйте образцы в течение 20 мин в кипящую водяную баню.
6. Снимите с подогревом образца из ванны и аллож ему остыть при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Центрифуга образцов труб при температуре> 9300 мкг (~ 10000 оборотов в минуту в FA45-24-11 Эппендорф с фиксированным углом ротора) в течение 5 мин для того, чтобы осадить любого сыпучего материала; этот шаг является более важным для количественных, а не качественных исследований.
8. Алиготе супернатант из этой трубки в чистую кювету для визуального осмотра.
9. Для полуколичественного анализа, пустой UV-VIS спектрофотометр с водой и измеряют оптическую плотность образца кювете при 600 нм.

4. Далее Замечания по использованию

1. Следующие классы молекул подходящие соединения ссылки для положительного и отрицательного контроля реакции для каждого анализа:
   • Бенедикт - Положительные = свободный рибоза, фруктоза, глюкоза, отрицательные = РНК, ДНК, АТФ, и т.д.. (Любой сахарида не хватает свободного снижения сахара функциональности)
   • Bial автора - Положительные = РНК (дрожжевой экстракт, например, пекаря), рибоза, АТФ, UMP; Отрицательные = бычьего серит альбумина (БСА) или любой другой белок
   • Дише автора - Положительные = ДНК (например, зобной железы теленка); Отрицательные = РНК, АТФ и т.д.. (Любой не-2'-венозная нуклеотид)
2. Эти анализы были найдены, чтобы быть достаточно устойчивыми к соединениям часто используется в очистке белков, например, общие соли, такие как NaCl, (NH _{4) 2} SO ₄ и K ₂ SO ₄ не мешает, и реакции появляются обычно не зависит от Содержание растворителя. Моющие средства или хаотропных агентов, таких как мочевина может повлиять на реактивность анализы, если рН очень основные, нейтральные к кислой области рН, как правило, наиболее оптимальной для Bial и анализы Дише, потому что базовой химии реакции (см. текст и протонов на рисунке 2, б). Потенциально оптимальным условиям реакции, мешающих подозреваемых, и т.д.. должны быть проверены в каждом конкретном случае на индивидуальной основе, используя положительные и отрицательные контрольные эксперименты сого соединения ссылки.

Representative Results

Результаты представлены на рисунке 3 для применения этих колориметрических тестов с известными соединениями ссылки. Представитель качественные данные приведены для (а), Бенедикт Bial в орцинола (б) и Дише в дифениламина (C) анализы, и стандартные кривые для этих трех анализов показано на рисунке 4. В панели 3 (переменного тока), левая панели показывают положительный / отрицательный контроль экспериментов с использованием соответствующей реактивной / инертны аналитов; эти визуальные результаты приведены на месте, в кюветах, как описано в протоколах 1-3 (выше). Право суб-панели показывают титрования серии для каждого соответствующего аналита. В анализе Бенедикт (а), положительный контроль рибоза (0,42 мг / мл), в то время как отрицательный контроль являются вода, общий белок (0,75 мг / мл BSA), и два невосстанавливающих сахара (ДНК на уровне 0,75 мг / мл и РНК в дозе 12,5 мг / мл). В орцинола анализа (б), положительные элементы управления рибоза (0,15 мг / мл), РНК (7,5 мг / мл) и ДНК (0,45 мг / мл), в то время как вода и BSБелка (0,45 мг / мл) отрицательные элементы управления. В анализе дифениламина (с), ДНК тимуса теленка (0,45 мг / мл) показан в качестве положительного контроля, и вода, экстракт дрожжей РНК (7,5 мг / мл), рибоза (0,15 мг / мл) и BSA (0,45 мг / мл) служат в качестве отрицательного контроля. Наконец, панели (D) иллюстрирует надежность анализов, показывая реакцию Дише с образцами различной неоднородности: две концентрации ДНК показал в качестве положительного контроля в левом двух образцов (кюветы 1-2), ДНК + РНК смесей ( при различных соотношениях) представлены в течение ближайших трех образцов (3-5), а последние три образцов показывают ДНК в отсутствие (образец 6) или наличие (образцы 7-8) из нуклеиновой кислоты-связывающий белок "Hfq. ¹⁶ Обратите внимание, что положительный результат теста на Дише сохраняется для ДНК-содержащие образцы, даже в присутствии «загрязнять» РНК или белка.

