Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

فحوصات اللونية السريعة للتمييز نوعيا RNA والحمض النووي في العينات البيولوجية

doi: 10.3791/50225 Published: February 4, 2013

Summary

ووصف مجموعة من فحوصات اللونية المميزة للبروتين بسرعة، RNA، DNA، وإعادة ducing السكريات في عينات غير متجانسة الجزيئية البيولوجية المحتملة.

Abstract

التجريب البيوكيميائية عموما يتطلب معرفة دقيقة، في مرحلة مبكرة، من الحمض النووي والبروتينات، ومكونات أخرى الجزيئية البيولوجية في عينات غير متجانسة محتملة. ويمكن الكشف عن الأحماض النووية عبر العديد من الأساليب المتبعة، بما في ذلك الطرق التحليلية التي هي الطيفي (على سبيل المثال، A 260)، فلوروميتريك (على سبيل المثال، ملزمة من الأصباغ الفلورية)، أو اللونية (نوكليوزيد محددة التفاعلات الكيميائية مولد اللون) 1 على الرغم من أنه لا يمكن التمييز بسهولة RNA DNA من وA 260 / A يعمل عادة نسبة 280، كما يوفر بسيطة وسريعة 2 تقييم المحتوى النسبي للحامض النووي، التي تمتص في الغالب بالقرب من 260 نانومتر والبروتين، والتي تمتص في المقام الأول بالقرب من 280 نانومتر. نسب <تؤخذ كمؤشر إلى 0،8 'نقية' عينات البروتين، في حين يتميز الحمض النووي النقي (NA) بنسب> 1.5 3.

حويفر، وهناك سيناريوهات فيه نسبة البروتين / NA لا يمكن أن يكون كما هو واضح أو موثوق الاستدلال على ذلك من قياسات الأشعة فوق البنفسجية في مواجهة بسيطة الطيفي. على سبيل المثال، (ط) قد تحتوي على عينات واحد أو أكثر من البروتينات التي تخلو نسبيا من الأحماض الأمينية العطرية المسؤولة عن امتصاص نانومتر في 280 ≈ (TRP، صور، الفنيل ألانين)، كما هو الحال مع بعض البروتينات RNA ملزم الصغيرة، و (الثاني) يمكن أن تظهر العينات المتوسطة A 260 / A نسب 280 (~ 0.8 <~ 1.5)، حيث محتوى البروتين / NA هو أقل وضوحا بكثير، وربما حتى بعض تعكس عالية تقارب بين الجمعيات ومكونات البروتين NA. لمثل هذه السيناريوهات، ونحن هنا تصف مجموعة من فحوصات اللونية للتمييز بسرعة RNA، DNA، والحد من السكريات في عينة مختلطة من المحتمل الجزيئات الحيوية. أساليب تعتمد على حساسية من الفرق pentoses والكربوهيدرات الأخرى للبنديكت، في بيال (أورسينول)، والكواشف لDische (ثنائي فينيلامين)، ويمكن أن تكون مبسطة البروتوكولات كومpleted في غضون دقائق، من دون أي خطوات إضافية من الاضطرار إلى عزل المكونات. لا يمكن أن يؤديها في المقايسات بالتوازي للتمييز بين الحمض النووي الريبي DNA و، كذلك تشير إلى وجود السكريات المختزلة مجانا مثل الجلوكوز، والفركتوز، والريبوز (الشكل 1).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الكثير من بيولوجيا الخلية يحدث عبر التفاعلات الجزيئية التي تنطوي على الحمض النووي RNA و.. 4 هذه الأحماض النووية التي تحدث بشكل طبيعي (ناس) تتفاعل مع بعضها البعض، 5 مع البروتينات و 6 و مع مجموعة من المركبات الصغيرة جزيء ويغاندس في الجسم الحي (على سبيل المثال، الكاتيونات ثنائي التكافؤ 7). التفاعلات قد تكون قصيرة أو طويلة الأجل (مصطلحات البحث)، قد تتراوح بين معتدلة إلى عالية لتقارب منخفضة (قوة الحرارية)، ويمكن أن تظهر أيضا اختلاف كبير في الخصائص الكيميائية والنوعية - بعض الجمعيات هي محددة جدا (على سبيل المثال، DNA · · · عوامل النسخ، RNA · · · عوامل الربط)، في حين لا تزال بعيدة التفاعلات الأخرى بالضرورة أكثر عمومية (مثل DNA · · · البكتيرية مثل البروتينات هيستون HU 8). يمكن غير محددة التفاعلات مع ناس لها عواقب عملية لتجارب المختبر في إشراك خليط من biomolecules، كما أنه من الممكن، والمحتمل حتى أن بعض الوافدين الجدد سوف تقترن مع الجزيئات الحيوية التي تهم، على الأقل في بعض فرعية من الظروف التجريبية المستخدمة (قوة الأيونية، ودرجة الحموضة الحل، الخ).

