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Chemistry

Rapid tests colorimétriques de vue qualitatif Distinguer l'ARN et de l'ADN dans les échantillons biomoléculaires

doi: 10.3791/50225 Published: February 4, 2013

Summary

Une suite de tests colorimétriques est décrit pour la protéine rapidement distinctif, d'ARN, d'ADN, et re-duire des sucres dans des échantillons biomoléculaires potentiellement hétérogènes.

Abstract

L'expérimentation biochimique nécessite généralement une connaissance précise, à un stade précoce, de l'acide nucléique, des protéines et des composants biomoléculaires autres spécimens potentiellement hétérogènes. Les acides nucléiques peuvent être détectés par plusieurs approches établies, y compris les méthodes d'analyse qui sont spectrophotométrique (par exemple, A 260), fluorimétrique (par exemple, la fixation de colorants fluorescents), ou colorimétriques (nucléosidiques spécifiques à des réactions chimiques chromogènes) 1. Bien qu'il ne puisse distinguer facilement ARN à partir de l'ADN, l'A 260 / A ratio de 280 est couramment utilisé, car il offre un moyen simple et rapide 2 évaluation de la teneur relative de l'acide nucléique, qui absorbe principalement près de 260 nm et de protéines, qui absorbe principalement près de 280 nm. Ratios <0,8 sont pris comme une indication de «pures» des échantillons de protéines, tandis que pur acide nucléique (NA) est caractérisé par des ratios> 1,5 3.

However, il existe des scénarios dans lesquels la teneur en protéines / NA peut ne pas être aussi clairement ou de manière fiable déduite de simples uv-vis des mesures spectrophotométriques. Par exemple, (i) des échantillons peut contenir une ou plusieurs protéines qui sont relativement dépourvu des acides aminés aromatiques responsables de l'absorption à 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), comme c'est le cas avec certaines petites protéines de liaison d'ARN, et (ii) Les échantillons peuvent présenter des intermédiaires A 260 / A 280 rapports (~ 0,8 <~ 1.5), où la teneur en protéines / NA est beaucoup moins clair et peut même refléter une certaine affinité élevée association entre la protéine et les composants NA. Pour ces scénarios, nous décrivons ici une suite de tests colorimétriques de distinguer rapidement l'ARN, l'ADN et les sucres réducteurs dans un échantillon potentiellement mixte de biomolécules. Les méthodes reposent sur la sensibilité différentielle des pentoses et d'autres glucides à Benoît, Bial (orcinol), et de DISCHE (diphénylamine) réactifs, les protocoles simplifiés peuvent être comachevé en quelques minutes, sans aucune étape supplémentaire d'avoir à isoler les composants. Les analyses peuvent être effectuées en parallèle à la différence entre l'ARN et l'ADN, ainsi que d'indiquer la présence de sucres réducteurs libres tels que le glucose, le fructose, le ribose et (Figure 1).

Introduction

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Une grande partie de la biologie cellulaire se produit via des interactions moléculaires impliquant l'ADN et de l'ARN. 4 Ces acides nucléiques d'origine naturelle (AN) interagissent les uns avec les autres, 5 pour les protéines, les 6 et avec une multitude de composés à petites molécules et des ligands in vivo (par exemple, les cations divalents 7). Les interactions peuvent être de courte ou de longue durée (cinétique), peut aller de modéré à élevé pour une faible affinité (force thermodynamique), et peuvent également présenter des variations importantes dans les propriétés chimiques et la spécificité - certaines associations sont très spécifiques (par exemple, l'ADN · · · facteurs de transcription, l'ARN · · · facteurs d'épissage), tandis que d'autres interactions sont nécessairement beaucoup plus générique (par exemple, l'ADN · · · bactériennes comme les protéines histone-HU 8). Interactions non spécifiques avec AN peut avoir des conséquences pratiques pour les expériences in vitro impliquant des mélanges de biomolecules, comme il est possible, et même probable, que certains AN va associer avec les biomolécules d'intérêt, du moins dans un sous-ensemble des conditions expérimentales utilisées (force ionique, le pH, etc.)

