Rapid ensayos colorimétricos para distinguir cualitativamente ARN y ADN en muestras Biomolecular

Summary

Un conjunto de ensayos colorimétricos se describe para la proteína rápidamente distintivo, ARN, ADN, y ducing re-azúcares en muestras de biomoléculas potencialmente heterogéneos.

Abstract

Experimentación bioquímica general, requiere el conocimiento exacto, en una etapa temprana, del ácido nucleico, proteína y otros componentes biomoleculares en muestras potencialmente heterogéneos. Los ácidos nucleicos pueden ser detectados a través de varios métodos establecidos, incluyendo métodos analíticos que son espectrofotométrico (por ejemplo, A _260), fluorométrico (por ejemplo, la unión de tintes fluorescentes), o colorimétrico (nucleósidos específicos de reacciones químicas cromogénicos). ¹ A pesar de que no puede distinguir fácilmente ARN a partir de ADN, la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ se emplea comúnmente, ya que ofrece una simple y rápida ² evaluación del contenido relativo de ácido nucleico, que absorbe predominantemente cerca de 260 nm y proteínas, que absorbe principalmente cerca de 280 nm. Ratios <0,8 se toman como indicadores de muestras "puras" de proteínas, mientras que el ácido nucleico puro (NA) se caracteriza por relaciones de> 1,5 ^3.

Hobargo, hay escenarios en los que el contenido de proteína / NA no puede ser tan clara o fiable inferirse de simples uv-vis medidas espectrofotométricas. Por ejemplo, (i) muestras podrá contener una o más proteínas que son relativamente carente de los aminoácidos aromáticos responsables de la absorción a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), como es el caso con algunos pequeños ARN-proteínas de unión, y (ii) muestras pueden exhibir intermedio A ₂₆₀ / A ₂₈₀ ratios (~ 0,8 <~ 1,5), donde el contenido de proteína / NA es mucho menos clara e incluso pueden reflejar algunos de alta afinidad de la asociación entre la proteína y componentes de NA. Para tales escenarios, se describe en la presente memoria un conjunto de ensayos colorimétricos para distinguir rápidamente ARN, ADN, y azúcares reductores en una muestra mixta potencialmente de biomoléculas. Los métodos se basan en la sensibilidad diferencial de las pentosas y otros hidratos de carbono a Benedict, Bial (orcinol), y reactivos de Dische (difenilamina); los protocolos simplificados puede ser comcompletado en cuestión de minutos, sin ningún paso adicional de tener que aislar los componentes. Los ensayos pueden realizarse en paralelo a diferenciar entre ARN y ADN, así como para indicar la presencia de azúcares libres reductores tales como glucosa, fructosa y ribosa (Figura 1).

Introduction

Gran parte de la biología celular se produce a través de interacciones moleculares que interviene el ADN y el ARN. ⁴ Estos ácidos nucleicos de origen natural (AN) interactúan entre sí, con las proteínas, ⁵ y ⁶ con una serie de compuestos de pequeñas moléculas y ligandos in vivo (por ejemplo, cationes divalentes ^7). Las interacciones pueden ser de corta o de larga duración (cinéticamente), puede variar de alta a moderada a baja afinidad (fuerza termodinámica), y también pueden mostrar una variación sustancial en las propiedades químicas y la especificidad - algunas asociaciones son muy específicas (por ejemplo, ADN · · · los factores de transcripción, ARN · · · los factores de empalme), mientras que otras interacciones son necesariamente mucho más genérico (por ejemplo, el ADN · · · bacterianas histona-como las proteínas HU ^8). Interacciones no específicas con AN pueden tener consecuencias prácticas para los experimentos in vitro de mezclas de Biomolecules, ya que es posible, e incluso probable, que algunos AEs se asociará con las biomoléculas de interés, al menos en algún subconjunto de las condiciones experimentales que se utilizan (fuerza iónica, pH de la solución, etc.)