تنظر، على سبيل المثال، إنتاج بروتين من الفائدة (POI) عن طريق الإفراط في التعبير مغايرة من البروتين المؤتلف في القولونية ثقافة الخلية؛ يتم تنفيذ هذا الإجراء روتيني في مختبر البيولوجيا تقريبا أي الهيكلي 9 في الإعداد لمزيد من التجارب، من هذا القبيل. كما توصيف البيوكيميائية / البيوفيزيائية، تبلور، وما إلى ذلك، تركز الجهود الأولية عموما على الحصول على كمية كافية من POI في شكل نقي وممكن، من الناحية المثالية كعينة متجانسة كيميائيا وmonodisperse biophysically. بعد تعطيل الخلايا المضيفة، المراحل المبكرة من سير عمل نموذجية تهدف إلى تنقية عزل POI من E. البروتينات القولونية، الأحماض النووية، خلية الحطام الجدار،وغيرها من عناصر المحللة الخلوية. ومع ذلك، قد المضيف مع الوافدين الجدد POI لأسباب عدة الفيزيائية شارك تنقية-- نقطة مهمة للغاية الأساسية قد غير وجه التحديد المنسدلة المضيف DNA / RNA، وPOI قد يكون لها عام NA-ملزمة النشاط (على سبيل المثال، HU المذكورة أعلاه)؛ قد يكون POI محددة إلى حد ما NA-ملزمة البروتين ولكن المعرض للتفاعل مع عبر الرناوات المضيف أو السلطات الوطنية المعينة؛ المضيف قد تتفاعل مع الوافدين الجدد مصفوفة اللوني وبالتالي ببساطة شارك في أزل مع POI، وهلم جرا. يمكن العشوائية، وارتفاع تقارب ملزم من الوافدين الجدد إلى المضيف POI تشكل مشكلة محيرة لأن الشوائب NA سوف تتداخل مع تجارب المرجح المصب (على سبيل المثال، المقايسات تباين مضان من الحمض النووي الريبي ملزمة POI • 10). بدلا من ذلك، POI غير متوقعة · · · الجمعيات NA ويمكن أيضا أن ينظر إليها مصادفة، وهذه التفاعلات لإلقاء الضوء على POI الحمض النووي ملزم القدرات. وفي كلتا الحالتين، سواء الوافدين الجدد هي المكونات الرئيسية أو الملوثات، يجب على المرء أولا وتحديدتحديد نوع (DNA، RNA) للمشاركين في تنقية ناس في التحضير للتجارب المصب.

الطرق التحليلية للكشف عن وجود عدة وquantitating ناس في عينة. معظم الطرق المتاحة هي في الأساس إما الطيفي (على سبيل المثال، قيم الامتصاصية A 260 و A 260 / A نسب 280)، فلوروميتريك (على سبيل المثال، ملزمة من البرتقال أو ثيازول الأصباغ الفلورية الأخرى إلى NA)، أو اللونية (حساسية النيوكليوسيدات إلى التفاعلات الكيميائية أن العائد chromophores امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في المنطقة في مواجهة من الطيف الكهرومغناطيسي)، كما وصفها مؤخرا وآخرون دي مي آل. 1 إلا أن الخطوة الحاسمة لتحديد نوع RNA أو عديد النوكليوتيد كما DNA خارج نطاق العديد من هذه الكميات النهج. هنا نقدم مجموعة من فحوصات لتحديد اللونية سريعا أنواع المكونات NA في عينة البروتينية.

وصف بروتوكولات هنا جيتم تنفيذها بكفاءة ودون خطوات إضافية لعزل الشوائب المحتملة NA، والاعتماد على الفحص بنديكت السادس عشر للحد من السكريات 11، الفحص أورسينول لpentoses 12،13، 14،15 وردود الفعل ثنائي فينيلامين من deoxypentoses-2'(الشكلان 1 و 2) . اختبار بنديكت السادس عشر (الشكل 2A) يستخدم قدرة النموذج، الخطي المفتوح سلسلة (ألدهيد) من السكر الدوسي للحد من النحاس 2 +، مع الأكسدة يصاحب ذلك من الكربونيل السكر في لشاردة الكاربوكسيلات وإنتاج النحاس 2 O باعتبارها راسب أحمر غير قابلة للذوبان. وهذا التفاعل الإيجابي مع خدمة اختبار السكريات المختزلة مثل aldoses وketoses (التي تحول إلى aldoses المقابلة عبر وسيطة enediol)، ولكن ليس مع السكريات البنتوز أن يتم تأمين في شكل دوري كجزء من العمود الفقري التساهمية من الحمض النووي RNA أو عديد النوكليوتيد بسبب شرط أضيق الحدود وظائف على هيمي آسيتال مجانا، وشارك أخرىmpounds التي يمكن اختبار إيجابية في هذا الاختبار - وبالتالي يكون بمثابة interferents المحتملة - تشمل α هيدروكسي الكيتونات وoligosaccharides قصيرة (مثل المالتوز ديساكهارايد). كل من في بيال أورسينول (الشكل 2B) وتستند Dische لثنائي فينيلامين (الشكل 2C) ردود الفعل على تدمير الأولي من العمود الفقري عديد النوكليوتيد، عن طريق نزع البورينات من نوكليوزيد وحمض أو مزيد المحفز القاعدة التحلل من النيوكليوتيدات الأم، لانتاج الفيوران-2 -carbaldehyde (فورفورال) مشتقات، وهذه المشتقات تتفاعل بعد ذلك مع polyhydroxy إما الفينول مثل أورسينول (في بيال) أو ثنائي فينيلامين (في Dische) الكواشف لتشكيل منتجات التكثيف الملون من التركيب الكيميائي غير معروف إلى حد كبير. الحمض النووي RNA من خصوصية مقابل الفحص وDische تنبع من حقيقة أن السكر البنتوز يجب أن تكون 2'-امؤكسج من أجل أن تكون عرضة للأكسدة لω-hydroxylevulinyl ألدهيد، الذي يتفاعل مع مزيد من ثنائي فينيلامينفي ظل الظروف الحمضية لانتاج المكثفات زرقاء زاهية (الشكل 2C). باستخدام بروتوكولات مبسطة وصفها هنا، وجدنا أن هذه التفاعلات السكر محددة اللونية يمكن التفريق بين RNA والحمض النووي، وسوف تبين أيضا وجود السكريات المختزلة مجانا مثل الجلوكوز، والفركتوز، أو الريبوز في عينة الجزيئية البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. بنديكت الفحص للحد من السكريات