Considérons, par exemple, la production d'une protéine d'intérêt (POI) par l'intermédiaire hétérologue sur-expression de la protéine recombinante dans la culture d'Escherichia coli cellule, une telle procédure est réalisée en routine dans pratiquement n'importe quel laboratoire de biologie structurale 9 En préparation pour d'autres expériences, comme. que la caractérisation biochimique / biophysique, cristallisation, etc., les premiers efforts se concentrent généralement sur ​​l'obtention d'une quantité suffisante de POI en tant que pure que possible, idéalement dans un échantillon chimiquement homogène et biophysique monodisperse. Après la perturbation des cellules hôtes, les premières étapes d'un flux de travail typique de purification visent à isoler le POI de E. coli protéines, des acides nucléiques, des débris de parois cellulaires,et d'autres composants du lysat cellulaire. Cependant, l'hôte AN peut co-purifient avec le POI pour plusieurs raisons physico-chimiques - un POI fortement basique peut non spécifiquement déroulant hôte d'ADN / ARN, le POI peut avoir un générique NA activité de liaison (par exemple, le susmentionné HU); le POI peut être une assez spécifique NA-binding protein, mais présentent une réactivité croisée avec des ARN ou ADN hôte; hôte AN peut interagir avec une matrice de chromatographie et de ce fait tout simplement co-éluer avec le POI, et ainsi de suite. Sans discrimination, de haute affinité de liaison de l'hôte AN vers un POI peut poser un problème épineux car les impuretés NA sera vraisemblablement d'entraver des expériences en aval (par exemple, les dosages d'anisotropie de fluorescence de POI contraignant • ARN 10). Alternativement, POI imprévue · · · associations NA peut également être vu par hasard, que ces interactions éclairer nucléique du POI acide capacité de liaison. De toute façon, si AN sont des éléments clés ou de contaminants, il faut d'abord quantifier etidentifier le type (ADN, ARN) de co-purification AN en préparation pour les expériences en aval.

Plusieurs méthodes analytiques existent pour détecter et quantifier dans un échantillon AN. La plupart des méthodes disponibles sont fondamentalement soit spectrophotométrique (par exemple, A 260 et des valeurs d'absorbance A 260 / A 280 rapports), fluorimétrique (par exemple, la liaison de thiazole orange ou d'autres colorants fluorescents à NA), ou colorimétriques (sensibilité de nucléosides à des réactions chimiques que chromophores absorbant rendement dans la région UV-VIS du spectre électromagnétique), comme l'a récemment décrit par De Mey et al. 1 Toutefois, l'étape cruciale de l'identification du type de polynucléotide tel que l'ARN ou de l'ADN est au-delà de la portée d'un grand nombre de ces quantification approches. Ici, nous fournissons un ensemble de tests colorimétriques pour identifier rapidement les types de composants NA dans un échantillon protéique.

Les protocoles décrits ici cun être efficacement exécutée sans mesures supplémentaires d'isoler les impuretés potentielles NA, et reposent sur ​​le dosage de Benoît XVI pour les sucres réducteurs 11, pour le dosage orcinol pentoses 12,13, 14,15 et réactions diphénylamine de 2'-deoxypentoses (figures 1 et 2) . Test de la Bénédict (figure 2a) utilise la capacité de la forme linéaire, à chaîne ouverte (aldéhyde) d'un sucre aldose à réduire Cu 2 +, avec oxydation simultanée de carbonyle du sucre à un groupement carboxylate et production de Cu 2 O en tant que insoluble précipité rouge. Cette réaction avec un résultat positif libres des sucres réducteurs, tels que les aldoses et les cétoses (qui convertissent les aldoses correspondants via les intermédiaires endiol), mais pas avec les sucres pentoses qui sont verrouillés en forme cyclique comme partie du squelette covalent de l'ADN ou un polynucléotide d'ARN. En raison de l'exigence minimaliste d'une fonctionnalité gratuite hémiacétal, autre compounds qui pourrait le test est positif dans cet essai - et donc agir comme interférents potentiels - notamment α-hydroxy-cétones et d'oligosaccharides de courte durée (par exemple, le maltose disaccharide). À la fois l'd'Bial orcinol (figure 2b) et Dische de diphénylamine (figure 2c) réactions sont basés sur la destruction initiale du squelette polynucléotidique, par l'intermédiaire d'une dépurination de l'nucléoside et d'acide ou encore catalysée par une base d'hydrolyse des nucléotides parent, pour donner furan-2 -carbaldéhyde (furfural) dérivés; ces dérivés réagissent ensuite avec soit un phénol polyhydroxylé tels que orcinol (Bial) ou diphénylamine (Dische l') les réactifs pour former des produits de condensation de couleur de la structure chimique largement inconnus. L'ADN par rapport à la spécificité de l'ARN du dosage Dische provient du fait que le sucre pentose doit être 2'-désoxygéné afin d'être sensible à l'oxydation à ω-aldéhyde hydroxylevulinyl, qui réagit en outre avec la diphénylaminedans des conditions acides pour obtenir un bleu vif condensat (figure 2c). En utilisant les protocoles simplifiés décrits ici, nous avons constaté que ces réactions colorimétriques spécifiques à sucre peut différencier entre l'ARN et de l'ADN, et indiquent également la présence de sucres réducteurs libres tels que le glucose, le fructose, ribose ou dans un échantillon biomoléculaire.