Количественный анализ: разведение диапазона на рисунке 3 (а-в) панели меняются, потому что каждыйРеакция имеет четкие визуальные предела обнаружения, в зависимости от типа сахара настоящее время анализируют. Спектрофотометрическое, а не визуальное, обнаружение может быть использован для улучшения диапазона измерений, например, как показано на рисунке 4 (а) Бенедикт, (б) Bial, и (с) анализы Дише в. Хотя протоколы, описанные здесь, предназначены в первую очередь как качественные анализы, Beer-Lambert связь между оптической плотности и концентрации позволяет по крайней мере, полу-количественная оценка сахара или содержание нуклеиновых кислот. В качестве примера стандартную кривую для калибровки теста Бенедикта, линейной аппроксимации регрессии поглощения (475 нм) от концентрации рибозы показано на рисунке 4 (а); погрешности указывают стандартное отклонение = 3 репликацию, и квадрат коэффициента корреляции предоставляется. Отклонение от линейности при очень низких концентрациях рибоза (например, 0,28 мм данное) отражает ограниченную чувствительность этого теста. Хотя, какговорит, в первую очередь предназначены для качественных исследований, следующие рекомендации предлагаются для полуколичественного анализа:

• Для анализа Бенедикт (рис. 4): реакция считывания _(475nm) оказалась линейной по крайней мере, в пределах 0,04 → 0,5 мг / мл анализируемого вещества, как выполняется в трех экземплярах.
• Для анализа Bial (Рисунок 4б): поглощение данных _{(660 нм)} были линейными по крайней мере, в диапазоне 0 → 0,5 мг / мл анализируемого (пекарские дрожжи РНК), анализ того, были проведены в трех экземплярах (R ² = 0,99 линейной регрессии коэффициент). Хотя образцы центрифугировали для разъяснений, прежде чем поглощение измерений, не осадителя был найден при таких низких концентрациях аналита и, следовательно, центрифугирования шаг не является строго обязательным. Анализ отклоняется от линейности при концентрации аналита за пределы этого диапазона.
• Для анализа Дише (Рисунок 4в): _{600 нм} 2 = 0,99). Сюжет поглощения по сравнению с [аналита] стали плато на 0,90 мг / мл ДНК, что указывает на границе области линейного отклика.
• Практические соображения для количественного или полуколичественного анализа: Для удаления осажденного материала, которые могли бы препятствовать поглощению показания, все три анализы требуют центрифугирования при максимальных скоростях (25.000 мкг, или что предел может быть выдерживают трубы микроцентрифуге) за разумные промежутки времени (например, 20 мин); это особенно важно при высоких концентрациях аналита. После центрифугирования, уточнил образцы могут быть переданы в кювет или планшет (например, 96-луночные микротитровальные) для удобного измерения оптической плотности.

Рисунок 1. Схема принятия решений для применения анализов. Начиная с потенциально гетерогенных образцов биомолекул (например, от целого клеточных лизатов), колориметрических анализов, описанных здесь, может использоваться для определения, если смесь содержит невосстанавливающих сахара (тест Бенедикта). Если так, то орцинола тест Bial в дальнейшем показывает, является ли население невосстанавливающих сахара содержит пентозы кольца (как в ДНК или РНК), по сравнению с гексозы (например, глюкоза, другие pyranoses) и, возможно, еще в других альдоз. Наконец, если образец содержит по крайней мере умеренные фракции ДНК, то 2'-дезоксирибозы кольцо будет реагировать (на подкисление и отопление) с дифениламина реагента Дише, уступая заметно синего продукт конденсации. Заметим, что эта схема является дерево решений, а не блок-схемы: логика результаты анализа показано, сerially, но анализы могут выполняться параллельно.