  1. إعداد كمية مناسبة من كاشف بنديكت السادس عشر - 940 مم كربونات الصوديوم اللامائية، 588 سترات الصوديوم يذوى مم، 68 مم pentahydrate كبريتات النحاس (II). يمكن تخزين هذا كاشف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة لا تقل عن ستة أشهر مع عدم وجود تغيير ملحوظ في النشاط.
  2. الكاشف أعلاه هو 6X. وهكذا، ل 600 ميكرولتر ردود الفعل، إضافة 100 ميكرولتر من كاشف بنديكت السادس عشر إلى 1.5 مل نظيفة أنبوب microcentrifuge (على سبيل المثال، إيبندورف العلامة التجارية)، في أن يعاير العينة.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من أي مكان إلى 500 ميكرولتر من العينة لهذا الأنبوب، ويمكن تحديد حجم الأمثل يعتمد على كثافة اللون في تشكيل التشغيل التجريبي الأولي. إذا عينة كافية متوفرة ثم تبدأ التجارب السريرية في حجم عينة ممكن القصوى (أي خمسة أسداس من حجم رد الفعل العام، و 500 ميكرولتر من العينة في هذه الحالة)، ومن ثم تمييع في المقايسات اللاحقة.
  4. إضافة DDH 2 O إلى تويكون لتبرزي حجم النهائي إلى 600 ميكرولتر؛ مزيج من الحل أو vortexing pipetting.
  5. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في حمام ماء مغلي.
  6. إزالة عينة من الحمام الساخن والسماح لتبرد في RT لمدة 10 دقيقة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب عينة> 9300 XG (~ 10،000 دورة في الدقيقة في الدوار FA45-24-11 الزاوية الثابتة إيبندورف) لمدة 5 دقائق من أجل الرواسب الجسيمات أي مادة، وهذا هو الخطوة الأهم للدراسات الكمية بدلا من النوعية.
  8. قسامة طاف من هذا الأنبوب إلى كوفيت نظيفة.
  9. والأشعة فوق البنفسجية الطيف فارغة في مواجهة مع الماء.
  10. قياس الامتصاص من هذه العينة في 475 نانومتر.

2. بيال الفحص أورسينول للسكر البنتوز

  1. إعداد كمية مناسبة من كاشف بيال الطازج - 24.2 ملم أورسينول مونوهيدرات (انظر الشكل 2B لهيكل هذا المركب)، 6 M حمض الهيدروكلوريك، 0.025٪ وزن / حجم هيدرات كلوريد الحديديك ملاحظة:لتخزين طويلة، يمكن أن تكون على استعداد كاشف للبيال عن اثنين من الحلول الأسهم منفصلة: (ط) الكاشف A [0.05٪ W / V FeCl3 • 6H 2 O في حمض الهيدروكلوريك تتركز] و (الثاني) الكاشف B [422 ملي مونوهيدرات أورسينول أعد في 95 الإيثانول٪]. ويمكن تخزين كاشف A RT في لمدة ستة أشهر، ويمكن تخزين B C الكاشف في ° 4 لمدة شهر، مع تغطية احباط للحد من التعرض للضوء. يتم خلط هذه الحلول الأسهم في 15 (A): 1 (B) ت / ت نسبة قبل استخدامها.
  2. الكاشف أعلاه هو 2X. وهكذا، على ردود فعل مل 1.0، إضافة 500 ميكرولتر من كاشف بيال إلى 1.5 مل نظيفة أنبوب microcentrifuge، في أن يعاير العينة.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من أي مكان إلى 500 ميكرولتر من العينة لهذا الأنبوب. وفقا لمذكرة 1.3 (أعلاه)، إذا ما يكفي من عينة متاحة ثم تبدأ المحاكمة ردود الفعل باستخدام أقصى حجم العينة ممكن (أي نصف حجم رد الفعل العام، و 500 ميكرولتر من العينة في هذه الحالة) وتخفيف من هناك.
  4. إضافة DDH 2 O إلى أنبوب لجلب وحجم إينال لمل 1.0؛ مزيج من الحل أو vortexing pipetting.
  5. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في حمام ماء مغلي.
  6. إزالة عينة من الحمام الساخن والسماح لتبرد في RT لمدة 10 دقيقة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب عينة> 9300 XG (~ 10،000 دورة في الدقيقة في الدوار FA45-24-11 الزاوية الثابتة إيبندورف) لمدة 5 دقائق من أجل الرواسب الجسيمات أي مادة، وهذا هو الخطوة الأهم للدراسات الكمية بدلا من النوعية.
  8. قسامة طاف من هذا الأنبوب إلى كوفيت نظيفة للتفتيش البصري.
  9. لشبه التحليل الكمي، ومعمل الأشعة فوق البنفسجية فارغة في مواجهة مع الماء وقياس الامتصاصية من العينة في كوفيت 660 نيوتن متر.