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Protocol

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1. Benoît Dosage de sucres réducteurs

  1. Préparer une quantité appropriée de solution de Benedict - 940 mM de carbonate de sodium anhydre, 588 mM de citrate de sodium dihydraté, 68 mM de sulfate de cuivre pentahydraté (II). Ce réactif peut être conservé à température ambiante (TA) pendant au moins six mois, sans changement notable dans la réactivité.
  2. Le réactif ci-dessus est 6x. Ainsi, pour 600 réactions ul, ajouter 100 ul de réactif de Benedict propre à un tube de 1,5 ml (par exemple Eppendorf marque), par échantillon à doser.
  3. Ajouter allant de 10 ul à 500 ul d'échantillon de ce tube, le volume optimal peut être déterminé sur la base de l'intensité de la formation de couleur dans un essai de fonctionnement initial. Si l'échantillon est suffisante avant de commencer ces essais au volume d'échantillon maximale possible (soit cinq sixièmes de la réaction globale du volume, 500 ul de l'échantillon dans le cas présent), puis diluer dans des essais ultérieurs.
  4. Ajouter ddH 2 O à la TUêtre de ramener le volume final à 600 ul; mélanger la solution au vortex ou pipetage.
  5. Incuber les échantillons pendant 20 min dans un bain d'eau bouillante.
  6. Retirer l'échantillon chauffé du bain et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 10 min.
  7. Centrifuger le tube échantillon à> 9300 xg (~ 10.000 rpm dans un FA45-24-11-Eppendorf fixe l'angle du rotor) pendant 5 min afin de sédimenter toute matière particulaire; cette étape est plus importante pour les études quantitatives plutôt que qualitatives.
  8. Aliquote du surnageant à partir de ce tube dans une cuve propre.
  9. Blank le spectrophotomètre UV-VIS avec de l'eau.
  10. Mesurer l'absorbance de l'échantillon à 475 nm.

2. Essai Orcinol Bial pour les sucres pentoses

  1. Préparer une quantité appropriée de réactif de Bial frais de - 24,2 mM orcinol monohydraté (voir Figure 2b de la structure de ce composé), 6 M HCl, 0,025% p / v chlorure ferrique hexahydraté. Remarque:Pour un stockage prolongé, le réactif de Bial peuvent être préparés comme deux solutions de stock distinctes: (i) Réactif A [0,05% p / v FeCl3 • 6H 2 O dans HCl concentré] et (ii) Réactif B [422 mM monohydrate orcinol préparé dans 95 % d'éthanol]. Réactif A peut être conservé à température ambiante pendant six mois; Réactif B peut être conservé à 4 ° C pendant un mois, recouverts d'une feuille de limiter l'exposition de la lumière. Ces solutions mères sont mélangés dans un 15 (A): 1 (B) v / v rapport avant utilisation.
  2. Le réactif ci-dessus est 2x. Ainsi, pour les réactions de 1,0 ml, ajouter 500 ul de réactif de Bial propre à un tube de 1,5 ml par échantillon à doser.
  3. Ajouter allant de 10 à 500 ul ul d'échantillon à ce tube. Conformément à la note 1.3 (ci-dessus), si l'échantillon est suffisante avant de commencer réactions essais avec le volume d'échantillon maximale possible (c.-à-moitié le volume de réaction globale, 500 ul d'échantillon dans le cas présent) et diluer à partir de là.
  4. Ajouter ddH 2 O dans le tube pour amener le fle volume inal à 1,0 ml, mélanger la solution au vortex ou pipetage.
  5. Incuber les échantillons pendant 20 min dans un bain d'eau bouillante.
  6. Retirer l'échantillon chauffé du bain et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 10 min.
  7. Centrifuger le tube échantillon à> 9300 xg (~ 10.000 rpm dans un FA45-24-11-Eppendorf fixe l'angle du rotor) pendant 5 min afin de sédimenter toute matière particulaire; cette étape est plus importante pour les études quantitatives plutôt que qualitatives.
  8. Aliquote du surnageant à partir de ce tube dans une cuve propre pour une inspection visuelle.
  9. Pour analyse semi-quantitative, vide le spectrophotomètre UV-VIS avec de l'eau et de mesurer l'absorbance de la cuve d'échantillon à 660 nm.

