Summary
वर्णमिति assays के एक सुइट का तेजी से विशिष्ठ प्रोटीन, आरएनए, डीएनए, और संभावित विषम biomolecular नमूने में फिर से ducing शर्करा के लिए वर्णित है.
Introduction
कोशिका जीव विज्ञान के आणविक डीएनए और आरएनए शामिल बातचीत के माध्यम से होता है 4 ये स्वाभाविक रूप से होने वाली न्यूक्लिक एसिड (NAS) एक दूसरे के साथ बातचीत, प्रोटीन, 6 के साथ और vivo में छोटे अणु यौगिकों और ligands के एक मेजबान के साथ 5 (जैसे, द्विसंयोजक फैटायनों ) 7. बातचीत कम या लंबे समय रहते (kinetically) हो सकता है, उच्च से लेकर कम समानता (thermodynamic शक्ति) करने के लिए उदार हो सकता है और भी रासायनिक गुणों और विशिष्टता में काफी भिन्नता प्रदर्शन कर सकते हैं - कुछ संघों काफी विशिष्ट हैं (उदाहरण के लिए, डीएनए · · प्रतिलेखन कारकों, आरएनए · · splicing) कारक है, जबकि अन्य बातचीत जरूरी कहीं अधिक सामान्य हैं (उदाहरण के लिए, डीएनए · · बैक्टीरियल histone तरह HU 8 प्रोटीन). गैर विशिष्ट Nas के साथ बातचीत के लिए इन विट्रो प्रयोगों में व्यावहारिक परिणाम biomo के मिश्रण को शामिल कर सकते हैंlecules, के रूप में यह संभव है, और होने की संभावना भी है, कि कुछ NAS biomolecules की रुचि का साथ सबसेट प्रयोगात्मक शर्तों के प्रयोग किया जा रहा है कुछ (ईओण ताकत, समाधान पीएच, आदि) के तहत कम से कम, सहयोगी होगा.
पर विचार करें, उदाहरण के लिए, Escherichia कोलाई सेल संस्कृति में पुनः संयोजक प्रोटीन के heterologous अभिव्यक्ति के माध्यम से ब्याज (POI) के एक प्रोटीन के उत्पादन, एक ऐसी प्रक्रिया को नियमित रूप से वस्तुतः किसी भी संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में किया जाता है 9 आगे के प्रयोगों के लिए तैयारी में, इस तरह के. जैव रासायनिक / biophysical लक्षण, crystallization, आदि, प्रारंभिक प्रयासों के रूप में आम तौर पर के रूप में संभव के रूप में एक फार्म एक रासायनिक सजातीय और biophysically monodisperse नमूना आदर्श के रूप में शुद्ध, POI की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने पर ध्यान केंद्रित है. मेजबान कोशिकाओं के विघटन के बाद, एक ठेठ शुद्धि कार्यप्रवाह के प्रारंभिक दौर के लिए ई. से POI को अलग करने के लिए लक्ष्य कोलाई प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, कोशिका दीवार के मलबे,और सेलुलर lysate के अन्य घटकों. हालांकि, मेजबान NAS कई भौतिक कारणों के लिए POI के साथ सह को शुद्ध कर सकते हैं - एक अत्यधिक बुनियादी POI गैर विशेष रूप से पुल से नीचे डीएनए मेजबान / आरएनए सकता है; POI एक सामान्य गतिविधि NA बाध्यकारी हो सकता है (उदाहरण के लिए, aforementioned HU); POI एक काफी विशिष्ट NA बाध्यकारी लेकिन मेजबान RNAs या DNAs के साथ पार जेट प्रदर्शनी प्रोटीन हो सकता है, मेजबान Nas एक क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स के साथ बातचीत और जिससे POI के साथ सह - elute बस हो सकता है, और इतने पर. अंधाधुंध, उच्च आत्मीयता मेजबान NAS POI बाध्यकारी एक अप्रिय समस्या खड़ी क्योंकि NA अशुद्धियों की संभावना अनुप्रवाह प्रयोगों (जैसे, प्रतिदीप्ति anisotropy assays POI • शाही सेना बाध्यकारी 10) के साथ हस्तक्षेप करेगा कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, अप्रत्याशित POI · · NA संघों भी अनायास देखा जा सकता है, के रूप में ऐसी बातचीत POI न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता रोशन. किसी भी तरह से, चाहे NAS प्रमुख घटकों या contaminants हैं, एक 1 यों और चाहिए(डीएनए, शाही सेना) अनुप्रवाह प्रयोगों के लिए तैयारी में सह सफ़ाई Nas के प्रकार की पहचान.
कई विश्लेषणात्मक तरीकों का पता लगाने और एक नमूने में Nas quantitating के लिए मौजूद हैं. उपलब्ध तरीकों के अधिकांश मौलिक या तो (उदाहरण के लिए, एक 260 absorbance मूल्यों और एक 260/280 अनुपात) spectrophotometric, fluorometric (जैसे, thiazole नारंगी या NA अन्य फ्लोरोसेंट रंजक के बंधन), या वर्णमिति (nucleosides की रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए संवेदनशीलता कि उपज chromophores विद्युत चुम्बकीय वर्णक्रम के क्षेत्र यूवी तुलना) में अवशोषित, के रूप में हाल ही में De Mey एट अल द्वारा वर्णित है. 1 हालांकि, शाही सेना या डीएनए के रूप में polynucleotide के प्रकार की पहचान के महत्वपूर्ण कदम इन quantitation के कई के दायरे से परे है दृष्टिकोण. यहाँ हम वर्णमिति assays के एक सेट के लिए तेजी से एक प्रोटीनीय नमूना में NA घटकों के प्रकार की पहचान प्रदान करते हैं.