3. Dische لثنائي فينيل أمين الفحص ل2'-deoxypentose السكريات

  1. إعداد كمية مناسبة من كاشف ثنائي فينيلامين Dische ل- 60 مم ثنائي فينيلامين، 11 M حمض الخليك الجليدي، 179 ملي مول حامض الكبريتيك، 62٪ V / V الايثانول. يمكن هذا كاشف مسبقاقلص مسبقا وتخزينها في وعاء RT في الظلام، أو مغطاة بورق، للحد من التعرض للضوء. ينبغي بسبب الحساسية للضوء كاشف لا يمكن تخزينها لأجل غير مسمى، على الرغم من الناحية العملية يمكن أن تكون مستعدة في كل شهرين أو ثلاثة أشهر دون أي تغيير واضح في التفاعل.
  2. الكاشف أعلاه هو 2X. وهكذا، على ردود فعل مل 1.0، إضافة 500 ميكرولتر من كاشف لDische نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، في أن يعاير العينة.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من أي مكان إلى 500 ميكرولتر من العينة لهذا الأنبوب. وفقا لمذكرة 1.3 (أعلاه)، إذا ما يكفي من عينة متاحة ثم تبدأ المحاكمة ردود الفعل باستخدام أقصى حجم العينة ممكن (أي نصف حجم رد الفعل العام، و 500 ميكرولتر من العينة في هذه الحالة) وتخفيف من هناك.
  4. إضافة DDH 2 O إلى أنبوب لتبرزي حجم النهائي لمل 1.0؛ مزيج من الحل أو vortexing pipetting.
  5. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في حمام ماء مغلي.
  6. إزالة عينة من الحمام الساخن وألوث لتبرد في RT لمدة 10 دقيقة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب عينة> 9300 XG (~ 10،000 دورة في الدقيقة في الدوار FA45-24-11 الزاوية الثابتة إيبندورف) لمدة 5 دقائق من أجل الرواسب الجسيمات أي مادة، وهذا هو الخطوة الأهم للدراسات الكمية بدلا من النوعية.
  8. قسامة طاف من هذا الأنبوب إلى كوفيت نظيفة للتفتيش البصري.
  9. لشبه التحليل الكمي، ومعمل الأشعة فوق البنفسجية فارغة في مواجهة مع الماء وقياس الامتصاصية من العينة كوفيت في 600 نانومتر.

4. ملاحظات استخدام مزيد

  1. للفئات التالية من الجزيئات هي مركبات إشارة مناسبة للتحكم التفاعلات الإيجابية والسلبية لكل الفحص:
    • بنديكت السادس عشر - الإيجابية = مجانا الريبوز وسكر الفواكه والجلوكوز، السلبية = RNA، DNA، ATP، الخ. (أي ساكاريد تفتقر إلى وظائف خالية السكر الحد)
    • بيال - = RNA (مثل استخراج بيكر خميرة)، الريبوز، ATP، UMP الإيجابية؛ السلبية = سر البقريأم الزلال (BSA) أو أي بروتين أخرى
    • Dische ل- الإيجابية = DNA (مثل الغدة الصعترية العجل)؛ السلبية = RNA، ATP، الخ. (أي النوكليوتيدات غير 2'-امؤكسج)
  2. تم العثور على هذه المقايسات على الصمود إلى حد ما لمركبات غالبا ما تستخدم في تنقية البروتين، على سبيل المثال، وأملاح الشائعة مثل كلوريد الصوديوم، (NH 4) 2 4 SO، وK 2 SO 4 لم تتدخل، وتظهر ردود الفعل تتأثر عادة من قبل محتويات مخفف. قد المنظفات أو وكلاء chaotropic مثل اليوريا تؤثر على تفاعل من المقايسات إذا كان الرقم الهيدروجيني الأساسية للغاية؛ محايد لنطاق الأس الهيدروجيني الحمضية بشكل عام الأمثل لفي بيال والمقايسات Dische لأن من الكيمياء رد فعل الأساسية (انظر النص والبروتونات في في الشكل 2B، ج). ظروف التفاعل الأمثل يحتمل، interferents المشتبه بهم، وما إلى ذلك. وينبغي اختبار على أساس كل حالة على حدة، وذلك باستخدام الإيجابية والسلبية السيطرة التجارب ثمركبات الإشارة إيث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتظهر النتائج في الشكل 3 لتطبيق هذه المقايسات اللونية لمركبات مرجعية معروفة. وتظهر البيانات النوعية للممثل البابا (أ)، بيال أورسينول (ب)، وDische في المقايسات (ج) ثنائي فينيلامين، وتظهر منحنيات القياسية لهذه المقايسات الثلاثة في الشكل 4. في لوحات 3 (AC)، لوحات اليسار تظهر التجارب مراقبة إيجابية / سلبية رد الفعل المناسب باستخدام analytes / يتفاعل، وتظهر هذه النتائج البصرية في الموقع، في cuvettes كما هو موضح في 1-3 البروتوكولات (أعلاه). الحق الفرعية لوحات تظهر سلسلة المعايرة لكل منهما الحليلة. في مقايسة لبنديكت (أ)، ومراقبة إيجابية هو الريبوز (0.42 ملغ / مل)، في حين الضوابط السلبية المياه، وهو بروتين عام (0.75 ملغ / BSA مل)، واثنين من غير السكريات المختزلة (DNA بنسبة 0.75 ملغ / مل وRNA في 12.5 ملغ / مل). في مقايسة أورسينول (ب)، والضوابط الإيجابية الريبوز (0.15 ملغ / مل)، RNA (7.5 ملغ / مل)، والحمض النووي (0.45 ملغ / مل)، في حين المياه وBSA البروتين (0.45 ملغ / مل) هي الضوابط السلبية. في مقايسة ثنائي فينيلامين (ج)، يظهر العجل الغدة الصعترية DNA (0.45 ملغ / مل) كعنصر تحكم إيجابية، والمياه، وخلاصة الخميرة RNA (7.5 ملغ / مل)، الريبوز (0.15 ملغ / مل)، وBSA (0.45 ملغ / مل) بمثابة الضوابط السلبية. وأخيرا، لوحة (د) يوضح مدى متانة والمقايسات من خلال إظهار رد فعل Dische مع عينات من عدم التجانس متفاوتة: وقاذفتان تركيزات DNA كعنصر تحكم إيجابية في العينتين اليسار (cuvettes 1-2)، DNA RNA + مخاليط ( وترد في نسب مختلفة) في العينات الثلاث القادمة (3-5)، والمباراة النهائية ثلاث عينات DNA تظهر في غياب (عينة 6) أو وجود (عينات 7-8) من الحمض النووي ملزم "Hfq 'البروتين. 16 لاحظ أنه يتم الحفاظ على نتيجة إيجابية من الفحص وDische لDNA التي تحتوي على عينات حتى في وجود الحمض النووي الريبي "تلويث" أو البروتين.