Consideremos, por ejemplo, la producción de una proteína de interés (POI) a través de la sobre expresión heteróloga de la proteína recombinante en cultivo de células de Escherichia coli; tal procedimiento se realiza rutinariamente en prácticamente cualquier laboratorio de biología estructural ⁹ En la preparación para experimentos adicionales, tales. como caracterización bioquímica / biofísica, cristalización, etc., los esfuerzos iniciales se centran generalmente en la obtención de una cantidad suficiente de la PDI en una forma tan pura como sea posible, idealmente como un espécimen químicamente homogénea y monodispersas biofísicamente. Después de la interrupción de las células huésped, las primeras etapas de purificación de un flujo de trabajo típico para aislar el objetivo de PDI de E. coli proteínas, ácidos nucleicos, restos de pared celular,y otros componentes del lisado celular. Sin embargo, host NAS puede co-purificar con el POI por varias razones fisicoquímicas - un PDI altamente básica puede no específicamente desplegable anfitrión de ADN / ARN, el POI puede tener un genérico NA actividad de unión (por ejemplo, el antes mencionado HU); el POI puede ser un bastante específico NA-proteína de unión, pero presentan reactividad cruzada con los ARN o ADN de acogida; anfitrión AN puede interactuar con una matriz de cromatografía y por lo tanto simplemente co-eluir con la PDI, y así sucesivamente. Indiscriminada, de alta afinidad de unión de anfitrión NAS a un POI puede plantear un problema molesto ya que las impurezas NA es probable que interferir con los experimentos posteriores (por ejemplo, ensayos de fluorescencia de anisotropía de POI unión • ARN ^10). Alternativamente, el PDI no anticipado · · · asociaciones NA también puede ser visto por casualidad, como tales interacciones iluminar el PDI ácido nucleico capacidad de unión. De cualquier manera, si AN son componentes claves o contaminantes, primero hay que cuantificar yidentificar el tipo (ADN, ARN) de AN co-purificación en preparación para experimentos posteriores.

Varios existen métodos analíticos para la detección y cuantificación de AN en una muestra. La mayoría de los métodos disponibles son fundamentalmente ya sea espectrofotométrico (por ejemplo, A ₂₆₀ y A valores de absorbancia ₂₆₀ / A ₂₈₀ coeficientes), fluorométrico (por ejemplo, la unión de tiazol naranja u otros colorantes fluorescentes a NA), o colorimétrico (susceptibilidad de nucleósidos para reacciones químicas que cromóforos absorbentes de rendimiento en la región UV-Vis del espectro electromagnético), como se describió recientemente por De Mey et al. ¹ Sin embargo, el paso crucial de identificar el tipo de polinucleótido como ARN o ADN está más allá del alcance de muchos de estos cuantificación enfoques. Aquí se proporciona un conjunto de ensayos colorimétricos para identificar rápidamente los tipos de componentes de NA en una muestra proteica.

Los protocolos descritos aquí cun ser ejecutados eficientemente sin etapas adicionales de aislamiento de las posibles impurezas de NA, y se basan en el ensayo de Benedict para azúcares reductores ^11, el ensayo de orcinol para pentosas ^{12,13, 14,15} y reacciones de difenilamina de 2'-deoxypentoses (Figuras 1 y 2) . Prueba de la Benedict (Figura 2a) utiliza la capacidad de la forma lineal, de cadena abierta (aldehído) de un azúcar aldosa para reducir Cu ^{2 +,} con la oxidación concomitante de carbonilo del azúcar a un resto carboxilato y producción de Cu ₂ O como un precipitado de color rojo insoluble. Esta reacción tendrá un resultado positivo con libres de azúcares reductores tales como aldosas y cetosas (que se convierten en las aldosas correspondientes a través de productos intermedios enediol), pero no con los azúcares de pentosa que están bloqueados en forma cíclica como parte del esqueleto covalente de un ADN o polinucleótido de ARN. Debido a la exigencia minimalista de una funcionalidad hemiacetal libre, co otrompounds que podrían dan positivo en este ensayo - y por lo tanto actuar como interferentes potenciales - incluyen α-hidroxi-cetonas y oligosacáridos cortos (por ejemplo, el disacárido maltosa). Tanto el de Bial orcinol (Figura 2b) y difenilamina Dische (Figura 2c), las reacciones se basan en la destrucción inicial de la columna vertebral de polinucleótido, a través de la despurinización del nucleósido y ácido-o adicionalmente catalizada por base hidrólisis de los nucleótidos matrices, para dar furano-2 -carbaldehído (furfural) derivados; estos derivados luego reaccionar ya sea con un polihidroxi fenol tal como orcinol (Bial) o difenilamina (Dische de) los reactivos para formar productos coloreados de condensación de estructura química en gran medida desconocido. El ADN frente a la especificidad de ARN de ensayo de la Dische se deriva del hecho de que el azúcar pentosa debe ser 2'-desoxigenado con el fin de ser susceptible a la oxidación a ω-hydroxylevulinyl aldehído, que además reacciona con difenilaminaen condiciones ácidas para producir un color azul brillante de condensado (Figura 2c). Utilizando los protocolos simplificados descritos aquí, se ha encontrado que estas reacciones colorimétricas específicas de azúcar puede diferenciar entre ARN y ADN, y también indican la presencia de azúcares libres reductores tales como glucosa, fructosa, ribosa o en una muestra biomolecular.