प्रोटोकॉल यहाँ ग वर्णितएक कुशलतापूर्वक संभावित NA अशुद्धियों को अलग करने के अतिरिक्त कदम के बिना क्रियान्वित किया जा, और 11 शक्कर, 12,13 pentoses के लिए orcinol परख, और diphenylamine प्रतिक्रियाओं 14,15 2'-deoxypentoses की (1 आंकड़े और 2) को कम करने के लिए बेनेडिक्ट परख पर भरोसा . बेनेडिक्ट परीक्षण (2a चित्रा) रैखिक, एक aldose चीनी की खुली श्रृंखला फार्म (एल्डिहाइड) +, चीनी कार्बोनिल का सहवर्ती ऑक्सीकरण के साथ एक carboxylate आधा भाग और एक के रूप में उत्पादन घन 2 हे 2 घन को कम करने की क्षमता का इस्तेमाल अघुलनशील लाल तलछट. यह प्रतिक्रिया ऐसे aldoses और ketoses (जो enediol मध्यवर्ती के माध्यम से इसी aldoses कनवर्टर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) के रूप में मुफ्त शर्करा को कम करने के साथ सकारात्मक परीक्षण, लेकिन pentose शर्करा कि चक्रीय रूप में एक डीएनए या शाही सेना polynucleotide के सहसंयोजक रीढ़ की हड्डी के भाग के रूप में बंद कर रहे हैं के साथ नहीं है. Minimalistic एक मुक्त hemiacetal कार्यक्षमता की आवश्यकता है, अन्य सह की वजह सेα-hydroxy mpounds कि इस परख में सकारात्मक परीक्षण कर सकता है - और इसलिए संभावित interferents के रूप में कार्य - ketones और कम oligosaccharides (जैसे disaccharide maltose) शामिल हैं. दोनों Bial orcinol (चित्रा 2b) और Dische diphenylamine प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2c) polynucleotide रीढ़ की हड्डी के प्रारंभिक विनाश पर आधारित हैं, न्यूक्लीओसाइड की depurination और आगे एसिड या माता - पिता के nucleotides के आधार उत्प्रेरित hydrolysis के माध्यम से, उपज furan-2 डेरिवेटिव (furfural) carbaldehyde, इन डेरिवेटिव तो या तो एक (Bial) orcinol या diphenylamine (Dische) अभिकर्मकों के लिए बड़े पैमाने पर अज्ञात रासायनिक संरचना के रंग का संक्षेपण उत्पादों फार्म के रूप में इस तरह के phenol polyhydroxy के साथ प्रतिक्रिया. आरएनए विशिष्टता बनाम Dische परख के डीएनए तथ्य यह है कि pentose 2'-deoxygenated चीनी क्रम में ω hydroxylevulinyl एल्डिहाइड, जो आगे diphenylamine के साथ प्रतिक्रिया करता है ऑक्सीकरण, अतिसंवेदनशील होना चाहिए की वजह से उपजीअम्लीय शर्तों के तहत एक चमकदार नीली घनीभूत (चित्रा 2c) उपज. सुव्यवस्थित यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, हमने पाया है है कि इन चीनी विशिष्ट वर्णमिति प्रतिक्रियाओं शाही सेना और डीएनए के बीच अंतर है, कर सकते हैं और भी ग्लूकोज, fructose, एक biomolecular नमूना में या ribose के रूप में मुफ्त शर्करा को कम करने की उपस्थिति का संकेत होगा.
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Protocol
1. शक्कर को कम करने के लिए बेनेडिक्ट परख
- 940 मिमी निर्जल सोडियम कार्बोनेट, 588 मिमी सोडियम साइट्रेट निर्जलीकरण, 68 मिमी तांबे (द्वितीय) सल्फेट Pentahydrate बेनेडिक्ट अभिकर्मक के एक उपयुक्त मात्रा में तैयार करें. यह अभिकर्मक जेट में कोई उल्लेखनीय बदलाव के साथ कम से कम छह महीनों के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में संग्रहित किया जा सकता है.
- ऊपर अभिकर्मक 6x है. इस प्रकार, 600 μl प्रतिक्रियाओं के लिए, एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (जैसे, Eppendorf ब्रांड) बेनेडिक्ट अभिकर्मक के 100 μl जोड़ने के लिए, प्रति नमूना assayed.
- 10 μl से कहीं भी नमूना इस ट्यूब में 500 μl जोड़ें, इष्टतम मात्रा एक प्रारंभिक परीक्षण चलाने में रंग गठन की तीव्रता के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है. यदि पर्याप्त नमूना उपलब्ध है तो अधिकतम संभव नमूना मात्रा (यानी, समग्र प्रतिक्रिया की मात्रा के पांच sixths, इस मामले में 500 नमूने की μl) में ऐसे परीक्षण शुरू करने के लिए, और फिर बाद में assays में जलमिश्रित.
- तू DDH 2 हे जोड़ेंvortexing या pipetting द्वारा समाधान मिश्रण, 600 μl अंतिम मात्रा लाने हो.
- एक उबलते पानी स्नान में 20 मिनट के लिए नमूने सेते हैं.
- स्नान से गर्म नमूना निकालें और यह आरटी पर 10 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
- अपकेंद्रित्र> +९,३०० नमूना ट्यूब XG (~ एक FA45-24-11 Eppendorf रोटर निर्धारित कोण में 10,000 rpm) क्रम में किसी भी कण सामग्री तलछट 5 मिनट के लिए, इस कदम के बजाय मात्रात्मक गुणात्मक अध्ययन के लिए अधिक महत्वपूर्ण है.
- इस ट्यूब से एक साफ क्युवेट में तैरनेवाला अशेष भाजक.