التحليل الكمي: وتتراوح التخفيف في الشكل 3 (AC) لوحات تختلف لأن كلرد فعل لديه متميزة حد الكشف البصري، وهذا يتوقف على نوع من يجري يعاير السكر. طيفية، بدلا من البصرية، ويمكن استخدام الكشف لتحسين يتراوح القياس، على سبيل المثال كما هو موضح في الشكل (4) للبنديكت (أ) و (ب) في بيال، و (ج) المقايسات Dische ل. على الرغم من وتهدف البروتوكولات التي توصف هنا المقايسات النوعية في المقام الأول، والعلاقة بين بئر لامبرت الامتصاصية والتركيز تمكن ما لا يقل عن نصف كمية السكر تقدير محتوى حمض النووي أو. كمثال على منحنى القياسية لمعايرة اختبار بنديكت السادس عشر، يظهر نوبة الانحدار الخطي من الامتصاصية (475 نانومتر) ضد تركيز الريبوز في الشكل 4 (أ)؛ أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري ن = 3 مكررات، وعلى يتم توفير مربع معامل الارتباط. الانحراف عن الخطي بتركيزات منخفضة جدا الريبوز (مثل مسند ملي 0.28) يعكس حساسية هذا الاختبار محدود من. على الرغم من أن كماوالمقصود في المقام الأول يقول للدراسات النوعية، وتقترح المبادئ التوجيهية التالية لشبه التحليل الكمي:

  • لفحص وبنديكت (الشكل 4A): تم العثور على قراءات رد فعل (A 475nm) ليكون الخطية على الأقل على المدى 0،04 → 0.5 ملغ الحليلة مل /، كما يقوم في ثلاث نسخ.
  • لفحص وبيال (الشكل 4B): البيانات الامتصاصية (A 660nm) كانت الخطية على الأقل على مدى النطاق 0 → 0.5 ملغ / مل الحليلة (RNA بيكر خميرة)، بعد أن تم إجراء الفحص في ثلاث نسخ (R 2 = 0.99 الانحدار الخطي معامل). على الرغم من طرد والعينات للقياسات الامتصاصية توضيح قبل، لم يتم العثور على الكثيرمن في هذه التركيزات المنخفضة من الحليلة، وبالتالي فإن الخطوة الطرد المركزي ليست ضرورية تماما. الفحص ينحرف عن الخطي بتركيزات الحليلة خارج هذا النطاق.
  • لفحص Dische في (الشكل 4C): إن 600nm A 2 = 0.99). مؤامرة من الامتصاصية مقابل [تحليلها] بدأ الهضبة عند 0.90 ملغ / مل DNA، مما يدل على حدود المنطقة استجابة خطية.
  • الاعتبارات العملية للتحليل الكمي أو شبه الكمي-: لإزالة المواد المترسبة التي من شأنها أن تتداخل مع قراءات الامتصاصية خلاف ذلك، فإن جميع المقايسات الثلاثة تتطلب الطرد المركزي بسرعة القصوى (25،000 XG، أو أيا كان يمكن الحد من أنابيب صمدت microfuge) لفترات معقولة من الزمن (على سبيل المثال، 20 دقيقة)، وهذا أمر مهم خاصة عند تركيزات أعلى الحليلة. بعد الطرد المركزي، يمكن نقل العينات إلى توضيح كوفيت أو صفيحة ميكروسكوبية (على سبيل المثال، وحات microtiter 96-أيضا) لقياسات الامتصاصية مريحة.

الشكل 1 الشكل 1. شجرة القرارات لتطبيق المقايسات. بدءا من عينة غير متجانسة من المحتمل الجزيئات الحيوية (على سبيل المثال، من خلية كاملة لست])، يمكن استخدام المقايسات اللونية الموصوفة هنا إلى تحديد ما إذا كان يحتوي على خليط غير السكريات المختزلة (اختبار بنديكت السادس عشر). إذا كان الأمر كذلك، ثم اختبار بيال أورسينول يكشف عما إذا كانت السكان من غير السكريات المختزلة يحتوي على حلقات البنتوز (كما هو الحال في DNA أو RNA)، مقابل hexoses (على سبيل المثال، الجلوكوز، pyranoses أخرى) وربما aldoses بعد أخرى. وأخيرا، إذا كانت العينة تحتوي على ما لا يقل عن جزء من الحمض النووي معتدلة ثم لن يرن 2'-ديوكسي ريبوز رد فعل (عند التحميض والتدفئة) مع كاشف ثنائي فينيلامين Dische ل، مما يعني أن المنتج التكثيف الأزرق بوضوح. نلاحظ أن هذا المخطط هو شجرة القرارات، وليس مخطط انسيابي: يظهر منطق نتائج الفحص قerially، ولكن يمكن تنفيذ المقايسات بشكل متواز.