Protocol

1. Ensayo de Benedicto XVI para la reducción de azúcares

1. Preparar una cantidad apropiada de reactivo de Benedict - 940 mM de carbonato de sodio anhidro, 588 mM de sodio dihidrato de citrato, 68 mM de cobre (II) pentahidrato de sulfato. Este reactivo puede almacenarse a temperatura ambiente (RT) durante al menos seis meses sin ningún cambio notable en la reactividad.
2. El reactivo anterior es 6x. Así, para 600 reacciones mu l, añadir 100 l de reactivo de Benedict a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml (por ejemplo, Eppendorf marca), por muestra a ensayar.
3. Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo, el volumen óptimo se puede determinar basándose en la intensidad de formación de color en un periodo de prueba inicial. Si la muestra se dispone de suficiente entonces comenzar tales ensayos en el volumen de muestra máximo posible (es decir, las cinco sextas partes del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso), y luego se diluye en los ensayos posteriores.
4. Añadir ddH ₂ O para el tuser para llevar el volumen final a 600 l; mezclar la solución por agitación o pipeteo.
5. Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo.
6. Retirar la muestra calentada del baño y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar el tubo de muestra en> 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos.
8. Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia.
9. Ponga el espectrofotómetro UV-vis con agua.
10. Medir la absorbancia de la muestra a 475 nm.

2. Ensayo orcinol Bial para pentosas

1. Preparar una cantidad adecuada de reactivo fresco de Bial - 24,2 mM monohidrato de orcinol (véase la figura 2b para la estructura de este compuesto), 6 M de HCl, 0,025% w / v cloruro férrico hexahidratado Nota.:Para un almacenamiento prolongado, el reactivo Bial se pueden preparar como dos soluciones madre por separado: (i) del Reactivo A [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O en HCl concentrado] y (ii) Reactivo B [422 mM de monohidrato de orcinol preparado en 95 % de etanol]. El reactivo A se puede almacenar a temperatura ambiente durante seis meses; Reactivo B se puede almacenar a 4 ° C durante un mes, cubierto con papel de aluminio para limitar la exposición de la luz. Estas soluciones madre se mezclaron en un 15 (A): 1 (B) proporción v / v antes de su uso.
2. El reactivo anterior es 2x. Así, por 1,0 reacciones ml, añadir 500 l de reactivo de Bial a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml, por cada muestra a ensayar.
3. Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo. Según nota 1,3 (arriba), si se dispone de suficiente muestra a continuación, iniciar reacciones del ensayo mediante el volumen máximo posible de la muestra (es decir, la mitad del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso) y se diluye a partir de ahí.
4. Añadir ddH ₂ O al tubo para llevar el final volumen a 1,0 ml, mezclar la solución por agitación o pipeteo.
5. Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo.
6. Retirar la muestra calentada del baño y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar el tubo de muestra en> 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos.
8. Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia para la inspección visual.
9. Para el análisis semicuantitativo, en blanco el espectrofotómetro UV-vis con agua y se mide la absorbancia de la muestra de celda a 660 nm.