3. Dische de dosage Diphénylamine pour 2'-deoxypentose Sucres

  1. Préparer une quantité appropriée de réactif Dische de diphénylamine - 60 mM diphénylamine, 11 M d'acide acétique glacial, 179 mM d'acide sulfurique, 62% v / v d'éthanol. Ce réactif peut être prépar rapport à l'avance et stocké à température ambiante dans un endroit sombre, ou recouverts d'une feuille, pour limiter l'exposition de la lumière. En raison de la sensibilité à la lumière réactif ne doit pas être stockées indéfiniment, mais en pratique, il peut être préparé tous les deux à trois mois sans changement apparent de la réactivité.
  2. Le réactif ci-dessus est 2x. Ainsi, pour les réactions de 1,0 ml, ajouter 500 ul de réactif Dische à un endroit propre tube de 1,5 ml par échantillon à doser.
  3. Ajouter allant de 10 à 500 ul ul d'échantillon à ce tube. Conformément à la note 1.3 (ci-dessus), si l'échantillon est suffisante avant de commencer réactions essais avec le volume d'échantillon maximale possible (c.-à-moitié le volume de réaction globale, 500 ul d'échantillon dans le cas présent) et diluer à partir de là.
  4. Ajouter ddH 2 O sur le tube pour amener le volume final de 1,0 ml, mélanger la solution au vortex ou pipetage.
  5. Incuber les échantillons pendant 20 min dans un bain d'eau bouillante.
  6. Retirer l'échantillon chauffé de la salle de bain et alloil w refroidir à température ambiante pendant 10 min.
  7. Centrifuger le tube échantillon à> 9300 xg (~ 10.000 rpm dans un FA45-24-11-Eppendorf fixe l'angle du rotor) pendant 5 min afin de sédimenter toute matière particulaire; cette étape est plus importante pour les études quantitatives plutôt que qualitatives.
  8. Aliquote du surnageant à partir de ce tube dans une cuve propre pour une inspection visuelle.
  9. Pour analyse semi-quantitative, vide le spectrophotomètre UV-VIS avec de l'eau et de mesurer l'absorbance de la cuve d'échantillon à 600 nm.

4. Remarques sur l'utilisation d'autres

  1. Les catégories suivantes de molécules sont des composés de référence appropriés pour des réactions témoins positifs et négatifs pour chaque essai:
    • Benoît XVI - Positif = sans ribose, le fructose, le glucose, négatif = ARN, ADN, ATP, etc. (Tout saccharide manque une fonctionnalité sans sucre réducteur)
    • Bial - Positif = ARN (extrait de levure de boulanger par exemple), le ribose, l'ATP, l'UMP, négatif = bovin serviceeuh albumine (BSA) ou toute autre protéine
    • Dische de - Positif = ADN (par exemple thymus de veau); négative = ARN, ATP, etc. (N'importe quel nucléotide non-2'-désoxygéné)
  2. Ces essais ont été jugés plutôt bien résisté à des composés souvent utilisés dans la purification des protéines; par exemple, les sels communs tels que NaCl, (NH 4) 2 SO 4 et K 2 SO 4 n'a pas interféré, et les réactions apparaissent généralement pas affecté par le contenu du diluant. Détergents ou des agents chaotropes tels que l'urée peut affecter la réactivité des tests si le pH est fortement basique, un pH neutre à acide est généralement la plus optimale pour les années Bial et analyses DISCHE à cause de la chimie de la réaction sous-jacente (voir le texte et les protons la figure 2b, c). Conditions de la réaction potentiellement interférents sous-optimales, suspects, etc. devrait être testé sur une base au cas par cas, en utilisant positifs et négatifs des expériences de contrôle wcomposés de référence vec.