Рисунок 2. В основе химических реакций показаны для колориметрических анализов, с обнаруживаемых окрашенного продукта указан рядом с соответствующей реакции. (А) нерастворимыми, красный осадок Cu ₂ O является положительным результатом анализа Бенедикта для снижения сахара. (Б) При нагревании и подкисления, содержащие сахара пентозы кольца будут разлагаться с фурфурола, который затем реагирует с орцинола (реагент Bial в) с получением растворимых сине-зеленый аддукта. В анализе Дише, в отсутствие гидроксильных заместителя в 2 'положение позволяет с раскрытием кольца реакции окисления альдегидов продуктом которой дальнейшем реагирует с дифениламина [(Ph) ₂ NH] с получением ярко-синего продукта. Химическая улructures остаются неизвестными для больших, мульти-кольцо продуктов конденсации орцинола (б) и дифениламина (с) реакции.

Рисунок 3. Применение колориметрического анализа для эталонных соединений и гетерогенных образцов. Результатов Примеры приведены для Бенедикта (а), Bial (B), и Дише (C) колориметрических анализов. В () → (C), левый суб-панели показывают положительные / отрицательные элементы управления с помощью соответствующей реактивной / инертны аналитов и право суб-панели показывают титрования серии для каждого анализируемого вещества. Также показана иллюстративная панель реакции Дише (г), в которой аналита варьируется в неоднородности - либо только ДНК (слева), ДНК / РНК смеси различных соотношениях (в центре), или ДНК в присутствии нуклеиновой кислоты, белок, ассоциированный ( "Hfq»). Эти панелиболее подробно описаны в разделе Представитель Результаты текста.

Рисунок 4. Стандартные кривые из анализов со ссылкой соединений. Калибровочные кривые приведены для Бенедикта (а), Bial (B), и Дише (C) анализы, изображающие представителей часть линейной области отклика для каждого анализа. Линейные регрессии и соответствующие коэффициенты корреляции указаны для каждого анализа. Стандартный хлебопекарных дрожжей РНК (б) и ДНК тимуса теленка (с) были аналитов в этих титрования серии. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Discussion

Колориметрических тестов, представленные здесь предлагают простой подход к быстрой оценки химической природы биомолекулярных смесей, таких как встречаются при очистке белков, РНК или комплексы из цельного клеточный лизат в подготовке для дальнейших исследований. Как структурной биологии проводит более родной, как и собраний, постепенно более серьезные проблемы, такие, как неоднородность образца, будет, обусловленных сложным и многокомпонентных комплексов. Супрамолекулярных ансамблей часто лишь незначительно стабильной и успешной изоляции может потребовать менее жесткие условия очистки (например, как найти для spliceosomal комплексов snRNP ^17,18). В таких мягких условиях, как подлинные и ложные POI · · · НС взаимодействия, скорее всего, сохранится и тем самым мешать в последующих анализах с белком-мишенью или нуклеиновые кислоты. Необходимым первым шагом является определение типов химических компонентов в этих образцах.