3. Ensayo Dische de difenilamina para 2'-desoxipentosa Azúcares

1. Preparar una cantidad adecuada de reactivo Dische de difenilamina - 60 mM difenilamina, 11 M de ácido acético glacial, 179 mM de ácido sulfúrico, 62% v / v de etanol. Este reactivo puede ser preen comparación con antelación y se almacena a temperatura ambiente en un recipiente oscuro, o cubierto con papel de aluminio, para limitar la exposición a la luz. Debido a la sensibilidad a la luz que el reactivo no se deben almacenar indefinidamente, aunque en la práctica puede ser preparado cada dos a tres meses sin cambio aparente en la reactividad.
2. El reactivo anterior es 2x. Así, por 1,0 reacciones ml, añadir 500 l de reactivo de Dische a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml, por cada muestra a ensayar.
3. Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo. Según nota 1,3 (arriba), si se dispone de suficiente muestra a continuación, iniciar reacciones del ensayo mediante el volumen máximo posible de la muestra (es decir, la mitad del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso) y se diluye a partir de ahí.
4. Añadir ddH ₂ O al tubo para llevar el volumen final a 1,0 ml, mezclar la solución por agitación o pipeteo.
5. Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo.
6. Retire la muestra caliente de la bañera y la asignaciónw que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar el tubo de muestra en> 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos.
8. Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia para la inspección visual.
9. Para el análisis semicuantitativo, en blanco el espectrofotómetro UV-vis con agua y se mide la absorbancia de la muestra de celda a 600 nm.

4. Otras indicaciones de uso

1. Las siguientes clases de moléculas son compuestos de referencia adecuados para reacciones de control positivas y negativas para cada ensayo:
   • Benedicto XVI - Positivo = libre ribosa, fructosa, glucosa, Negativo = ARN, ADN, ATP, etc. (Cualquier sacárido carece de una funcionalidad sin azúcares reductores)
   • Bial - Positivo = ARN (por ejemplo, extracto de levadura de panadero), la ribosa, ATP, UMP, negativo = bovina serviciosum albúmina (BSA) o cualquier otra proteína
   • Dische de - Positivo = ADN (por ejemplo, de timo de ternera), negativo = ARN, ATP, etc. (Cualquier nucleótido no-2'-desoxigenada)
2. Estos ensayos se han encontrado para ser bastante resistentes a los compuestos a menudo utilizados en la purificación de proteínas, por ejemplo, sales comunes, tales como NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, y K ₂ SO ₄ no interfieren, y las reacciones aparecen generalmente no afectados por el contenido del diluyente. Detergentes o agentes caotrópicos, tales como urea pueden afectar a la reactividad de los ensayos si el pH es altamente básico; un neutro a intervalo de pH ácido es generalmente más óptima para la de Bial y ensayos Dische a causa de la química de la reacción subyacente (ver el texto y los protones de los en la Figura 2b, c). Potencialmente subóptimas condiciones de reacción, interferentes sospechosos, etc. debe ser probado en una base de caso por caso, con control positivo y negativo experimentos with compuestos de referencia.

Representative Results

Los resultados se muestran en la Figura 3 para la aplicación de estos ensayos colorimétricos para los compuestos de referencia conocidos. Los datos representativos se muestran cualitativos para (a), el orcinol Benedict Bial (B), y Dische de difenilamina (c) ensayos, y las curvas de calibración para estos tres ensayos se muestran en la Figura 4. En los paneles 3 (AC), los paneles de la izquierda muestran positivos / negativos experimentos de control usando analitos adecuadamente reactivos / no reactivo; estos resultados visuales se muestra in situ, en las cubetas, como se describe en los Protocolos 1-3 (más arriba). El derecho sub-paneles muestran una serie de titulación para cada analito respectivo. En el ensayo de la Benedict (a), el control positivo es la ribosa (0,42 mg / ml), mientras que los controles negativos son el agua, una proteína genérico (0,75 mg / ml de BSA), y dos azúcares no reductores (ADN a 0,75 mg / ml y el ARN a 12,5 mg / ml). En el ensayo de orcinol (b), los controles positivos son ribosa (0,15 mg / ml), ARN (7,5 mg / ml), y el ADN (0,45 mg / ml), mientras que el agua y BSUna proteína (0,45 mg / ml) son controles negativos. En el ensayo de difenilamina (c), ADN de timo de ternera (0,45 mg / ml) se muestra como control positivo, y el agua, extracto de levadura ARN (7,5 mg / ml), ribosa (0,15 mg / ml), y BSA (0,45 mg / ml) sirven como controles negativos. Finalmente, el panel (d) ilustra la robustez de los ensayos mediante la reacción que muestra la Dische con muestras de diferentes heterogeneidad: dos concentraciones de ADN se muestra como un control positivo en la izquierda dos muestras (cubetas 1-2), mezclas de ADN + ARN ( en varias proporciones) se muestran en las siguientes tres muestras (3-5), y las tres últimas muestras de ADN muestran en la ausencia (muestra 6) o en presencia (muestras 7-8) del ácido nucleico-proteína de unión 'Hfq'. ¹⁶ Obsérvese que el resultado positivo del análisis de la Dische se conserva para el ADN que contiene muestras, incluso en la presencia de "contaminantes" ARN o las proteínas.