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Representative Results

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Les résultats sont présentés dans la figure 3 pour l'application de ces tests colorimétriques à des composés de référence connus. Représentatifs des données qualitatives sont présentées pour la Benedict (a), orcinol Bial (b), et DISCHE de diphénylamine (c) les essais et les courbes standard pour ces trois essais sont présentés dans la figure 4. Dans les panneaux 3 (ac), les panneaux de gauche montrent les expériences de contrôle positifs / négatifs en utilisant des analytes convenablement réactifs / non réactif; ces résultats visuels sont présentés in situ, dans les cuvettes comme décrit dans les protocoles 1-3 (ci-dessus). Le droit de sous-groupes montrent une série de titrage pour chaque analyte respectif. Essai de la Bénédict (a), le témoin positif est le ribose (0,42 mg / ml), alors que les témoins négatifs sont l'eau, une protéine générique (0,75 mg / ml de BSA), et deux sucres non réducteurs (ADN à 0,75 mg / ml et de l'ARN à 12,5 mg / ml). Dans l'essai orcinol (b), les témoins positifs sont ribose (0,15 mg / ml), de l'ARN (7,5 mg / ml), et de l'ADN (0,45 mg / ml), tandis que l'eau et BSUne protéine (0,45 mg / ml) sont des témoins négatifs. Dans l'essai de diphénylamine (c), ADN de thymus de veau (0,45 mg / ml) est représentée en tant que témoin positif, et de l'eau, extrait de levure ARN (7,5 mg / ml), ribose (0,15 mg / ml), et de la BSA (0,45 mg / ml) servent de témoins négatifs. Enfin, le panneau (d) illustre la robustesse des tests en montrant la réaction de l'Dische avec des échantillons de différentes hétérogénéité: deux concentrations d'ADN sont présentés comme témoin positif dans les deux échantillons gauche (cuves 1-2), l'ADN + ARN mélanges ( à des taux différents) sont présentés dans les trois prochaines échantillons (3-5), et les trois derniers exemples montrent l'ADN en l'absence (échantillon 6) ou en présence (échantillons 7-8) de l'acide nucléique-protéine de liaison »Hfq». 16 On notera que le résultat positif du test de la Dische est préservé pour les échantillons contenant de l'ADN, même en présence de «contaminer» l'ARN ou les protéines.

Analyse quantitative: Les gammes de dilution dans la figure 3 (ac) panneaux varient car chaqueréaction a une limite de détection visuelle distincte, en fonction du type de sucre est dosé. Spectrophotométrique, plutôt que visuelle, la détection peut être utilisé pour améliorer les gammes de mesure, par exemple, comme le montre la figure 4 pour le (a) de Benoît XVI, (b) Bial, et (c) des dosages de DISCHE. Bien que les protocoles décrits ici sont destinés à des essais principalement qualitatives, la relation de Beer-Lambert entre l'absorbance et la concentration permet au moins semi-quantitative estimation de la teneur en sucre ou acide nucléique. A titre d'exemple d'une courbe standard pour l'étalonnage du test de Benoît XVI, une régression linéaire de l'absorbance (475 nm) de la concentration en ribose est illustré à la figure 4 (a); barres d'erreur indiquent l'écart-type de n = 3 répétitions, et le coefficient de corrélation au carré est prévu. La déviation de la linéarité à des concentrations très faibles ribose (par exemple, la donnée 0,28 mM) reflète la sensibilité limitée de ce dosage. Bien que le tantdit sont principalement destinés à des études qualitatives, les lignes directrices suivantes sont suggérées pour analyse semi-quantitative:

  • Pour le dosage de l'Benedict (figure 4a): La lecture réaction (A 475nm) a été trouvé pour être linéaire au moins sur la plage de 0,04 → 0,5 mg / ml analyte, telle que pratiquée en trois exemplaires.
  • Pour le dosage de la Bial (figure 4b): Les données d'absorbance (A 660nm) était linéaire au moins sur la plage de 0 → 0,5 mg / analyte ml (levure de boulanger ARN), le test ayant été effectué en trois exemplaires (R 2 = 0,99 régression linéaire coefficient). Bien que les échantillons ont été centrifugés des éclaircissements avant que les mesures d'absorbance, aucune précipitation a été trouvée à ces faibles concentrations d'analyte et donc l'étape de centrifugation n'était pas strictement nécessaire. Le test s'écarte de la linéarité des concentrations d'analytes au-delà de cette gamme.
  • Pour le dosage Dische (figure 4c): La 600nm A 2 = 0,99). Le tracé de l'absorbance en fonction [analyte] a commencé à se stabiliser à 0,90 mg / ml d'ADN, ce qui indique la limite de la région de réponse linéaire.
  • Considérations pratiques pour l'analyse quantitative ou semi-quantitative: Pour retirer la matière précipitée qui serait autrement interférer avec les lectures d'absorbance, tous les trois dosages nécessitent une centrifugation à vitesse maximale (25.000 xg, ou quoi que limite peut être supportée par les microtubes) pour des longueurs de temps raisonnable (par exemple, 20 min), ce qui est particulièrement important à des concentrations plus élevées d'analyte. Après centrifugation, des échantillons clarifié peut être transféré dans une cuvette ou microplaques (par exemple, des plaques de microtitration 96-puits) pour les mesures d'absorbance avantageuses.