الشكل 2
الشكل 2. وتظهر التفاعلات الكيميائية الكامنة للفحوصات اللونية، مع الناتج ملونة للكشف أشار إلى جانب ردود الفعل المقابلة. (أ) غير قابلة للذوبان، راسب أحمر من النحاس 2 O هو نتيجة إيجابية لفحص بنديكت السادس عشر للحد من السكريات. (ب) عند التسخين وتحمض، والتي تحتوي على السكريات تتحلل إلى حلقات البنتوز فورفورال، الذي يتفاعل بعد ذلك مع أورسينول (كاشف بيال) لانتاج وقابل للذوبان الأخضر والأزرق معقد إضافي. في مقايسة Dische، وعدم وجود الهيدروكسيل المستبدلة في موقف 2 'تمكن تفاعل الأكسدة حلقة فتح، والمنتج من ألدهيد الذي يتفاعل أيضا مع ثنائي فينيلامين [(PH) 2 NH] لانتاج منتج مشرق الزرقاء. سانت الكيميائيةructures لا تزال مجهولة لكبيرة، ومنتجات التكثيف المتعدد حلقة من أورسينول (ب) وردود الفعل (ج) ثنائي فينيلامين.

الشكل 3
الشكل 3. وتظهر نتائج العينة تطبيق المقايسات اللونية لمركبات المرجعية وعينات غير المتجانسة. للبنديكت (أ)، في بيال (ب)، وDische في (ج) المقايسات اللونية. في (أ) → (ج)، اليسار الفرعية لوحات تظهر الضوابط الإيجابية / السلبية على رد الفعل المناسب باستخدام analytes / يتفاعل والحق الفرعية لوحات تظهر سلسلة المعايرة لكل الحليلة. أظهرت أيضا هو لوحة توضيحية للردود فعل Dische (د) حيث تختلف في الحليلة عدم التجانس - إما وحدها DNA (يسار)، DNA / RNA خليط من نسب مختلفة (وسط)، أو DNA في وجود بروتين حمض النووي المرتبطة ( 'Hfq'). هذه اللوحاتموصوفة في مزيد من الممثل نتائج القسم من النص.

الشكل 4
الشكل 4. وتظهر منحنيات القياسية من المقايسات مع المركبات المرجعية. منحنيات المعايرة للبنديكت (أ)، بيال (ب)، وDische في (ج) المقايسات، والتي تصور جزءا ممثل المنطقة استجابة خطية لكل مقايسة. والانحدار الخطي يناسب ويشار إلى معاملات الارتباط المقابلة لكل مقايسة. وكانت ستاندرد بيكر خميرة الحمض النووي الريبي (ب) والغدة الصعترية العجل DNA (ج) analytes في هذه السلسلة المعايرة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قدم المقايسات اللونية هنا نقدم مقاربة بسيطة لتقييم بسرعة الطبيعة الكيميائية للمخاليط الجزيئية البيولوجية، مثل واجهت عند تنقية البروتينات، أو المجمعات الرناوات من خلية كاملة المحللة استعدادا لمزيد من الدراسات. كما تسعى الجمعيات البيولوجيا الهيكلية أكثر الأصلي مثل، تحديات أكبر تدريجيا، مثل عدم تجانس العينة، سيتم الناجمة عن المجمعات معقدة ومتعددة المكونات. وغالبا ما تكون الجمعيات Supramolecular فقط مستقرة بشكل هامشي، وعزلتهم ناجحة قد تتطلب ظروف تنقية أقل صرامة (على سبيل المثال، كما وجدت للمجمعات snRNP spliceosomal 17،18). تحت مثل هذه الظروف أكثر اعتدالا على حد سواء حقيقية وزائفة POI · · · التفاعلات NA هم أكثر عرضة لتستمر بذلك وتتداخل في المقايسات المصب مع بروتين الهدف أو الحمض النووي. A هو خطوة أولى ضرورية التعرف على أنواع المكونات الكيميائية في هذه العينات.