Análisis cuantitativo: Los rangos de dilución en la Figura 3 (ac) paneles varían porque cadareacción tiene un límite de detección visual distinta, dependiendo del tipo de azúcar que se está ensayando. Espectrofotométrica, que visual, la detección se puede utilizar para mejorar los rangos de medición, por ejemplo, como se muestra en la Figura 4 para la de (a) Benedict, (b) es Bial, y (c) ensayos de Dische. Aunque los protocolos descritos aquí están destinados principalmente como ensayos cualitativos, la relación de Beer-Lambert entre absorbancia y concentración permite que al menos semi-cuantitativa de la estimación de azúcar o el contenido de ácido nucleico. Como un ejemplo de una curva estándar para la calibración del ensayo, el de Benedict, un ajuste de regresión lineal de la absorbancia (475 nm) frente a la concentración de ribosa se ​​muestra en la Figura 4 (a); barras de error indican la desviación estándar de n = 3 repeticiones, y el coeficiente de correlación al cuadrado se proporciona. La desviación de la linealidad a concentraciones de ribosa muy bajas (por ejemplo el dato mM 0,28) refleja la limitada sensibilidad de este ensayo. Aunque el comodice que se destinan principalmente a los estudios cualitativos, las siguientes directrices se sugieren para semi-cuantitativos de análisis:

• Para el ensayo de la Benedict (Figura 4a): La lectura de la reacción (A _{475 nm)} se encontró que era lineal al menos en el rango de 0,04 → 0,5 mg / ml de analito, tal como se realizó por triplicado.
• Para el ensayo de la Bial (Figura 4b): Los datos de absorbancia (A _{660 nm)} fueron lineales, al menos en el rango de 0 → 0,5 mg / analito ml (ARN levadura de panadero), el ensayo de haber sido realizado por triplicado (R ² = 0,99 regresión lineal coeficiente). Aunque las muestras se centrifugaron para clarificación antes de las mediciones de absorbancia, no precipitante se encontró a estas bajas concentraciones de analito y por lo tanto el paso de centrifugación no era estrictamente necesaria. El ensayo se desvía de la linealidad a concentraciones de analito más allá de este rango.
• Para el ensayo de Dische (figura 4c): La A _{600 nm} 2 = 0,99). La trama de absorbancia frente a [analito] comenzó a estabilizarse en 0,90 mg / ml de ADN, que indica el límite de la región de respuesta lineal.
• Consideraciones prácticas para el análisis cuantitativo o semicuantitativo: para eliminar el material precipitado que de otro modo interferir con las lecturas de absorbancia, los tres ensayos requieren centrifugación a velocidades máximas (25.000 xg, o lo que sea límite puede ser resistido por los tubos de microfuga) para longitudes de tiempo razonables (por ejemplo, 20 min), lo que es especialmente importante en las concentraciones de analito más altas. Después de la centrifugación, las muestras de aclarado puede ser transferido a una cubeta o de microplacas (por ejemplo, 96-y placas microtiter) para mediciones de absorbancia convenientes.

Figura 1. Árbol de decisiones para la aplicación de los ensayos. A partir de una muestra heterogénea potencialmente de biomoléculas (por ejemplo, a partir de lisados ​​de células enteras), los ensayos colorimétricos descritos aquí se pueden utilizar para determinar si la mezcla contiene azúcares no reductores (prueba de Benedict). Si es así, entonces la prueba orcinol Bial revela además si la población de los azúcares no reductores contiene anillos de pentosa (como en el ADN o ARN), frente a hexosas (por ejemplo, glucosa, piranosas otros) y, posiblemente, aún aldosas otros. Por último, si la muestra contiene al menos una fracción moderada de ADN entonces el anillo de 2'-desoxirribosa reaccionará (tras la acidificación y calentamiento) con el reactivo de Dische de difenilamina, obteniéndose un producto de condensación visible azul. Tenga en cuenta que este diagrama es un árbol de decisión, no un diagrama de flujo, la lógica de los resultados del ensayo se muestran serially, pero los ensayos se pueden ejecutar en paralelo.