- पानी के साथ यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर खाली.
- इस नमूने के 475 एनएम पर absorbance उपाय.
2. Bial pentose शुगर्स के लिए Orcinol परख
- ताजा Bial अभिकर्मक के एक उपयुक्त मात्रा में तैयार - 24.2 मिमी orcinol (चित्रा 2b देखने के इस परिसर की संरचना के लिए) monohydrate, 6 एम एचसीएल, 0.025% w / v ferric क्लोराइड hexahydrate नोट:विस्तारित भंडारण के लिए, Bial अभिकर्मक दो अलग - अलग स्टॉक समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है: (i) अभिकर्मक [0.05% w / v FeCl3 • 6H 2 हे केंद्रित एचसीएल में] और (ii) अभिकर्मक बी [422 मिमी orcinol monohydrate 95 में तैयार % इथेनॉल]. एक अभिकर्मक आरटी पर छह महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है, अभिकर्मक बी 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है, पन्नी के साथ कवर प्रकाश जोखिम को सीमित करने के लिए. 1 (बी) v / v उपयोग करने के लिए पूर्व अनुपात: ये शेयर समाधान एक (ए) 15 में मिलाया जाता है.
- ऊपर अभिकर्मक 2x है. इस प्रकार, 1.0 मिलीलीटर प्रतिक्रियाओं के लिए, एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब Bial अभिकर्मक के 500 μl जोड़ने के लिए, प्रति नमूना assayed.
- 10 μl से नमूने के 500 μl कहीं भी इस ट्यूब में जोड़ें. (ऊपर) 1.3 नोट के अनुसार, अगर पर्याप्त नमूना उपलब्ध है तो परीक्षण प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर अधिक से अधिक संभव नमूना मात्रा (यानी आधा, एक समग्र प्रतिक्रिया की मात्रा, इस मामले में 500 नमूने की μl) शुरू और वहाँ से जलमिश्रित.
- ट्यूब DDH 2 हे जोड़ें च लानेinal मात्रा 1.0 मिलीग्राम, vortexing या pipetting द्वारा समाधान मिश्रण.
- एक उबलते पानी स्नान में 20 मिनट के लिए नमूने सेते हैं.
- स्नान से गर्म नमूना निकालें और यह आरटी पर 10 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
- अपकेंद्रित्र> +९,३०० नमूना ट्यूब XG (~ एक FA45-24-11 Eppendorf रोटर निर्धारित कोण में 10,000 rpm) क्रम में किसी भी कण सामग्री तलछट 5 मिनट के लिए, इस कदम के बजाय मात्रात्मक गुणात्मक अध्ययन के लिए अधिक महत्वपूर्ण है.
- दृश्य निरीक्षण के लिए एक साफ क्युवेट में इस ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला अशेष भाजक.
- अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, पानी के साथ रिक्त स्पेक्ट्रोफोटोमीटर यूवी विज़ और 660 एनएम पर क्युवेट नमूना के absorbance उपाय.
3. Dische 2'-deoxypentose शुगर्स के लिए परख Diphenylamine
- 60 मिमी diphenylamine, 11 एम हिमनदों एसिटिक एसिड, 179 मिमी सल्फ्यूरिक एसिड, 62 वी / वी इथेनॉल% Dische diphenylamine अभिकर्मक का एक उपयुक्त मात्रा में तैयार. यह अभिकर्मक पूर्व किया जा सकता हैअग्रिम में मुकाबले और एक अंधेरे कंटेनर में आर टी में संग्रहीत, या पन्नी के साथ कवर किया, प्रकाश जोखिम को सीमित करने के लिए. प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता के कारण अभिकर्मक अनिश्चित काल संग्रहीत नहीं करना चाहिए, हालांकि व्यवहार में यह जेट में कोई स्पष्ट बदलाव के साथ हर दो से तीन महीने में तैयार कर सकते हैं.
- ऊपर अभिकर्मक 2x है. इस प्रकार, 1.0 मिलीलीटर प्रतिक्रियाओं के लिए, एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब Dische अभिकर्मक के 500 μl जोड़ने के लिए, प्रति नमूना assayed.
- 10 μl से नमूने के 500 μl कहीं भी इस ट्यूब में जोड़ें. (ऊपर) 1.3 नोट के अनुसार, अगर पर्याप्त नमूना उपलब्ध है तो परीक्षण प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर अधिक से अधिक संभव नमूना मात्रा (यानी आधा, एक समग्र प्रतिक्रिया की मात्रा, इस मामले में 500 नमूने की μl) शुरू और वहाँ से जलमिश्रित.
- ट्यूब को DDH 2 हे जोड़ें 1.0 मिलीग्राम अंतिम मात्रा में लाने, vortexing या pipetting द्वारा समाधान मिश्रण.
- एक उबलते पानी स्नान में 20 मिनट के लिए नमूने सेते हैं.
- स्नान और allo से गर्म नमूना निकालेंयह डब्ल्यू आरटी पर 10 मिनट के लिए शांत करने के लिए.
- अपकेंद्रित्र> +९,३०० नमूना ट्यूब XG (~ एक FA45-24-11 Eppendorf रोटर निर्धारित कोण में 10,000 rpm) क्रम में किसी भी कण सामग्री तलछट 5 मिनट के लिए, इस कदम के बजाय मात्रात्मक गुणात्मक अध्ययन के लिए अधिक महत्वपूर्ण है.
- दृश्य निरीक्षण के लिए एक साफ क्युवेट में इस ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला अशेष भाजक.
- अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, पानी के साथ रिक्त स्पेक्ट्रोफोटोमीटर यूवी विज़ और 600 एनएम पर क्युवेट नमूना के absorbance उपाय.