ve_content "> Методы выявления РНК, ДНК и белков варьируется в зависимости от количества и концентрации анализируемых веществ, имеющихся ресурсов и временных ограничений, и, пожалуй, самое главное, своих предварительных знаний о возможных химического состава веществ. белковый материал может быть обнаружен много хорошо известных методов, в том числе тех, которые являются спектроскопические _(280), гидродинамические (гель-электрофорез), химическая / колориметрических ¹⁹ (например, биурета тест для пептидных связей) и, с большой чувствительностью и точностью, с помощью масс-спектрометрии. Точно так же, NAS могут быть обнаружены спектроскопических _(260), флуорометрической или химического анализа (описано здесь). Каждый тип метода черты, характерные сильные и слабые стороны. Например, PicoGreen, SYBR-Gold и другие цианиновые на основе флуоресцентных красителей весьма чувствительны к нуклеиновые кислоты (на много порядков за колориметрических анализов), обладают различной степенью селективности (например, PicoGreen для двухцепочечной ДНК, SYBR-Gold связывает большинство NAS), а также имеют широкий динамический диапазон для количественного определения целей. Тем не менее, эти подходы не без ограничений: красители требуют более современное оборудование для обнаружения (трансиллюминаторы для гелей, спектрофлуориметров для пакетной образцов), по сравнению с простым визуальным считыванием колориметрических анализов, красители, рассматриваются как мутагены, сродни этидийбромидом, и там ограничения на анализе условий (например, рекомендуемый диапазон рН 7-8,5 для SYBR-Gold, 30% снижение интенсивности сигнала на PicoGreen> 200 мм NaCl). Таким образом, колориметрические и флуоресценции основе анализа дополняют друг друга: нуклеиновые кислоты, красителей может быть особенно полезно в случае отрицательных результатов с быстрым колориметрических анализов, или как способ более тщательно (в количественном выражении) расширить первоначальные результаты колориметрических анализов. Основным преимуществом колориметрических протоколов НС, в дополнение к простоте использования, является то, что они полагаются исключительно на внутренние сотрудничествавалентные структуры НАН, а не fold/3D структуры, реакционной способности, или любые другие свойства биополимеров, которые могут меняться в зависимости от последовательности.

Протоколы, описанные здесь, устойчив к самым трудности, особенно когда они выполняются с простой визуальный осмотр продуктов реакции; особое внимание должны быть приняты дополнительные количественные (спектрофотометрический) анализы. Например, в тесте Бенедикта красного осадка (РРТ), который образует в присутствии высоких концентраций рибозы должны быть удалены до спектрофотометрического анализа, это легко достигается с помощью центрифугирования. Для анализа Дише, в добавление реагента дифениламина сопровождается образованием белого п.п., которые могут быть растворены при нагревании; зеленой п.п., которая образуется в присутствии ДНК может помешать спектрофотометрического измерения и должны быть удалены до количественного анализа. Кроме того, каждый анализ основан на химической реакции, которые являются восприимчивымипотенциальных мешающих, как уже упоминалось во введении и подробно изложено ниже. Наконец, отметим, что высокая относительная концентрация РНК в ДНК / РНК смесь может маскировать ожидаемый положительный результат анализа Дише автора, это ложный отрицательный ДНК связано с тем, что высокая доля молекул РНК также реагирует, через фурфурола промежуточных продуктов, с реагентами Дише, но дает бесцветный продукт, а не синие аддукт производится с помощью реакции с 2'-deoxypentose сахара ДНК.