Figura 2. Subyacentes a las reacciones químicas se muestran para los ensayos colorimétricos, con el producto de color detectable indicarán frente a las reacciones correspondientes. (A) un precipitado insoluble, rojo de Cu ₂ O es el resultado positivo del ensayo de Benedict para los azúcares reductores. (B) Tras el calentamiento y la acidificación, los azúcares que contienen anillos de pentosa se ​​descompondrá para furfural, que luego reacciona con orcinol (reactivo de Bial) para producir un color azul-verde soluble aducto. En el ensayo de Dische, la falta de un sustituyente hidroxilo en la posición 2 'permite una reacción de oxidación de apertura de anillo, el producto de aldehído de que además reacciona con difenilamina [(Ph) ₂ NH] para dar un producto de color azul brillante. Química structures siguen siendo desconocidos para los productos de gran tamaño, la condensación de múltiples anillos de los orcinol (B) y difenilamina (c) reacciones.

Figura 3. Aplicación de los ensayos colorimétricos para compuestos de referencia y muestras heterogéneas. Resultados de las muestras se muestran para el Benedict (a), Bial (b), y (c) ensayos colorimétricos de Dische. En (a) → (c), la izquierda sub-paneles muestran los controles positivos / negativos utilizando analitos adecuadamente reactivos / no reactivo y el derecho sub-paneles muestran una serie de titulación para cada analito. También se muestra un panel ilustrativos de reacciones Dische (d) en el que el analito varía en heterogeneidad - ya sea ADN solo (izquierda), ADN / ARN mezclas de diferentes proporciones (medio), o el ADN en presencia de un ácido nucleico asociada a la proteína ( 'Hfq'). Estos panelesse describen adicionalmente en la sección de resultados representativos del texto.

Figura 4. Las curvas estándar de los ensayos con los compuestos de referencia. Las curvas de calibración se muestran para el Benedict (a), BIAL (b), y de Dische (c) ensayos, que representa una porción representativa de la región de respuesta lineal para cada ensayo. La regresión lineal se ajusta y los correspondientes coeficientes de correlación se indica para cada ensayo. Estándar levadura de panadero ARN (b) y ADN de timo de ternera (c) fueron los analitos en estas series de valoración. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Discussion

Los ensayos colorimétricos se presenta aquí ofrecer un enfoque sencillo para evaluar rápidamente la naturaleza química de las mezclas de biomoléculas, tales como se encuentran cuando la purificación de proteínas, ARN o complejos de lisado de células enteras en preparación para estudios posteriores. Como la biología estructural persigue asambleas más similar a la nativa, los retos cada vez mayores, como la heterogeneidad de la muestra, se plantean los complejos complicados y multi-componente. Supramoleculares son a menudo sólo marginalmente estable, y su éxito en el aislamiento puede exigir condiciones de purificación menos estrictas (por ejemplo, como se ha encontrado para los complejos de snRNP spliceosomal ^17,18). Bajo tales condiciones más suaves tanto POI auténtico y espuria · · · interacciones de NA son más probable que persistan e interferir con ello en ensayos de aguas abajo con una proteína diana o ácido nucleico. Un primer paso necesario es la identificación de los tipos de componentes químicos en estas muestras.