4. आगे उपयोग के नोट्स
- अणुओं के बाद कक्षाएं प्रत्येक परख के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए उपयुक्त संदर्भ यौगिकों हैं:
- बेनेडिक्ट - सकारात्मक = मुक्त ribose, fructose, ग्लूकोज, नकारात्मक = शाही सेना, डीएनए, एटीपी, आदि. (किसी भी सैकराइड कमी एक मुक्त चीनी कार्यक्षमता को कम करने के)
- Bial - सकारात्मक = आरएनए (जैसे बेकर की खमीर निकालने), ribose, एटीपी, UMP, नकारात्मक = गोजातीय सेवाओंउम albumin (BSA) या किसी अन्य प्रोटीन
- Dische - सकारात्मक = डीएनए (जैसे बछड़ा थाइमस); नकारात्मक = आरएनए, एटीपी, आदि. (किसी भी गैर 2'-deoxygenated nucleotide)
- इन assays के लिए काफी अक्सर प्रोटीन शुद्धि में इस्तेमाल यौगिकों के लिए लचीला होना पाया गया है, उदाहरण के लिए, NaCl (4 NH) 2 अतः 4, और कश्मीर 2 अतः 4 हस्तक्षेप नहीं किया था के रूप में इस तरह के, आम लवण, और प्रतिक्रियाओं आम तौर से अप्रभावित दिखाई देते हैं तनुकारक (वस्तु) की सामग्री. डिटर्जेंट या यूरिया जैसे chaotropic एजेंट assays के जेट को प्रभावित अगर पीएच अत्यधिक बुनियादी हो सकता है, एक अम्लीय पीएच श्रृंखला के लिए आम तौर पर तटस्थ है अंतर्निहित प्रतिक्रिया रसायन शास्त्र की वजह से सबसे Bial और Dische assays के लिए इष्टतम (पाठ और प्रोटॉन देखें चित्रा 2b, ग) में. संभावित suboptimal प्रतिक्रिया की स्थिति, संदिग्ध interferents, आदि. एक मामले दर मामले के आधार पर परीक्षण किया जाना चाहिए, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों डब्ल्यू का उपयोगith संदर्भ यौगिकों.
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Representative Results
परिणाम ज्ञात संदर्भ यौगिकों के लिए इन वर्णमिति assays के आवेदन के लिए चित्रा 3 में दिखाया जाता है. प्रतिनिधि गुणात्मक डेटा बेनेडिक्ट (एक), Bial orcinol (ख), और Dische diphenylamine assays (ग) के लिए दिखाए जाते हैं, और इन तीन assays के लिए मानक घटता 4 चित्र में दिखाया जाता है. 3 पैनल (एसी) में, बाएँ पैनलों सकारात्मक / नकारात्मक नियंत्रण उपयुक्त प्रतिक्रियाशील / unreactive analytes का उपयोग कर प्रयोगों चलता है, इन दृश्य परिणाम स्वस्थानी में दिखाए जाते हैं, cuvettes में प्रोटोकॉल 1-3 (ऊपर) के रूप में वर्णित है. उप पैनल सही प्रत्येक संबंधित analyte के लिए एक अनुमापन श्रृंखला दिखा. बेनेडिक्ट परख (एक), सकारात्मक नियंत्रण ribose (0.42 मिलीग्राम / एमएल) है, जबकि नकारात्मक नियंत्रण पानी, एक सामान्य प्रोटीन (0.75 मिलीग्राम / एमएल BSA), और दो गैर कम करने (0.75 में शर्करा डीएनए मिलीग्राम / एमएल और आरएनए 12.5 मिलीग्राम / एमएल). Orcinol परख (ख) में सकारात्मक नियंत्रण (0.15 मिलीग्राम / एमएल) ribose, आरएनए (7.5 मिलीग्राम / एमएल) और डीएनए (0.45 मिलीग्राम / एमएल) हैं, जबकि पानी और बी एसएक प्रोटीन (0.45 मिलीग्राम / एमएल) नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं. Diphenylamine परख में (ग), बछड़ा थाइमस डीएनए (0.45 मिलीग्राम / एमएल) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है, और पानी, खमीर निकालने (7.5 मिलीग्राम / एमएल) शाही सेना, ribose (0.15 मिलीग्राम / एमएल), और BSA (0.45 मिलीग्राम / एमएल) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. डीएनए के दो सांद्रता छोड़ दिया दो नमूनों में एक सकारात्मक नियंत्रण (1-2 cuvettes), डीएनए + आरएनए मिश्रण के रूप में दिखाए जाते हैं (: अंत में, पैनल (घ) बदलती विजातिता के नमूनों के साथ है Dische प्रतिक्रिया दिखा कर assays की मजबूती को दिखाता है विभिन्न अनुपात में) अगले तीन नमूने (3-5) में दिखाया गया है, और अंतिम तीन नमूने (6 नमूना) या उपस्थिति (7-8 नमूने) न्यूक्लिक एसिड बंधनकारी प्रोटीन 'Hfq' के अभाव में डीएनए को दर्शाते हैं. 16 नोट कि Dische परख के सकारात्मक परिणाम के लिए संरक्षित है डीएनए युक्त 'contaminating' शाही सेना या प्रोटीन की उपस्थिति में भी नमूने.