Потенциальные мешающих: Помимо очевидных случае сахаров, липидов и белков два других биомолекул, что гипотетически мог бы вызвать проблемы с этим колориметрических тестов, в связи с перекрестной реактивности (ложных срабатываний) или масках реактивности (ложный отрицательный результат). В принципе, несколько типов липидов клеточных вполне может вмешиваться, в том числе glycosylglycerols и других глицеролипидов сопряженных с сахарами, гликосфинголипиды (например, восковинаbrosides), saccharolipids (например, глюкозамин производные), липополисахариды, и так далее. На практике эти классы липидов вряд ли создают проблемы в работе с липофильных белков, потому что они относительно редко, по сравнению с гораздо более распространены фосфолипиды, и, следовательно, ниже пределов обнаружения наших анализов. Потому что большинство из указанных липидов клеточных построены на гексозы (галактоза, глюкоза), а не пентоз, они не должны вмешиваться в ложных срабатываний в Bial или анализы Дише автора. Бесплатные моносахаридов, которые могут давать ложно-положительные включают фруктозы, galactofuranose или других furanoses. На соответствующую записку, помех со стороны нежелательных сахара может стать проблемой для рекомбинантных белков выражены с мальтоза-связывающий белок (MBP) теги. В аффинной хроматографии шаги, используемые для очистки таких конструкций синтеза, мальтозы используется для вымывания белка, и можно предположить, что остаточная мальтозы в низовьях препараты могут помешать йэлектронной Бенедикта анализа (это наиболее общая / неспецифической из анализов; единиц глюкозы мальтозы не должны реагировать в соответствии с Bial или Дише автора). Таким образом, можно было бы проявлять осторожность в пост-хроматографического шаги, чтобы гарантировать, что остаточный мальтозы не дают ложные результаты. Мы не тестировали glucosylated белки или другие гликопротеины, но мы подозреваем, что это будет трудно получить четкий положительный результат на наличие сахара на такие белки (или гликолипидов, протеогликанов и других гликоконъюгатов), поскольку мы ожидаем, что гликана фрагментов бы лежат ниже предела чувствительности наших анализов. В принципе, раствор, содержащий бесплатные aldohexose такие как глюкоза, освобожденных от glucosylated белка с помощью кислотного гидролиза, будет положительный результат на тесте Бенедикта, аналогично гликопротеин-производные пентоз, такие как ксилоза, должны дать положительный результат в Bial автора анализа. Однако, на практике положительный результат для гликопротеинов потребует чрезвычайно ч IgH концентрации белка, даже для многосвязных гликозилированные полипептиды, из-за низкого содержания сахара / молярное соотношение белков.

Анализ протоколов, описанных здесь, может быть расширена и адаптирована для обработки пределах небольшого размера выборки - то есть, небольшими объемами или низкими концентрациями аналитов. Для ограниченное количество образцов мы обнаружили, что реакция может быть уменьшено до 100-мкл диапазоне (например, с использованием ПЦР пробирок и амплификатор для инкубации). Для небольших объемов образцов при низких концентрациях (около предела обнаружения), Спектрофотометр оснащен пластиной-ридер может быть использован, в таких случаях, только ожидаемые трудности были бы удаление нежелательных осадителя до поглощения измерений. Несмотря на ограниченную дальность обнаружения простого визуального осмотра, преимущество подхода, описанного здесь, является его эффективность и быстрота, с образцами способны анализируемых мгновенно при нагревании.

"> Приложения протоколы, представленные здесь включать определение совместной очистки соединений, оценки РНК или ДНК чистоты и выявления остаточного сахара НС или загрязнения образцов белка. Например, нежелательные НС обнаружили наши анализы могут быть удалены из Подготовка белка с помощью химических средств (например, щелочного гидролиза РНК) или ферментативного расщепления (например, нуклеазы лечения). Несмотря на то, альтернативные подходы к таким приложениям, описанные здесь методы очень эффективны с точки зрения затрат времени и средств, и может Поэтому быть легко интегрированы в экспериментальных работ. раннее выявление совместно очистки соединений в качестве бесплатного снижения сахара, РНК, ДНК или белка может вести разработку ниже стадий очистки, по сравнению с трудоемким методом проб и ошибок исследования. общий шаг после нашего протоколов может быть выделение РНК из ДНК и белков, с помощью роданида-фенол-хлороформ или восстановления ДНК Алоне (исключая тиоцианата) ^20. Для оценки чистоты НАН результате фенол-хлороформом, эти колориметрических анализов могут быть использованы в качестве простой альтернативы электрофореза или ДНКазы лечения. В этой и другими способами, колориметрических анализов, описанных здесь, могут быть объединены с хорошо известными методами белка и Н. А. решимость добиться быстрой и надежной системой для выяснения РНК, ДНК и белковых компонентов в гетерогенных образцов биомолекул.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.