Figure 1 Figure 1. Arbre de décision pour l'application des tests. À partir d'un échantillon potentiellement hétérogènes de biomolécules (par exemple, à partir de l'ensemble des lysats de cellules), les dosages colorimétriques décrites ici peuvent être utilisées pour déterminer si le mélange contient des sucres non réducteurs (test de Benedict). Si oui, alors orcinol test de Bial révèle en outre que la population de sucres non réducteurs contient anneaux pentose (comme dans l'ADN ou de l'ARN), contre hexoses (par exemple, le glucose, pyranoses autres) et peut-être encore d'autres aldoses. Enfin, si l'échantillon contient au moins une fraction modérée de l'ADN puis l'anneau 2'-désoxyribose va réagir (lors de l'acidification et chauffage) avec le réactif Dische de diphénylamine, ce qui donne un produit de condensation visiblement bleu. Notez que ce diagramme est un arbre de décision, et non pas un organigramme: la logique des résultats du test est indiqué serially, mais les analyses peuvent être exécutées en parallèle.

Figure 2
Figure 2. Réactions chimiques sous-jacents sont présentés pour les dosages colorimétriques, avec le produit détectable de couleur indiqué à côté des réactions correspondantes. (A) L'insoluble précipité rouge de Cu 2 O est le résultat positif de test de Bénédict pour les sucres réducteurs. (B) Lors du chauffage et de l'acidification, les sucres pentoses contenant des cycles se décomposent en furfural, qui réagit ensuite avec orcinol (réactif de Bial) soluble pour donner un produit d'addition bleu-vert. Dans Dische dosage, le manque d'un substituant hydroxy en position 2 'permet une réaction d'oxydation par ouverture de cycle, le produit aldéhydique de qui réagit en outre avec la diphénylamine [(Ph) 2 NH] pour donner un produit bleu vif. Chemical erructures restent inconnues pour les grands produits de condensation de plusieurs plaques de l'orcinol (b) et de la diphénylamine (c) réactions.

Figure 3
Figure 3. Les résultats des échantillons application des tests colorimétriques de composés de référence et des échantillons hétérogènes. Sont présentés pour les années Benedict (a), Bial (b), et de DISCHE (c) les essais colorimétriques. En (a) → (c), les sous-panneaux de gauche montrent les contrôles positifs / négatifs en utilisant des analytes convenablement réactifs / non réactif et le droit de sous-groupes montrent une série de titrage pour chaque analyte. On voit également un panneau indicatif de Dische réactions (d), dans lequel la substance à analyser varie en hétérogénéité - soit l'ADN seul (à gauche), de l'ADN / ARN de mélanges de différents ratios (au milieu), ou de l'ADN en présence d'un acide nucléique-protéine associée ( «Hfq '). Ces panneauxsont décrits plus en détail dans la section Résultats Représentant du texte.

Figure 4
Figure 4. Les courbes standard de tests avec des composés de référence. Courbes d'étalonnage sont indiquées pour les années Benedict (a), (b Bial), et de DISCHE (c) les essais, représentant une portion représentative de la région de la réponse linéaire pour chaque test. La régression linéaire ajusté et des coefficients de corrélation correspondants sont indiqués pour chaque test. Norme de levure de boulanger ARN (b) et l'ADN de thymus de veau (c) sont les substances à analyser dans ces séries de titrage. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

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Les essais colorimétriques présentés ici offrent une approche simple pour évaluer rapidement la nature chimique des mélanges biomoléculaires, tels que ceux rencontrés lors de la purification des protéines, ARN ou des complexes de l'ensemble du lysat cellulaire en préparation pour des études ultérieures. En biologie structurale poursuit assemblages plus locuteur natif, les défis progressivement plus grandes, telles que l'hétérogénéité des échantillons, seront posées par les complexes complexes et multi-composants. Assemblages supramoléculaires sont souvent que marginalement stable, et leur isolement succès peut exiger des conditions de purification moins strictes (par exemple, que l'on trouve des complexes snRNP spliceosomal 17,18). Dans de telles conditions plus douces à la fois authentique et faux POI · · · interactions NA sont plus susceptibles de persister et ainsi interférer dans les essais en aval avec une protéine ou un acide nucléique cible. Une première étape nécessaire est l'identification des types de composants chimiques contenus dans ces échantillons.