मात्रात्मक विश्लेषण: चित्रा 3 में कमजोर पड़ने पर्वतमाला (एसी) पैनलों भिन्न प्रत्येक क्योंकिप्रतिक्रिया एक अलग दृश्य सीमा का पता लगाने के चीनी assayed किया जा रहा है के प्रकार पर निर्भर करता है. Spectrophotometric दृश्य के बजाय, पता लगाने के माप पर्वतमाला, उदाहरण के रूप में (एक) बेनेडिक्ट के लिए 4 चित्र में दिखाया गया है, (ख) Bial है, और (ग) है Dische assays में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि मुख्य रूप से गुणात्मक assays के रूप में यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का इरादा कर रहे हैं, absorbance और एकाग्रता के बीच संबंध बीयर Lambert कम से कम चीनी या न्यूक्लिक एसिड सामग्री की अर्द्ध मात्रात्मक आकलन के लिए सक्षम बनाता है. बेनेडिक्ट परीक्षण के अंशांकन के लिए एक मानक वक्र के एक उदाहरण के रूप में, absorbance के एक रेखीय प्रतिगमन ribose एकाग्रता के खिलाफ (475 एनएम) फिट चित्रा 4 (क) में दिखाया गया है, त्रुटि पट्टियाँ n के मानक विचलन, 3 = replicates और संकेत चुकता सहसंबंध गुणांक प्रदान की जाती है. बहुत कम ribose सांद्रता (जैसे 0.28 मिमी गृहीत) linearity से विचलन इस परख के सीमित संवेदनशीलता को दर्शाता है. हालांकि के रूप मेंकहते हैं, मुख्य रूप से गुणात्मक अध्ययन के लिए इरादा कर रहे हैं, निम्नलिखित निर्देशों अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सुझाव दिया जाता है:
- बेनेडिक्ट (4a चित्रा) परख: प्रतिक्रिया readout (475nm ए) के लिए कम से कम 0.04 सीमा से अधिक रैखिक हो पाया था → 0.5 मिलीग्राम / एमएल analyte, के रूप में तीन प्रतियों में प्रदर्शन.
- 0 सीमा से अधिक कम से कम है Bial (4b चित्रा) परख: absorbance डेटा (एक 660nm) रैखिक थे → 0.5 मिलीग्राम / एमएल analyte (बेकर की खमीर आरएनए), परख तीन प्रतियों (नि. 2 = 0.99 रेखीय प्रतिगमन में किया गया प्रदर्शन होने ) गुणांक. हालांकि नमूने absorbance मापन से पहले स्पष्टीकरण के लिए centrifuged थे, कोई तेज़ analyte के इन कम मात्रा में पाया गया था और इसलिए centrifugation कदम सख्ती से आवश्यक नहीं था. परख इस सीमा से परे analyte सांद्रता में linearity से भटक.
- एक 600nm: Dische (चित्रा 4C) परख के लिए 2 = 0.99) तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया है रेखीय हो पाया था. absorbance की साजिश बनाम [analyte] 0.90 मिलीग्राम / एमएल डीएनए में पठार करने के लिए शुरू किया, रेखीय प्रतिक्रिया क्षेत्र की सीमा का संकेत है.
- मात्रात्मक या अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए व्यावहारिक दृष्टिकोण: उपजी सामग्री है कि अन्यथा absorbance रीडिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा हटाने, सभी तीन assays समय की उचित लंबाई (25,000 XG, या जो कुछ भी सीमा microfuge ट्यूब से झेल किया जा सकता है) के लिए अधिकतम गति पर centrifugation की आवश्यकता (उदाहरण के लिए, 20 मिनट), यह उच्च analyte सांद्रता में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. Centrifugation के बाद, स्पष्ट नमूने एक क्युवेट या microplate के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है सुविधाजनक absorbance के मापन के लिए (जैसे, 96-अच्छी तरह प्लेटें microtiter).
चित्रा 1. Assays के आवेदन के लिए निर्णय के पेड़. Biomolecules (उदाहरण के लिए, पूरे सेल lysates से) के एक संभावित नमूना विषम के साथ शुरू, वर्णमिति यहाँ वर्णित assays के लिए निर्धारित करती है कि गैर कम करने मिश्रण शर्करा (बेनेडिक्ट परीक्षण) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि हां, तो है Bial orcinol परीक्षण आगे पता चलता है कि गैर को कम शक्कर की आबादी pentose (डीएनए या शाही सेना के रूप में), अंगूठियां, बनाम hexoses (जैसे, ग्लूकोज, अन्य pyranoses) और संभवतः अभी तक अन्य aldoses हैं. अंत में, अगर नमूना डीएनए के कम से कम एक उदारवादी अंश होता है तो अंगूठी 2'-deoxyribose (अम्लीकरण और हीटिंग पर) Dische diphenylamine अभिकर्मक के साथ प्रतिक्रिया दिख नीला संक्षेपण उत्पाद उपज जाएगा. ध्यान दें कि इस चित्र में एक निर्णय है, एक प्रवाह संचित्र पेड़ नहीं है: परख परिणामों के तर्क दिखाया गया हैerially, लेकिन assays समानांतर में क्रियान्वित किया जा सकता है.
चित्रा 2. Detectable रंग इसी प्रतिक्रियाओं के साथ - साथ संकेत उत्पाद के साथ अंतर्निहित रासायनिक प्रतिक्रियाओं वर्णमिति assays के लिए दिखाया जाता है. (क) एक अघुलनशील, घन 2 हे लाल तलछट शर्करा को कम करने के लिए बेनेडिक्ट परख के सकारात्मक परिणाम है. (ख) हीटिंग और अम्लीकरण पर pentose शर्करा युक्त छल्ले furfural (Bial अभिकर्मक), जो तब orcinol के साथ प्रतिक्रिया करता है विघटित करने एक घुलनशील नीले, हरे adduct उपज जाएगा. में है Dische परख, '2 की स्थिति में एक हाइड्रॉक्सिल substituent की कमी एक ऑक्सीकरण अंगूठी का उद्घाटन प्रतिक्रिया एल्डिहाइड उत्पाद है जिनमें से आगे diphenylamine के साथ प्रतिक्रिया करता है के लिए सक्षम बनाता है [(पीएचडी) राष्ट्रीय राजमार्ग 2] एक चमकदार नीली उत्पाद उपज. रासायनिक सेंटructures बड़े, बहु अंगूठी orcinol (ख) और diphenylamine प्रतिक्रियाओं (ग) का संक्षेपण उत्पादों के लिए अनजान रहते हैं.