ve_content "> Métodos para la detección de ARN, ADN y proteínas varían dependiendo de la cantidad y la concentración de los analitos, los recursos disponibles y las restricciones de tiempo y, quizás lo más importante, uno de conocimiento previo acerca de la composición química probable de los analitos. material proteínico puede ser detectado por muchos métodos bien establecidos, incluyendo los que son espectroscópico (A _280), hidrodinámica (electroforesis en gel), químico / colorimétrico ¹⁹ (por ejemplo, prueba de biuret por enlaces peptídicos) y, con gran sensibilidad y precisión, a través de espectrometría de masas. Igualmente, AN puede detectarse mediante ensayos espectroscópicos (A _260), fluorométrico, o químicos (descrito aquí). Cada tipo de método presenta puntos fuertes y puntos débiles característicos. Por ejemplo, PicoGreen, SYBR Gold, y otros tintes fluorescentes de cianina basado son bastante sensibles a ácido nucleico (muchos órdenes de magnitud más allá de los ensayos colorimétricos), presentan varios grados de selectividad (por ejemplo, PicoGreen de ADN de doble cadena, SYBR-Gold se une más NAS), y también disponen de amplios rangos dinámicos para fines de cuantificación. Sin embargo, estos enfoques no son sin límites: los tintes requieren equipos más avanzados para la detección (transiluminadores para geles, espectrofluorómetros de muestras de lotes), en comparación con la lectura visual simple de ensayos colorimétricos, los colorantes son tratados como mutágenos, similares a bromuro de etidio, y allí restricciones en las condiciones de ensayo (por ejemplo, un intervalo de pH recomendado de 7-8.5 para SYBR-Gold; una reducción del 30% de la intensidad de señal en PicoGreen> NaCl 200 mM). Así, ensayos colorimétricos y de fluorescencia basada-son complementarios: tintes de ácido nucleico podría ser particularmente útil en el caso de resultados negativos con los ensayos colorimétricos rápidos, o como una forma más cuidadosamente (cuantitativamente) ampliar los resultados iniciales de ensayos colorimétricos. Una ventaja fundamental de los protocolos de NA colorimétricos, además de la simplicidad de uso, es que se basan únicamente en la co intrínsecavalente estructura de AN en lugar de estructuras fold/3D, reactividades, o cualquier otra propiedad de la biopolímero que pueden variar con la secuencia.

Los protocolos descritos aquí son robustos frente a la mayoría de dificultades, sobre todo cuando se realiza con la simple inspección visual de los productos de reacción, la atención especial se debe tomar para obtener más cuantitativa (espectrofotométricos) análisis. Por ejemplo, en el ensayo de Benedict el precipitante rojo (ppt) que se forma en presencia de altas concentraciones de ribosa se ​​debe quitar antes del análisis espectrofotométrico; esto se logra fácilmente a través de centrifugación. Para el ensayo de la Dische, la adición de reactivo de difenilamina está acompañada por la formación de un ppt blanco que pueda ser solubilizado por calentamiento; un ppt verde que se forma en la presencia de ADN puede interferir con las mediciones espectrofotométricas y se debe quitar antes del análisis cuantitativo. Además, cada ensayo se basa en reacciones químicas que son susceptiblesa interferentes potenciales, como se mencionó en la introducción y se detalla a continuación. Por último, se observa que una alta concentración relativa de ARN en una mezcla de ADN / ARN puede enmascarar el resultado positivo esperado de ensayo Dische de; este falso negativo para el ADN se deriva del hecho de que una fracción molar alta de ARN también reacciona, a través de intermediarios furfural, con reactivos de la Dische, pero se obtiene un producto incoloro en lugar de aducto de azul producida por reacción con el azúcar 2'-desoxipentosa de ADN.