ve_content "> Méthodes pour détecter l'ARN, l'ADN et les protéines varient selon la quantité et la concentration des analytes, des ressources disponibles et des contraintes de temps et, surtout, ses connaissances a priori sur la composition chimique susceptibles de les analyser. matériau protéinique peut être détecté par de nombreuses méthodes bien établies, y compris ceux qui sont spectroscopique (A 280), hydrodynamique (électrophorèse sur gel), des produits chimiques / colorimétrique 19 (par exemple, test de biuret pour des liaisons peptidiques) et, avec beaucoup de sensibilité et de précision, par spectrométrie de masse. De même, les AN peuvent être détectés par des tests spectroscopiques (A 260), fluorimétrique ou chimique (décrit ici). Chaque type de méthode présente les points forts et les points faibles caractéristiques. Par exemple, PicoGreen, SYBR-or, et d'autres à base de cyanine colorants fluorescents sont très sensibles à l'acide nucléique (plusieurs ordres de grandeur au-delà des dosages colorimétriques), présentent divers degrés de sélectivité (par exemple, PicoGreen pour l'ADN double brin, SYBR-or se lie plus AN), et disposent également de larges plages dynamiques à des fins de quantification. Cependant, ces approches ne sont pas sans limites: les colorants nécessitent du matériel plus perfectionné de détection (transilluminateurs de gels, spectrofluoromètres pour des lots d'échantillons), par rapport à lecture visuelle de simples essais colorimétriques, les colorants sont considérés comme mutagènes, semblables à du bromure d'éthidium, et il des restrictions sur les conditions d'essai (par exemple, une gamme de pH recommandée de 7 à 8,5 pour SYBR-Gold, une réduction de 30% de l'intensité du signal à PicoGreen> NaCl 200 mM). Ainsi, les dosages colorimétriques et à base de fluorescence sont complémentaires: les colorants acides nucléiques pourrait être particulièrement utile en cas de résultats négatifs avec les tests rapides colorimétriques, ou comme un moyen de plus de soin (quantitativement) développent les premiers résultats de tests colorimétriques. Un avantage fondamental des protocoles NA colorimétriques, en plus de la simplicité d'utilisation, est qu'ils reposent uniquement sur la coopération intrinsèquestructure de valence des AN plutôt que des structures fold/3D, réactivités ou à d'autres propriétés du biopolymère qui peut varier avec la séquence.

Les protocoles décrits ici sont robustes contre la plupart des difficultés, en particulier lorsqu'elle est effectuée avec une simple inspection visuelle des produits de réaction; une attention particulière doit être pris pendant plus quantitative (spectrophotométrie) analyses. Par exemple, dans le test de Benoît XVI le précipitant rouge (ppt) qui se forme dans la présence de concentrations élevées de ribose doit être retiré avant l'analyse spectrophotométrique, ce qui est facilement obtenu par centrifugation. Pour le dosage de la Dische, l'ajout de réactif diphénylamine est accompagnée par la formation d'un ppt blanc qui peut être solubilisée par chauffage, un ppt vert qui se forme en présence de l'ADN peut interférer avec les mesures spectrophotométriques et doit être retiré avant l'analyse quantitative. En outre, chaque test est basé sur des réactions chimiques qui sont susceptiblesd'interférents potentiels, tel que mentionné dans l'introduction et détaillées ci-dessous. Enfin, nous notons que la concentration relativement élevée de l'ARN dans un mélange d'ADN / ARN peuvent masquer le résultat positif attendu de dosage Dische l', ce faux négatifs pour l'ADN provient du fait qu'une fraction molaire élevée de l'ARN réagit également, via des intermédiaires furfural, avec des réactifs du DISCHE, mais donne un produit incolore plutôt que le produit d'addition bleue produite par réaction avec le sucre 2'-deoxypentose de l'ADN.