ve_content "> طرق للكشف عن الحمض النووي الريبي والحمض النووي، والبروتين تختلف تبعا لكمية وتركيز من analytes والموارد المتاحة وضيق الوقت، وربما الأهم من ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن المعرفة واحد قبل عن التركيب الكيميائي المحتمل للanalytes. المواد البروتينية من قبل العديد من الأساليب الراسخة، بما في ذلك تلك التي هي الطيفية (A 280)، الهيدروديناميكية (الكهربائي للهلام) والكيميائية / اللونية 19 (على سبيل المثال، اختبار البيوريت للسندات ببتيد)، وبقدر كبير من الحساسية والدقة، من خلال مطياف الكتلة. وبالمثل، ناس ويمكن الكشف عنها بواسطة فحوصات الطيفية (A 260)، فلوروميتريك، أو كيميائية (الموصوفة هنا). كل نوع من أساليب القوة يتميز مميزة والضعف، فعلى سبيل المثال، PicoGreen، SYBR الذهب، وغيرها من الأصباغ الفلورية القائمة على cyanine حساسة جدا لل الحمض النووي (العديد من الطلبات من حيث الحجم بعد فحوصات اللونية)، تظهر درجات مختلفة من الانتقائية (مثل، بيكoGreen لالمزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي، SYBR الذهب يربط معظم ناس)، وكما تتميز النطاقات دينامية واسعة لأغراض تحديد الكميات. ومع ذلك، هذه الأساليب ليست بلا حدود: الأصباغ تتطلب معدات أكثر تقدما للكشف عن (transilluminators لspectrofluorometers، والهلام لعينات دفعة)، مقابل قراءات بصرية بسيطة من المقايسات اللونية، ويتم التعامل مع الأصباغ والمطفرة، أقرب إلى بروميد إيثيديوم، وهناك قيود على شروط الفحص (على سبيل المثال، مجموعة ودرجة الحموضة الموصى بها من 7-8،5 لSYBR الذهب؛ تخفيض 30٪ من كثافة إشارة PicoGreen في> كلوريد الصوديوم ملي 200). وهكذا، ومضان فحوصات اللونية القائمة على متكاملان: الأصباغ الحمض النووي يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص في حالة النتائج السلبية للفحوصات مع اللونية السريعة، أو كوسيلة لأكثر بعناية (كميا) التوسع في النتائج الأولية من المقايسات اللونية. وهناك فائدة الأساسية للبروتوكولات NA اللونية، بالإضافة إلى سهولة الاستخدام، هو أنها تعتمد فقط على المشاركة الجوهريةالتكافؤ هيكل الوافدين الجدد بدلا من الهياكل fold/3D، نشاطية، أو أية خصائص أخرى من البوليمر الحيوي التي قد تختلف مع التسلسل.

وصف بروتوكولات هنا هي قوية ضد معظم الصعوبات، لا سيما عندما يؤديها مع الفحص البصري البسيط للمنتجات التفاعل، ويجب توخي الحذر خاصة للتحليلات أكثر الكمية (الطيفي). على سبيل المثال، يجب فحص في لبنديكت أن إزالة الكثيرمن الحمراء (PPT) التي تشكل في وجود تركيزات عالية من الريبوز قبل التحليل الطيفي؛ ويتحقق بسهولة عن طريق الطرد المركزي هذا. لفحص وDische، ويرافق إضافة كاشف ثنائي فينيلامين من تشكيل PPT البيضاء التي يمكن solubilized عن طريق التسخين؛ لPPT الأخضر الذي يشكل في وجود الحمض النووي قد تتداخل مع قياسات طيفية ويجب إزالة قبل التحليل الكمي. وبالإضافة إلى ذلك، تقوم كل مقايسة على التفاعلات الكيميائية التي هي عرضةلinterferents المحتملة، كما ذكر في مقدمة أكثر تفصيلا وأدناه. وأخيرا، نلاحظ أن تركيز عال نسبيا من الحمض النووي الريبي في خليط DNA / RNA يمكن أن تحجب النتيجة المتوقعة الإيجابية للفحص Dische ل، وهذا سلبية كاذبة لDNA تنبع من حقيقة أن الكسر الجزيئي عالية من الحمض النووي الريبي يتفاعل أيضا، عن طريق وسيطة فورفورال، مع الكواشف وDische، ولكن ينتج منتج عديم اللون بدلا من اللون الأزرق ناتج إضافة رد الفعل التي تنتجها مع السكر 2'-deoxypentose من الحمض النووي.

Interferents المحتملة: ما وراء حالة واضحة من الدهون والسكريات والبروتينات نوعان من الجزيئات الحيوية الأخرى التي يمكن أن تسبب مشكلة مع هذه افتراضا المقايسات اللونية بسبب تفاعل المتبادل (ايجابيات كاذبة) أو تفاعل ملثمين (السلبيات كاذبة). من حيث المبدأ، يمكن أن عدة أنواع من الدهون الخلوية تتدخل تصور، بما في ذلك glycosylglycerols وglycerolipids أخرى مترافق إلى السكريات، والشحميات السفنغولية السكرية (على سبيل المثال، سيرbrosides)، saccharolipids (على سبيل المثال، الجلوكوزامين المشتقات)، عديدات سكر شحمية، وهلم جرا. في الممارسة العملية، هذه الفئات من الدهون من غير المرجح أن يمثل مشكلة في العمل مع البروتينات لأنها محبة للدهون نادرة نسبيا، مقابل الدهون الفوسفاتية أكثر وفرة، وبالتالي دون حدود الكشف عن المقايسات لدينا. لأن يتم بناؤها أكثر من الدهون في الخلايا المذكورة أعلاه على hexoses (سكر اللبن، السكر) بدلا من pentoses، لا ينبغي أن تتدخل وايجابيات كاذبة في لبيال أو المقايسات Dische ل. السكريات الأحادية الحرة التي قد تعطي ايجابيات كاذبة تشمل الفركتوز، galactofuranose، أو furanoses أخرى. وعلى صعيد متصل، يمكن أن تدخل من السكريات غير المرغوب فيها لتصبح قضية البروتينات المؤتلف مع المالتوز أعرب ملزم به (MBP) البروتين. في اللوني تقارب الخطوات المستخدمة لتنقية يبني الانصهار هذه، يتم استخدام المالتوز إلى أزل البروتين، وأنه من المتصور أن المالتوز المتبقية في التحضيرات النهائية يمكن أن تتداخل مع اله بنديكت الفحص (وهو الأكثر عمومية / غير محددة من المقايسات، وحدات الجلوكوز من المالتوز لا ينبغي أن تتفاعل تحت لبيال أو في Dische). وهكذا، فإن المرء لابد أن تتوخى الحذر في الخطوات ما بعد الكروماتوغرافي لضمان أن المالتوز المتبقية لم تسفر عن نتائج زائفة. نحن لم نجرب أو البروتينات glucosylated جليكوبروتينات أخرى، ولكن نشك أنه سيكون من الصعب الحصول على نتيجة إيجابية واضحة لوجود السكريات على البروتينات مثل (أو شحمي سكري، بروتيوغليكان، أو غليكوكونجوغاتيس أخرى) لأننا نتوقع أن الأنصاف غليكان سوف تقع أقل من الحد حساسية المقايسات لدينا. من حيث المبدأ، محلول يحتوي على ألدوهكسوز الحرة مثل الجلوكوز، ومتحررة من بروتين glucosylated عبر التحلل الحامض، واختبار إيجابية من الفحص وبنديكت، وبالمثل، وهو بروتين سكري المستمدة البنتوز، مثل الزيلوز، ينبغي تسفر عن نتيجة إيجابية في لبيال مقايسة. ومع ذلك، في الممارسة العملية فإن نتيجة إيجابية للغاية جليكوبروتينات تتطلب ح تركيزات البروتين igh، وحتى بالنسبة للالبروتينية الغليكوزيلاتي تتضاعف، وذلك بسبب نسبة السكر / منخفض البروتين الرحى.