Interferentes potenciales: Más allá del caso evidente de azúcares, lípidos y proteínas son dos otras biomoléculas que hipotéticamente podrían causar problemas con estos ensayos colorimétricos, debido a la reactividad cruzada (falsos positivos) o reactividad enmascarado (falsos negativos). En principio, varios tipos de lípidos celulares posiblemente podría interferir, incluyendo glycosylglycerols glicerolípidos y otros conjugados con azúcares, glicolípidos (por ejemplo, cerabrosides), saccharolipids (por ejemplo, derivados de glucosamina), lipopolisacáridos, y así sucesivamente. En la práctica, estas clases de lípidos es poco probable que plantean un problema en el trabajo con proteínas lipofílicas, ya que son relativamente raras, frente a los fosfolípidos mucho más abundante, y por lo tanto por debajo de los límites de detección de nuestros ensayos. Debido a que la mayoría de los lípidos celulares antes mencionados se basan en hexosas (galactosa, glucosa) en lugar de pentosas, no deben interferir como falsos positivos en los ensayos de Bial o de Dische. Monosacáridos libres que pueden dar falsos positivos son la fructosa, galactofuranosa o furanosas otros. En una nota relacionada, la interferencia de los azúcares no deseados podría convertirse en un problema para las proteínas recombinantes expresadas con la proteína de unión a maltosa (MBP) tags. En la cromatografía de afinidad pasos utilizados para purificar tales constructos de fusión, maltosa se utiliza para eluir la proteína, y es concebible que la maltosa residual en las preparaciones aguas abajo podría interferir con thensayo e Benedict (que es el más general / no específica de los ensayos; las unidades de glucosa de maltosa no debe reaccionar bajo la de Bial o de Dische). Por lo tanto, habría que tener cuidado en las etapas de post-cromatográficos para asegurar que la maltosa residual no dieron resultados falsos. No hemos probado proteínas glucosilada o glicoproteínas otros, pero sospechamos que sería difícil de obtener un claro resultado positivo para la presencia de azúcares en tales proteínas (o glicolípidos, proteoglicanos, o glicoconjugados otros) porque se espera que los restos de glicanos haría encontrarse por debajo del límite de sensibilidad de nuestros ensayos. En principio, una solución que contiene una aldohexosa libre tal como glucosa, liberado de una proteína glucosilada a través de hidrólisis ácida, sería positivo en la prueba de ensayo de la Benedict, de manera similar, una glicoproteína derivada de pentosa, tales como la xilosa, debería producir un resultado positivo en el de Bial ensayo. Sin embargo, en la práctica, un resultado positivo para glicoproteínas requeriría extremadamente h igh concentraciones de proteína, incluso para los polipéptidos glicosilados se multiplican, debido a la baja de azúcar / proteína de relación molar.

Los protocolos de ensayo descritos aquí puede ser ampliado y adaptado para manipular los límites de tamaño de la muestra pequeña - es decir, los volúmenes pequeños o bajas concentraciones de analitos. Para cantidades limitadas de muestra se ha encontrado que las reacciones pueden ser reducido para el intervalo de 100 l (por ejemplo, usando tubos de PCR y un termociclador durante las etapas de incubación). Para pequeños volúmenes de muestras a bajas concentraciones (cerca del límite de detección), un espectrofotómetro equipado con un lector de placas se puede utilizar, en tales escenarios, la única dificultad prevista sería la eliminación de cualquier precipitante no deseado antes de las mediciones de absorbancia. A pesar del rango de detección limitado de simple inspección visual, una ventaja de la aproximación descrita aquí es su eficacia y rapidez, con muestras que puedan ser analizados inmediatamente después del calentamiento.

"> Aplicaciones de los protocolos presentados aquí incluyen la identificación de compuestos co-purificación, la evaluación de ARN o la pureza del ADN, y la detección de contaminación residual NA o azúcar en las muestras de proteínas. Por ejemplo, NA no deseada detectada por nuestros ensayos pueden ser retirados de una preparación de proteína a través de medios químicos (por ejemplo, hidrólisis, alcalina de ARN) o digestión enzimática (por ejemplo, tratamiento de nucleasa). Aunque existen enfoques alternativos para tales aplicaciones, los métodos descritos aquí son altamente eficientes en términos de tiempo y costo, y puede por lo tanto, ser fácilmente integrado en un flujo de trabajo experimental. La identificación temprana de compuestos co-purificar el azúcar reductor libre, ARN, ADN o proteínas puede orientar el diseño de pasos de purificación de aguas abajo, frente al proceso laborioso y estudios de error. Un paso común siguiendo nuestros protocolos podría ser el aislamiento de ARN a partir de ADN y proteínas, a través de tiocianato-fenol-cloroformo extracción, o la recuperación de ADN alone (mediante la exclusión de tiocianato). ²⁰ Para evaluar la pureza de las AN resultante de extracciones con fenol-cloroformo, estos ensayos colorimétricos se puede utilizar como una alternativa simple para electroforesis o tratamiento con DNasa. En esta y otras formas, los ensayos colorimétricos se describen aquí pueden combinarse con métodos bien establecidos para la proteína NA y la determinación de conseguir un sistema rápido y robusto para elucidar el ARN, ADN y proteínas componentes biomoleculares en muestras heterogéneas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.