Interférents potentiels: au-delà du cas évident de sucres, de lipides et de protéines sont deux autres biomolécules qui pourraient hypothétiquement provoquer des problèmes avec ces dosages colorimétriques dues à la réactivité croisée (faux positifs) ou de réactivité masqué (faux négatifs). En principe, plusieurs types de lipides cellulaires pourraient éventuellement intervenir, y compris glycosylglycerols et glycérolipides autres conjugués à des sucres, les glycosphingolipides (par exemple, cérémoniebrosides), saccharolipids (par exemple, la glucosamine dérivés), des lipopolysaccharides, et ainsi de suite. Dans la pratique, ces classes de lipides sont peu susceptibles de poser un problème à travailler avec des protéines lipophiles, car ils sont relativement rares, par rapport aux phospholipides beaucoup plus abondante, et donc au-dessous des limites de détection de nos tests. Parce que la plupart des lipides cellulaires susmentionnés sont construits sur hexoses (galactose, le glucose) plutôt que pentoses, ils ne doivent pas gêner le faux-positifs dans les années Bial ou des tests de DISCHE. Monosaccharides libres qui peuvent donner de faux positifs comprennent le fructose, galactofuranose ou furanoses autres. Dans la même veine, l'interférence des sucres non désirées pourrait devenir un problème pour les protéines recombinantes exprimées avec le maltose-binding protein (MBP) tags. Dans la chromatographie d'affinité étapes utilisés pour purifier ces constructions de fusion, le maltose est utilisé pour éluer la protéine, et il est concevable que le maltose résiduel dans les préparations en aval pourraient interférer avec ee Benoît test (il est le plus général / non spécifique des tests, les unités de glucose de maltose ne doit pas réagir sous l'd'Bial ou de Dische). Ainsi, il faudrait faire preuve de prudence dans les étapes de post-chromatographiques afin de s'assurer que le maltose résiduelle n'a pas donné des résultats erronés. Nous n'avons pas testé les protéines ou glycoprotéines glucosylés autres, mais nous pensons qu'il serait difficile d'obtenir un résultat clairement positif pour la présence de sucres sur les protéines de ce type (ou un glycolipide, un protéoglycane, ou glycoconjugués autres) parce que nous nous attendons à ce que les fractions glycanniques serait se situent en dessous de la limite de sensibilité de nos tests. En principe, une solution contenant un aldohexose libres tels que le glucose, libéré d'une protéine glycosylée par hydrolyse acide, seraient positifs par le dosage de l'Benoît, de même, une glycoprotéine dérivée de pentoses, tels que le xylose, devrait donner un résultat positif dans les années Bial dosage. Cependant, dans la pratique, un résultat positif pour les glycoprotéines exigerait extrêmement h concentrations de protéines IGH, même pour des polypeptides glycosylés, se multiplient en raison de la faible teneur en sucre / protéine rapport molaire.

Les protocoles d'essai décrites ici peuvent être étendues et adaptées pour gérer les limites de la taille réduite de l'échantillon - c'est-à-petits volumes ou de faibles concentrations d'analytes. Pour des quantités d'échantillons limités, nous avons constaté que les réactions peuvent être réduites à la plage de 100 ul (par exemple, en utilisant des tubes de PCR et un thermocycleur pour les étapes d'incubation). Pour de petits volumes d'échantillons à des concentrations faibles (près de la limite de détection), un spectrophotomètre équipé d'un lecteur de plaques peuvent être utilisées; dans de tels scénarios, la seule difficulté serait attendu suppression de toute précipitation indésirable avant les mesures d'absorbance. En dépit de la portée de détection limitée de simple inspection visuelle, un avantage de l'approche décrite ici est son efficacité et de rapidité, avec des échantillons susceptibles d'être analysés instantanément lors du chauffage.

»> Applications des protocoles présentés ici incluent l'identification des co-purification des composés, l'évaluation de l'ARN ou de l'ADN, la pureté et la détection de la contamination résiduelle NA ou de sucre dans les échantillons de protéines. Par exemple, NA indésirables détectés par nos tests peuvent être retirés de une préparation de protéine par des moyens chimiques (par exemple, l'hydrolyse alcaline de l'ARN) ou la digestion enzymatique (par exemple, traitement à la nuclease). Bien qu'il existe des approches alternatives à de telles applications, les méthodes décrites ici sont très efficaces en termes de temps et de coûts, et peut donc être facilement intégré dans un workflow expérimentale. L'identification précoce de la co-purification de composés comme sucre réducteur libre, ARN, ADN ou protéines peuvent guider la conception des étapes de purification en aval, par rapport à essai laborieux et études erreur. Une étape commune à la suite de nos protocoles peut être l'isolement de l'ARN à partir d'ADN et de protéines, par l'intermédiaire d'thiocyanate-extraction au phénol-chloroforme, ou récupération de l'ADN alone (en excluant thiocyanate). 20 Pour évaluer la pureté de l'AN résultant de l'extraction au phénol-chloroforme, ces dosages colorimétriques peut être utilisé comme une alternative simple à l'électrophorèse ou traitement à la DNase. De bien des façons et dans d'autres, les dosages colorimétriques décrites ici peuvent être combinées avec des méthodes bien établies pour la détermination des protéines et NA pour obtenir un système rapide et robuste pour élucider l'ARN, d'ADN et de protéines dans des échantillons de composants biomoléculaires hétérogènes.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par l'Université de Virginie et le Jeffress Memorial Trust (J-971). Nous remercions L. Columbus, K. Jain, et P. Randolph pour des discussions utiles et lecture critique du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875
Concentrated HCl VWR BDH3030
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877
Diphenylamine Aldrich 112763
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Ethanol Koptec V1101
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

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References

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Rapid tests colorimétriques de vue qualitatif Distinguer l&#39;ARN et de l&#39;ADN dans les échantillons biomoléculaires
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Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).More

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

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