चित्रा 3. वर्णमिति assays के संदर्भ यौगिकों और विषम के नमूने के लिए आवेदन नमूना परिणाम बेनेडिक्ट (एक), Bial (ख) और (ग) Dische वर्णमिति assays के लिए दिखाए जाते हैं. (एक) → (ग) में, बाईं उप पैनल सकारात्मक / नकारात्मक उपयुक्त प्रतिक्रियाशील / unreactive analytes और सही उप पैनल का उपयोग नियंत्रण दिखाने प्रत्येक analyte के लिए एक अनुमापन श्रृंखला दिखा. इसके अलावा है Dische प्रतिक्रियाओं के एक निदर्शी पैनल दिखाया गया है (घ) जिसमें analyte विजातिता में बदलता है (या तो डीएनए (बाएं) अकेले, भिन्न अनुपात (मध्य) के डीएनए / आरएनए मिश्रण, या न्यूक्लिक एसिड जुड़े प्रोटीन की उपस्थिति में डीएनए 'Hfq'). इन पैनलोंआगे पाठ के प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित हैं.
चित्रा 4. संदर्भ यौगिकों के साथ assays से मानक घटता अंशांकन घटता. बेनेडिक्ट के लिए दिखाए जाते हैं (एक), Bial (ख), और Dische assays (ग), प्रत्येक परख के लिए रेखीय प्रतिक्रिया क्षेत्र के एक प्रतिनिधि भाग चित्रण. रेखीय प्रतिगमन फिट बैठता है और इसी सहसंबंध गुणांक प्रत्येक परख के लिए संकेत कर रहे हैं. स्टैंडर्ड बेकर की खमीर (ख) शाही सेना और बछड़ा थाइमस डीएनए (ग) इन अनुमापन श्रृंखला में analytes थे. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
वर्णमिति assays यहाँ प्रस्तुत एक सरल दृष्टिकोण की पेशकश करने के लिए तेजी से सामना करना पड़ा जब प्रोटीन RNAs, या आगे के अध्ययन के लिए तैयारी में पूरे सेल lysate से परिसरों सफ़ाई के रूप में biomolecular मिश्रण की रासायनिक प्रकृति का आकलन. संरचनात्मक जीव विज्ञान के रूप में अधिक देशी की तरह विधानसभाओं, नमूना विजातिता के रूप में उत्तरोत्तर अधिक से अधिक चुनौतियों, कर्मों को, जटिल और बहु घटक परिसरों द्वारा उत्पन्न किया जाएगा. Supramolecular विधानसभाओं अक्सर केवल मामूली स्थिर है, और उनके सफल अलगाव कम कठोर शुद्धि की स्थिति की मांग कर सकते हैं (जैसे, रूप में spliceosomal snRNP 17,18 परिसरों के लिए पाया). इस तरह के मामूली शर्तों के तहत दोनों प्रामाणिक और नकली POI · · NA बातचीत को और अधिक करने के लिए जारी रहती है और इस तरह हस्तक्षेप अनुप्रवाह assays में एक लक्ष्य प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड के साथ होने की संभावना हैं. एक आवश्यक पहला कदम इन नमूनों में रासायनिक घटकों के प्रकार की पहचान है.
ve_content "> आरएनए, डीएनए और प्रोटीन का पता लगाने के तरीके मात्रा और analytes, उपलब्ध संसाधनों और समय की कमी की एकाग्रता पर निर्भर करता है अलग अलग और, शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, एक analytes की संभावना रासायनिक संरचना के बारे में पूर्व ज्ञान प्रोटीनीय सामग्री से पता लगाया जा सकता है उन है कि स्पेक्ट्रोस्कोपी (280 ए), सहित कई अच्छी तरह से स्थापित विधियों, hydrodynamic (जेल वैद्युतकणसंचलन), रासायनिक / वर्णमिति 19 (जैसे, पेप्टाइड बांड के लिए बाईयूरेट टेस्ट) और, महान संवेदनशीलता और सटीकता के साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से इसी तरह NAS, उदाहरण के लिए, (260 ए) स्पेक्ट्रोस्कोपी, fluorometric, या रासायनिक assays (यहाँ वर्णित) के द्वारा पाया जा सकता है विधि के प्रत्येक प्रकार के लक्षण शक्तियों और कमजोरियों. PicoGreen, SYBR गोल्ड, और अन्य cyanine आधारित फ्लोरोसेंट रंजक काफी के प्रति संवेदनशील हैं न्यूक्लिक एसिड वर्णमिति assays परे (परिमाण के कई आदेशों), चयनात्मकता के विभिन्न डिग्री प्रदर्शन (जैसे, PicoGreen डबल असहाय डीएनए के लिए, SYBR गोल्ड NAS सबसे) बांधता है, और भी quantitation प्रयोजनों के लिए एक व्यापक गतिशील पर्वतमाला की सुविधा. हालांकि, इन तरीकों सीमा के बिना नहीं कर रहे हैं रंजक पता लगाने (जैल बैच के नमूने के लिए spectrofluorometers लिए transilluminators) के लिए और अधिक उन्नत उपकरण की आवश्यकता होती है, बनाम वर्णमिति assays के साधारण दृश्य readout, रंजक उत्परिवर्तजन, ethidium ब्रोमाइड जैसा के रूप में इलाज कर रहे हैं, और वहाँ परख शर्तों पर प्रतिबंध (> 200 मिमी NaCl एक PicoGreen संकेत तीव्रता के 30% की कमी जैसे, SYBR गोल्ड के लिए एक 7-8.5 की सिफारिश की पीएच रेंज) कर रहे हैं. इस प्रकार, वर्णमिति और प्रतिदीप्ति आधारित assays पूरक हैं: न्यूक्लिक एसिड रंजक तेजी से वर्णमिति assays के साथ नकारात्मक परिणामों के मामले में विशेष रूप से, या अधिक ध्यान करने के लिए एक तरह से (मात्रात्मक) वर्णमिति assays से प्रारंभिक परिणामों पर विस्तार के रूप में उपयोगी हो सकता है. वर्णमिति NA प्रोटोकॉल की एक मौलिक लाभ, उपयोग की सादगी के अलावा में है कि वे आंतरिक सह पर पूरी तरह भरोसाNAS की valent संरचना fold/3D संरचनाओं, reactivities, या biopolymer कि अनुक्रम के साथ भिन्न हो सकता है की किसी भी अन्य गुण के बजाय.प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित अधिकांश कठिनाइयों के खिलाफ मजबूत कर रहे हैं, विशेष रूप से जब प्रतिक्रिया उत्पादों के साधारण दृश्य निरीक्षण के साथ प्रदर्शन किया, विशेष देखभाल अधिक मात्रात्मक (spectrophotometric) विश्लेषण के लिए लिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, बेनेडिक्ट परख में लाल (पीपीटी) तेज़ है कि ribose के उच्च सांद्रता की उपस्थिति में रूपों spectrophotometric विश्लेषण करने से पहले हटा दिया जाना चाहिए, इस centrifugation के माध्यम से आसानी से हासिल की है. के लिए Dische परख, diphenylamine अभिकर्मक के अलावा एक सफेद ppt कि हीटिंग द्वारा solubilized किया जा सकता है के गठन के साथ है, एक हरे रंग की ppt कि डीएनए की उपस्थिति में रूपों spectrophotometric माप के साथ हस्तक्षेप और मात्रात्मक विश्लेषण करने से पहले हटा दिया जाना चाहिए. इसके अलावा, प्रत्येक परख रासायनिक प्रतिक्रियाओं है कि अतिसंवेदनशील होते हैं पर आधारित हैसंभावित interferents, के रूप में परिचय में उल्लेख किया है और आगे नीचे विस्तृत. अंत में, हम ध्यान दें कि एक डीएनए / आरएनए मिश्रण में एक उच्च शाही सेना के रिश्तेदार एकाग्रता Dische परख के सकारात्मक परिणाम की उम्मीद कर सकते हैं मुखौटा, डीएनए के लिए इस झूठी नकारात्मक तथ्य यह है कि शाही सेना के एक उच्च तिल अंश भी प्रति प्रतिक्रिया करता है की वजह से उपजी furfural मध्यवर्ती के माध्यम से, साथ Dische अभिकर्मकों, लेकिन नीले 2'-deoxypentose डीएनए की चीनी के साथ प्रतिक्रिया द्वारा उत्पादित adduct बजाय एक बेरंग उत्पाद पैदावार.
संभावित Interferents: शर्करा, lipids, और प्रोटीन के स्पष्ट मामले के अलावा दो अन्य biomolecules कि hypothetically इन वर्णमिति (झूठी सकारात्मक) पार जेट या नकाबपोश जेट (झूठी नकारात्मक) के कारण assays के साथ परेशानी का कारण हो सकता है कर रहे हैं. सिद्धांत रूप में, सेलुलर lipids के कई प्रकार के क़यास glycosylglycerols और अन्य glycerolipids शर्करा को संयुग्मित, glycosphingolipids (जैसे, सेरे सहित हस्तक्षेप, सकता है) brosides, (जैसे, glucosamine डेरिवेटिव) saccharolipids, lipopolysaccharides, और इतने पर. अभ्यास में, lipids के इन वर्गों lipophilic प्रोटीन के साथ काम करने में एक समस्या खड़ी की उम्मीद नहीं कर रहे हैं क्योंकि वे अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं, की तुलना में बहुत अधिक प्रचुर मात्रा में phospholipids, और इसलिए हमारे assays की सीमा का पता लगाने के नीचे. Aforementioned सेलुलर lipids की सबसे क्योंकि pentoses बजाय hexoses (galactose, ग्लूकोज) पर निर्माण कर रहे हैं, वे है Bial है या Dische assays में झूठी सकारात्मक रूप में हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए. मुफ्त monosaccharides है कि झूठी सकारात्मक दे सकता है, fructose galactofuranose, या अन्य furanoses शामिल हैं. एक संबंधित नोट पर, अवांछित शर्करा से हस्तक्षेप रीकॉम्बीनैंट maltose बाध्यकारी प्रोटीन टैग (MBP) के साथ व्यक्त प्रोटीन के लिए एक मुद्दा बन सकता है. एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी में ऐसे संलयन constructs को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया कदम, maltose के लिए प्रोटीन elute करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह कल्पना है कि नीचे की ओर तैयारी में अवशिष्ट maltose वें के साथ हस्तक्षेप कर सकता हैई बेनेडिक्ट परख (यह सबसे सामान्य / assays के nonspecific है, maltose की ग्लूकोज इकाइयों है Bial या Dische तहत प्रतिक्रिया नहीं चाहिए). इस प्रकार, एक के बाद chromatographic कदम में सावधानी बरतने के लिए बीमा है कि अवशिष्ट maltose नकली परिणाम उपज नहीं करना होगा. हम glucosylated प्रोटीन या अन्य glycoproteins परीक्षण नहीं किया है, लेकिन हम संदेह है कि यह ऐसे प्रोटीन (या glycolipid, proteoglycan, या अन्य glycoconjugates) पर शर्करा की उपस्थिति के लिए एक स्पष्ट सकारात्मक परिणाम प्राप्त करना कठिन होगा क्योंकि हम उम्मीद करते हैं कि glycan moieties हमारे assays की संवेदनशीलता की सीमा के नीचे झूठ बोलते हैं. सिद्धांत रूप में, एक ग्लूकोज के रूप में एक नि: शुल्क aldohexose युक्त समाधान, एसिड hydrolysis के माध्यम से एक glucosylated प्रोटीन से मुक्त, बेनेडिक्ट परख द्वारा सकारात्मक परीक्षण होगा, इसी तरह, सिलोज़ के रूप में इस तरह के एक glycoprotein व्युत्पन्न pentose,, Bial में एक सकारात्मक परिणाम उपज चाहिए परख. हालाँकि, व्यवहार में glycoproteins के लिए एक सकारात्मक परिणाम बहुत ज की आवश्यकता होगी igh गुणा ग्लाइकोसिलेटेड polypeptides के लिए भी प्रोटीन सांद्रता कम / चीनी प्रोटीन दाढ़ अनुपात की वजह से है.
परख यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल और बढ़ाया जा सकता है छोटा सा नमूना आकार की सीमा को संभालने के लिए अनुकूलित - यानी, छोटी मात्रा या analytes की कम सांद्रता. हम सीमित नमूना मात्रा के लिए मिल गया है कि प्रतिक्रियाओं रेंज 100 μl नीचे पहुंचा सकता है (उदाहरण के लिए, पीसीआर ट्यूब और ऊष्मायन चरणों के लिए एक thermocycler का उपयोग). कम सांद्रता (पता लगाने की सीमा के निकट) में छोटी मात्रा के नमूने के लिए एक एक थाली पाठक के साथ सुसज्जित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर इस्तेमाल किया जा सकता है, ऐसी स्थितियों में, केवल प्रत्याशित कठिनाई किसी भी अवांछित अवक्षेपक के हटाने absorbance मापन से पहले होगा. साधारण दृश्य निरीक्षण के सीमित सीमा का पता लगाने के बावजूद, यहाँ वर्णित दृष्टिकोण का एक लाभ अपनी दक्षता और तेज़ी के हीटिंग पर तुरन्त विश्लेषण करने में सक्षम नमूनों के साथ है.
"प्रोटोकॉल के आवेदन सह शुद्ध यौगिकों, शाही सेना या डीएनए शुद्धता के मूल्यांकन, और अवशिष्ट NA या प्रोटीन के नमूने में चीनी संदूषण का पता लगाने की पहचान शामिल यहाँ प्रस्तुत उदाहरण के लिए, हमारे assays द्वारा अवांछित पाया एनए से हटाया जा सकता है. रासायनिक (उदाहरण के लिए, शाही सेना के alkaline hydrolysis) का मतलब है या enzymatic पाचन (जैसे, nuclease उपचार) के माध्यम से एक प्रोटीन तैयार करने का. हालांकि वहाँ इस तरह के आवेदन पत्र के लिए वैकल्पिक तरीकों, यहाँ वर्णित विधियों में दोनों समय और लागत के मामले में अत्यधिक कुशल हैं, और कर सकते हैं इसलिए आसानी से एक प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह में एकीकृत किया जा मुक्त चीनी को कम करने, शाही सेना, डीएनए, या प्रोटीन के रूप में सह शुद्ध यौगिकों की जल्दी पहचान. अनुप्रवाह शोधन कदम के डिजाइन, बनाम श्रमसाध्य परीक्षण और त्रुटि के अध्ययन मार्गदर्शन कर सकते हैं. हमारे प्रोटोकॉल के बाद एक आम कदम डीएनए और प्रोटीन से आरएनए के अलगाव thiocyanate phenol के क्लोरोफॉर्म निकासी, या डीएनए alon की वसूली के माध्यम से हो सकता है,(thiocyanate छोड़कर) ई 20. phenol के क्लोरोफॉर्म extractions से उत्पन्न NAS की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए, इन वर्णमिति assays वैद्युतकणसंचलन या DNase उपचार के लिए एक आसान विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस और अन्य मायनों में, यहाँ वर्णित वर्णमिति assays प्रोटीन और ना विषम biomolecular नमूनों में शाही सेना, डीएनए और प्रोटीन घटक elucidating के लिए एक तेजी से और मजबूत प्रणाली को प्राप्त करने के लिए दृढ़ संकल्प के लिए अच्छी तरह से स्थापित विधियों के साथ जोड़ा जा सकता है है.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम वर्जीनिया विश्वविद्यालय और Jeffress मेमोरियल ट्रस्ट (जे 971) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम उपयोगी विचार - विमर्श और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एल कोलंबस, लालकृष्ण जैन और पी. Randolph धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous sodium carbonate | Fisher Scientific | S263 | |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | S-4641 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | VWR | VW3312-2 | |
| Orcinol monohydrate | Sigma-Aldrich | O1875 | |
| Concentrated HCl | VWR | BDH3030 | |
| Ferric chloride hexahydrate | Sigma | F-2877 | |
| Diphenylamine | Aldrich | 112763 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A28 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Ribose | Sigma | R-7500 | prep at 1% w/v in H2O |
| Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) | Sigma | R6750 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C |
| Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus | Sigma | D1501 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C |
| Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety. |
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References
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