ويمكن تمديد البروتوكولات مقايسة صفها هنا وتكييفها للتعامل مع حدود صغر حجم العينة - أي كميات صغيرة أو تركيزات منخفضة من analytes. لكميات عينة محدودة وجدنا أنه يمكن تحجيم ردود الفعل وصولا الى مجموعة 100-ميكرولتر (على سبيل المثال، وذلك باستخدام أنابيب PCR وthermocycler للخطوات الحضانة). يمكن لعينات صغيرة الحجم في تركيزات منخفضة (بالقرب من حدود الرصد)، يمكن استخدام الطيف مجهزة قارئ لوحة، وفي مثل هذه السيناريوهات، وصعوبة المتوقع سيكون فقط إزالة أي غير المرغوب فيها الكثيرمن قبل قياسات الامتصاصية. على الرغم من الكشف عن مجموعة محدودة من الفحص البصري البسيط، والاستفادة من النهج المبين هنا هو كفاءته وسرعة، مع عينات قابلة للتحلل في الحال عند التدفئة.

"قدم> تطبيقات البروتوكولات هنا تشمل تحديد شارك في تنقية المركبات، وتقييم RNA أو DNA النقاء، والكشف عن التلوث أو NA المتبقية السكر في عينات البروتين، فعلى سبيل المثال، يمكن إزالة غير المرغوب فيه الكشف عنها بواسطة NA المقايسات لدينا من والإعدادية البروتين عن طريق وسائل الكيميائية (مثل التحلل القلوي من RNA) أو الهضم الأنزيمي (على سبيل المثال، نوكلياز العلاج). على الرغم من أن هناك أساليب بديلة لمثل هذه التطبيقات، والأساليب المذكورة هنا هي كفاءة عالية سواء من حيث الوقت والتكلفة، ويمكن أن لذلك يمكن دمجها بسهولة في سير عمل تجريبي. والكشف المبكر للمشتركين في تنقية المركبات والحد من السكر مجانا، RNA، DNA، أو البروتين يمكن توجيه تصميم من الخطوات لتنقية مجرى النهر، مقابل محاكمة شاقة والدراسات الخطأ. خطوة مشتركة بعد بروتوكولات لدينا قد يكون عزل الحمض النووي الريبي DNA والبروتين من، عبر استخراج الفينول كلوروفورم ثيوسيانات، أو استعادة ألون DNAه (من خلال استبعاد ثيوسيانات) 20 تقييم نقاء ناس الناتجة عن قلع الفينول كلوروفورم، يمكن استخدام هذه المقايسات اللونية كبديل بسيطة لعلاج الكهربائي أو الدناز. هذا وبطرق أخرى، يمكن الجمع بين المقايسات اللونية الموصوفة هنا مع أساليب راسخة للبروتين NA والتصميم على تحقيق نظام سريع وقوي لتوضيح RNA، DNA، ومكونات البروتين في عينات الجزيئية البيولوجية غير المتجانسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة فرجينيا والنصب التذكاري الاستئماني Jeffress (J-971). نشكر L. كولومبوس، جاين K.، P. راندولف ومفيدة للمناقشات والقراءة النقدية للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875
Concentrated HCl VWR BDH3030
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877
Diphenylamine Aldrich 112763
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Ethanol Koptec V1101
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
  2. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
  3. Ausubel, F. M. Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. 4th, Wiley. (1999).
  4. Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. 4th, John Wiley & Sons. (2011).
  5. Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. The Biochemistry of the Nucleic Acids. 10th, Chapman and Hall. (1986).
  6. Rice, P. A., Correll, C. C. Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. RSC Pub. (2008).
  7. Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. (2012).
  8. Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
  9. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
  10. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  11. Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
  12. Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
  13. Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
  14. Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
  15. Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
  16. Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
  17. Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
  18. Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
  19. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, (Pt. 2), 99-108 (1999).
  20. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
فحوصات اللونية السريعة للتمييز نوعيا RNA والحمض النووي في العينات البيولوجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).More

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter