Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

doi: 10.3791/50225 Published: February 4, 2013

Summary

Kolorimetrik tahlillerin paketi hızla ayırt edici protein, RNA, DNA, ve potansiyel olarak heterojen biyomoleküler örneklerinde yeniden ducing şekerler için açıklanmıştır.

Abstract

Biyokimyasal deneyler genellikle potansiyel olarak heterojen örneklerde doğru nükleik asit erken bir aşamada bilgi,,, protein ve diğer biyomoleküler bileşenleri gerektirir. Nükleik asitler kolayca ayırt edemez rağmen (örneğin, A 260), florometrik (örneğin, floresan boya bağlayıcı), veya kolorimetrik (nükleozid özel kromojenik kimyasal reaksiyonlar). 1 spektrofotometrik olarak analitik yöntemler de dahil olmak üzere birçok yerleşik yaklaşımları ile tespit edilebilir RNA DNA, A 260 de 260 nm ve öncelikle 280 nm civarındaki emer protein yakınındaki ağırlıklı emer nükleik asit, göreli içeriğinin basit ve hızlı 2 değerlendirme sunuyor / A 280 oranı genellikle istihdam edilmektedir. 1.5 3 Rasyolar <saf nükleik asit (NA) oranları ile karakterize iken 0,8, 'saf' protein örneklerinin göstergesi olarak alınır>.

HoWever, protein / NA içerik olarak açıkça veya güvenilir basit uv-vis spektrofotometrik ölçümler anlaşılan olamaz hangi senaryo vardır. Örneğin, (i) örnek olarak, bazı küçük RNA-bağlayıcı protein ile olduğu gibi, ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) de emilim için sorumlu aromatik amino asitler nispeten yoksun olan bir tane ya da daha fazla protein içerir, ve edebilir (ii) numuneleri protein / NA içeriği çok daha az açıktır ve hatta protein ve NA bileşenleri arasındaki bazı yüksek afinite dernek yansıtabilir ara A 260 / A 280 oranları (~ 0.8 <~ 1.5), sergileyebilmektedir. Bu tür senaryolar için, biz hızla RNA, DNA ve biyomoleküllerin potansiyel karışık örnek indirgen şekerler ayırt etmek için burada kolorimetrik testlerin bir paketi açıklamak. Yöntemler Benedict'in için pentozlara ve diğer karbonhidratların diferansiyel duyarlılığı güveniyor, Bial (orcinol) ve Dische nin (diphenylamine) reaktifler; aerodinamik protokolleri com olabilirmaddeleri ayırmak zorunda herhangi bir ek adıma gerek kalmadan, birkaç dakika içinde pleted. Deneyleri de, RNA ve DNA arasındaki farkı olarak, glikoz, früktoz, riboz ve (Şekil 1) gibi serbest indirgeyici şekerler arasında varlığını belirtir paralel olarak gerçekleştirilebilmektedir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Much hücre biyolojisi DNA ve RNA içeren moleküler etkileşimler aracılığıyla gerçekleşir. 4 Bunlar doğal olarak oluşan nükleik asitler (UA) (örneğin, iki değerlikli katyonlar proteinler, 6 ve in vivo küçük molekül bileşiklerinin ve ligandların bir ev sahibi ile, birbiri ile etkileşim 5 7). Etkileşimler olabilir kısa veya (kinetik) uzun ömürlü, düşük afinitesi (termodinamik dayanım) orta yüksek değişebilir, hem de kimyasal özellikleri ve özgüllüğünü önemli çeşitlilik gösterebilmesidir - bazı dernekler (örneğin, DNA oldukça özeldir · · transkripsiyon faktörleri, RNA · · · yapıştırma faktörler), diğer etkileşimleri mutlaka çok daha genel ise (örneğin, DNA · · · bakteriyel histon benzeri HU proteinler 8). UA ile Non-spesifik etkileşimler biomo karışımları içeren in vitro deneylerde pratik sonuçları olabilirlecules, bazı UA, en azından kullanılan deneysel koşullar gibi bir kısmını (iyonik kuvvet, çözeltinin pH, vs) altında, ilgi biyomolekülleri ile ilişkilendirir, mümkünse, ve hatta büyük bir olasılıktır.

Escherichia coli hücre kültüründe yeniden birleştirici proteinin heterolog aşırı ekspresyonu vasıtasıyla, örneğin, ilgi (PI) bir proteinin üretimi düşünün, bu tür bir prosedür rutin olarak hemen hemen herhangi bir yapısal biyolojide laboratuvar gerçekleştirilir 9 başka deneyler için hazırlanırken, bu gibi. / biyokimyasal karakterizasyonu biyofiziksel, kristalizasyon, vb., ilk çabalar genellikle ideal olarak, kimyasal olarak homojen ve biyofiziksel monodisperse örnek olarak, mümkün olduğunca saf bir formda olarak da POI yeterli bir miktar elde edilmesi ile ilgili odak gibi. Konak hücre bozulması sonra, tipik bir arıtma akışı erken evrelerinde E. POI izole etmek için amaç coli proteinler, nükleik asitler, hücre duvarı enkaz,ve hücre lizat diğer bileşenler. Ancak konak UA'lar birçok fizikokimyasal nedenlerle POI ile birlikte arındırmak olabilir - çok temel bir İÇN non-spesifik olarak açılan konak DNA / RNA olabilir; POI (örneğin, yukarıda belirtilen HU) genel NA-bağlanma aktivitesi olabilir; POI konak RNA veya DNA ile oldukça spesifik NA-bağlayıcı protein ancak sergi çapraz reaktivite olabilir; böylece ve; ana UA'lar bir kromatografi matris ile etkileşim ve böylece sadece co-elute POI olabilir. NA safsızlıklar olasılıkla mansap deneyler (örneğin, POI • RNA bağlayıcı 10 floresans anizotropi testleri) ile müdahale edecek, çünkü bir İÇN'ye konak UA'lar ayrım gözetmeksizin, yüksek afiniteli bir can sıkıcı sorun teşkil edebilir. Bu tür etkileşimlerin POI nükleik asit bağlama kapasitesi aydınlatmak Alternatif olarak, beklenmeyen POI · · · NA dernekleri de, tesadüfen görülebilir. Her iki şekilde de, UA'lar anahtar bileşenleri veya kirletici olup olmadığını, bir ilk ölçmek gerekir veakış deneyler için hazırlık içinde eş-arındırıcı NAS tipi (DNA, RNA) tanımlar.

Çeşitli analitik yöntemler tespit ve bir örnek UA'lar miktarlarının yapılmamış. Mevcut yöntemlerin çoğu (temelde ya (örneğin, tiazol portakal veya NA diğer floresan boya bağlayıcı) florometrik, (örneğin, A 260 absorbans değerleri ve A 260 / A 280 oranları) spektrofotometrik veya kolorimetrik olarak kimyasal reaksiyonlara nükleosidlerin duyarlılık elektromanyetik spektrumun UV-vis bölge) emici verim kromofor olarak son zamanlarda De Mey ve ark tarif. 1 Ancak, RNA veya DNA gibi polinükleotid türünü tanımlamanın önemli adım bu kantitatif çoğunun kapsamı dışındadır yaklaşımlar. Burada hızlı bir protein örnek NA bileşenlerin türleri belirlemek için kolorimetrik analizler kümesi sağlar.

Protokoller burada c açıklananverimli bir potansiyel NA safsızlıkların izole ek adımlar yürütülür, ve (Şekiller 1 ve 2) 2'-deoxypentoses arasında şekerler 11, 12,13 pentozlara için orcinol tahlil, difenilamin ve reaksiyon 14,15 azaltılması için Benedict'in tahlil dayanmak edilmesi . Benedict'in testi (Şekil 2a) +, şeker en karbonil birlikte oksidasyon ile olduğu gibi Cu 2 O-, bir karboksilat parçası ve üretim için Cu 2 azaltmak için bir aldoz şeker doğrusal, açık-zincirli (aldehit) formu yeteneği kullanır çözünmeyen kırmızı çökelti. Bu reaksiyon gibi aldoses ve ketoses (hangi enediol ara ile ilgili aldoses dönüştürmek) gibi ücretsiz indirgen şekerler ile pozitif test değil, bir DNA veya RNA polinükleotid arasında kovalent omurga parçası olarak siklik forma kilitli olduğundan pentoz şeker ile. Olacak Bir serbest hemiasetal işlevsellik minimalist gereksinimi, diğer ortak nedeniyleve bu nedenle potansiyel interferents olarak hareket - - Bu testte pozitif test edebilir mpounds α-hidroksi-ketonlar ve kısa oligosakkaritler (örn. disakkarit maltoz) içerir. Her iki Bial orcinol (Şekil 2b) ve Dische en difenilamin (Şekil 2c) reaksiyon polinükleotid omurga başlangıç ​​imha dayanır, nükleosid depurination ve daha fazla asit ya da ebeveyn nükleotidlerin baz-katalizörlü hidroliz yolu ile, furan-2 vermek üzere -karbaldehid (furfural) türevleri, bu türevleri daha sonra bu orcinol (Bial) ya da difenilamin (Dische) 'ın tam olarak bilinmemektedir kimyasal yapısının renkli yoğunlaşma ürünleri oluşturmak için reaktifler olarak fenol ya da bir polihidroksi ile reaksiyona girer. Dische en tahlil RNA özgüllüğü karşı DNA pentoz şeker daha diphenylamine ile reaksiyona ω-hydroxylevulinyl aldehit, oksidasyon duyarlı olmak amacıyla 2'-deoksijenlenmedeki olmalıdır gerçeğinden kaynaklanmaktadırasidik koşullar altında bir parlak mavi bir yoğuşma (Şekil 2c) elde edildi. Burada tarif edilen aerodinamik protokolleri kullanılarak bu şeker özgü kolorimetrik reaksiyon, RNA ve DNA arasındaki farkı olabilir ve ayrıca bu tür bir biyomoleküler örnek olarak glikoz, früktoz, riboz ya da serbest gibi indirgeyici şekerler varlığını gösterir olduğunu bulduk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Şekerler Azaltılması Benedict Testi

  1. 940 mM susuz sodyum karbonat, 588 mM sodyum sitrat dihidrat, 68 mM bakır (II) sülfat pentahidrat - Benedict'in reaktif uygun bir miktar hazırlayın. Bu reaktif tepkime içinde değişiklik fark ile, en az altı ay boyunca oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.
  2. Yukarıdaki reaktif 6x olduğunu. Örnek test edilecek başına Böylece, 600 ul reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü (örn., Eppendorf marka) ile Benedict'in reaktif 100 ul ilave edin.
  3. 10 ul bu tüpüne örnek 500 ul yere ekleyin; optimum ses bir ilk deneme vadede renk oluşumu yoğunluğuna göre tespit edilebilir. Yeterli numune mevcut ise, daha sonraki deneylerde daha sonra seyreltik maksimum olası örnek hacmi (yani, toplam reaksiyon hacmi beş-sixths, bu durumda, örnek 500 ul) bu tür denemeler başlar, ve.
  4. Tu için GKD 2 O ekleyinvorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak; 600 ul son hacim getirmek olacak.
  5. Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin.
  6. Banyosundan ısıtmalı örnek çıkarın ve 10 dakika oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
  7. > 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir.
  8. Temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant.
  9. Su ile uv-vis spektrofotometre Boşluk.
  10. 475 nm'de Bu örnek absorbansları ölçülür.

2. Pentoz şekerler için Bial Orcinol Assay

  1. . Taze Bial reaktif uygun bir miktar hazırlayın - 24.2 mM orcinol monohidrat (bu bileşiğin yapısı için bakınız Şekil 2b), 6 M HCl ile% 0.025 w / v demir klorür hekzahidrat Not:Uzun süreli depolama için, Bial reaktif iki ayrı stok solüsyonlar olarak hazırlanabilir: (i) Reaktif A [konsantre HCI içinde% 0.05 w / v FeCl3 • 6H 2 O] ve (ii) Reaktif B [422 mM orcinol monohidrat 95'de hazırlanmış % etanol]. Reaktif A altı ay için RT saklanabilir; Reaktif B ışığa maruz kalma sınırı folyo ile kaplı, bir ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Kullanımdan önce 1 (B) v / v oranı: Bu stok çözeltinin 15 (A) 'da karıştırılır.
  2. Yukarıdaki reaktif 2x. Örnek test edilecek başına Böylece, bir 1.0 ml reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne Bial reaktif 500 ul ilave edin.
  3. Bu tüp 10 ul numune 500 ul yere ekleyin. Örnek yeterli olup olmadığını not 1.3 başına gibi (yukarıdaki), daha sonra maksimum olası örnek hacmi (yani, yarım toplam reaksiyon hacmi, bu durumda, örnek 500 ul) ile test reaksiyonları başlar ve oradan seyreltin.
  4. F getirmek için tüp GKD 2 O ekleyin1.0 ml inal hacim; vorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak.
  5. Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin.
  6. Banyosundan ısıtmalı örnek çıkarın ve 10 dakika oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
  7. > 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir.
  8. Görsel inceleme için temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant.
  9. Yarı-kantitatif analiz için, boş uv-vis su ile spektrofotometre ve 660 nm küvetini numune absorbansı ölçülür.

3. 2'-deoxypentose Şekerler için Dische en Difenilamin Assay

  1. 60 mM difenilamin, 11 M glasiyal asetik asit, 179 mM sülfürik asit, v / v ethanol 62 -% Dische en difenilamin reaktif uygun bir miktar hazırlayın. Bu reaktif önceden edilebilirönceden pared ve karanlık bir kap içinde oda sıcaklığında saklanabilir veya ışığa maruz kalma sınırı, folyo ile kaplanmıştır. Pratikte reaktivitede görünen hiçbir değişiklik ile her iki-üç ayda hazırlanabilir olsa ışık hassasiyeti nedeniyle reaktif, süresiz muhafaza edilmemelidir.
  2. Yukarıdaki reaktif 2x. Örnek test edilecek başına Böylece, bir 1.0 ml reaksiyonlar için, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne Dische reaktifi 500 ul ilave edin.
  3. Bu tüp 10 ul numune 500 ul yere ekleyin. Örnek yeterli olup olmadığını not 1.3 başına gibi (yukarıdaki), daha sonra maksimum olası örnek hacmi (yani, yarım toplam reaksiyon hacmi, bu durumda, örnek 500 ul) ile test reaksiyonları başlar ve oradan seyreltin.
  4. 1.0 ml son hacim getirmek için tüp GKD 2 O ekleyin; vorteks veya pipetleme çözüm karıştırmak.
  5. Bir kaynar su banyosu içinde 20 dakika için örnekler inkübe edin.
  6. Banyo ve allo gelen ısıtmalı örnek kaldır10 dk için oda sıcaklığında soğumasına o w.
  7. > 9,300 de örnek tüpü santrifüjleyin xg amacıyla sediman herhangi bir partikül madde için 5 dakika (bir FA45-24-11 Eppendorf sabit açılı rotor ~ 10.000 rpm), bu adımı nitelikten ziyade niceliği çalışmalar için daha da önemlidir.
  8. Görsel inceleme için temiz bir küvet içine bu tüpten tablet süpernatant.
  9. Yarı-kantitatif analiz için, boş uv-vis su ile spektrofotometre ve 600 nm küvetini numune absorbansı ölçülür.

4. Diğer Kullanım Notları

  1. Moleküllerin aşağıdaki sınıflar her bir deney için pozitif ve negatif kontrol reaksiyonları için uygun referans bileşikler şunlardır:
    • Benedict'in - Olumlu = ücretsiz riboz, fruktoz, glikoz; Negatif = RNA, DNA, ATP, vb. (Ücretsiz bir indirgen şeker işlevselliği olmayan herhangi bir sakarit)
    • Bial - Olumlu = RNA (örneğin ekmek mayası ekstresi), riboz, ATP, UMP; Negatif = sığır serum albümin (BSA), ya da başka herhangi bir protein
    • Dische sitesi - Olumlu = DNA (örn. calf thymus); Negatif = RNA, ATP, vb. (Herhangi bir non-2'-deoksijenlenmedeki nükleotid)
  2. Örneğin NaCl, (NH4) 2 SO 4 ve K, 2 SO 4 müdahale etmediği gibi, örneğin genel tuzları, ve reaksiyon tarafından etkilenmez görünür; bu ölçümlerin daha çok protein saflaştırma kullanılan bileşikler için oldukça esnek olduğu tespit edilmiştir seyreltici içeriği. PH yüksek derecede bazik ise Deterjanlar veya üre gibi kaotropik ajanlar testlerinin reaktivite etkileyebilir, bir asidik pH aralığında nötr (metin ve protonlar görmek çünkü temel reaksiyon kimyası genellikle Bial ve Dische en deneyleri için en uygunudur Şekil 2b, c). Potansiyel olarak optimal reaksiyon koşulları, şüpheli interferents, vb. pozitif ve negatif kontrol deneyleri w kullanarak, bir vaka tarafından ayrı ayrı test edilmelidiri'inci referans bileşikleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sonuçlar bilinen referans bileşikleri için bu kolorimetrik tahlillerin uygulama için Şekil 3'te de gösterilmiştir. Örnek nitel veri Benedict'in (a), Bial orcinol, (b) ve en Dische difenilamin (c) deneyleri için gösterilmiştir, ve bu üç deneyleri için standart eğriler Şekil 4 'de gösterilmiştir. Panelleri 3 (ac) 'de, sol paneller uygun bir reaktif / reaktif analit ile pozitif / negatif kontrol deneyleri göstermiştir; Protocols 1-3 (yukarıda) tarif edildiği gibi, bu sonuçlar görsel küvetler içinde in situ' de gösterilmektedir. Alt paneller hakkı ilgili her analit için bir titrasyon serisi göstermektedir. Negatif kontrol olarak su, genel bir protein (0.75 mg / ml BSA), ve 0.75 olmayan iki-indirgeyici şekerler (DNA ise Benedict'in tahlil (a) 'de, pozitif kontrol, riboz (0.42 mg / ml) olan mg / ml RNA ve 12.5 mg / ml). Orcinol tahlil (b) 'de, pozitif kontroller, riboz (0.15 mg / ml), RNA (7.5 mg / ml), ve DNA (0.45 mg / ml) ise, su ve BSBir protein (0.45 mg / ml) negatif kontroller vardır. Difenilamin tahlilinde, (c), dana timüs DNA'sı (0.45 mg / ml), bir pozitif kontrol olarak gösterilir, ve su, maya özü RNA (7.5 mg / ml), riboz (0.15 mg / ml), ve BSA (0.45 mg / ml) negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Iki DNA konsantrasyonları sol iki örnekte de, bir pozitif kontrol (küvetler 1-2), DNA karışımları + RNA (gösterildiği gibi uygulanır: Son olarak, panel (d) heterojen değişen örnekleri ile Dische en reaksiyon göstererek testlerinin sağlamlık göstermektedir çeşitli oranlarda), bir sonraki üç numune (3-5) 'de gösterildiği gibi, ve son üç numune nükleik asit-bağlayıcı protein' HFQ 'yokluğunda (örnek 6) veya varlığında (örnek 7-8) olarak DNA gösterirler. Dische en testinin pozitif sonuç için korunur 16 Not DNA-içeren bile 'kirletici "RNA ya da protein varlığında örnekleri.

Kantitatif Analiz: Şekil 3'te dilüsyon aralıkları (ac) paneller değişebilir Her çünküReaksiyon şeker test edilen türüne bağlı olarak, farklı bir görsel algılama sınırı vardır. Spektrofotometrik yerine görsel göre, algılama ölçü olarak örneğin (a) 'Benedict'in için Şekil 4'te gösterildiği gibi aralıkları, (b) Bial, ve (c) en Dische deneyleri iyileştirmek için kullanılabilir. Burada açıklanan protokolleri öncelikle kalitatif testler olarak düşünülmüştür rağmen, absorbans ve konsantrasyon arasındaki Beer-Lambert ilişkisi şeker veya nükleik asit içeriği en azından yarı-kantitatif tahmin sağlar. Benedict'in deney kalibrasyonu için bir standart eğri bir örneği olarak, riboz konsantrasyonuna karşılık gelen absorbans değerleri doğrusal regresyon uygun (475 nm) Şekil 4 (a) 'da gösterilmiştir; Hata çubukları standart = 3 çoğaltır n sapması ve belirtmek kare korelasyon katsayısı sağlanmaktadır. Çok düşük konsantrasyonlarda riboz (örneğin, 0.28 mm referans) de doğrusallıktan sapma Bu testin sınırlı duyarlılık gösterir. Sankidiyor öncelikle nitel çalışmalar için tasarlanmıştır, aşağıdaki yönergeleri yarı-kantitatif analiz için tavsiye edilir:

  • Benedict'in assay (Şekil 4a) için: reaksiyon okuması (A 475nm) en az 0.04 aralığında doğrusaldır olduğu bulunmuştur olarak üç kopya halinde gerçekleştirilen → 0.5 mg / ml bir analit.
  • Bial assay (Şekil 4b) 'de: absorbansı verileri (660nm) en az bir aralık 0 üzerinde doğrusal olduğu → 0.5 mg / ml bir analit (fırıncı mayası RNA), tahlil üç kopya (R2 = 0.99 doğrusal regresyon yapılmış olan katsayısı). Örneklerin absorbans ölçümleri öncesi açıklama santrifüj edildi rağmen, hiçbir çöktürücü analitin bu düşük konsantrasyonlarda bulunan ve bu nedenle santrifüj adım ille de gerekli değildi. Testi bu aralığın dışında analitin konsantrasyonlarda doğrusallığı sapar.
  • A 600Nm: Dische en assay (Şekil 4c) için (R2 = 0.99) olarak yapılmış olması aralığında doğrusaldır 0.15 olduğu bulunmuştur. Absorbans arsa karşı [analitin] doğrusal tepki bölgenin sınır gösteren, 0.90 mg / ml DNA plato başladı.
  • Nicel veya yarı-kantitatif analiz için pratik konular: Aksi absorbans okuma müdahale ederek çöken materyali kaldırmak için, her üç testlerin zaman makul uzunlukları için maksimum hızları (25,000 xg, ya da her türlü sınırı mikrofuge'de tüpler tarafından dayanmış olabilir) santrifüj gerektirir (örneğin, 20 dakika); bu yüksek analit konsantrasyonları özellikle önemlidir. Santrifüjlemeden sonra, numune uygun bir açıklık absorbans ölçümleri için (örneğin, 96 oyuklu mikrotiter plakalar) ya da bir küvet mikroplaka transfer edilebilir.

Şekil 1 Şekil 1. Testlerin uygulanması için Karar ağacı. Biyomoleküller (örn., tüm-hücre lizatları dan), potansiyel olarak heterojen numune ile başlayarak, burada tarif edilen kolorimetrik deneyleri karışımın non-indirgeyici şekerler (Benedict'in testi) ihtiva edip etmediğini belirlemek için kullanılabilirler. Eğer öyleyse, Bial orcinol deney daha fazla olmayan bir indirgeme şekerleri, nüfusu pentoz halkaları (DNA ya da RNA da olduğu gibi) karşı Heksozların (örn., glukoz, diğer pyranoses) ve muhtemelen henüz diğer aldoses içerip içermediğini gösterir. Numune DNA'nın en azından bir orta bölümü içerir ki, son olarak, daha sonra 2'-deoksiribozdur halka gözle görülür bir mavi yoğunlaşma ürünü verimli, Dische en difenilamin tepkin maddesi ile (asitleştirme ve ısıtma üzerine) reaksiyona girer. Bu diyagram, bir karar ağacı, bir akış olduğunu unutmayın: tahlil sonuçlarının mantığını s gösterilirerially, fakat deneyler paralel olarak yürütülebilir.

Şekil 2,
Şekil 2. Altta yatan kimyasal reaksiyonlar tepkimeleri ile birlikte gösterilen tespit renkli ürün ile, kolorimetrik deneyleri için gösterilmiştir. (A) Cu 2 O bir çözünmeyen, kırmızı çökelti indirgeyici şekerlerin için Benedict'in testinin pozitif bir sonucudur. (B) ısıtma ve asitleştirme sonra, pentoz şekeri halka içeren bir çözünür mavi-yeşil adukt elde etmek için daha sonra orcinol ile reaksiyona furfural, (Bial reaktifi) ile ayrışır. Dische en tahlil, 2 'pozisyonunda bir ikame edici hidroksil eksikliği bir halka-açma oksidasyon reaksiyonu, daha ileri difenilamin ile reaksiyona girerek bir aldehit ürün olarak verir: [(Ph) 2 NH] parlak mavi bir ürün elde edildi. Kimyasal structures orcinol (b) ve difenilamin (c) reaksiyon geniş, çoklu halka yoğunlaşma ürünleri için bilinmemektedir.

Şekil 3
Şekil 3,. Referans bileşimleri ve heterojen örnekler kolorimetrik testlerinin uygulanması. Örnek sonuçlar Benedict'in (a), Bial, (b) ve en Dische (c) kolorimetrik deneyleri için gösterilmiştir. (A) → (c), sol alt paneller her analit için bir titrasyon dizi göstermek uygun reaktif / reaktif analit ve alt paneller doğru kullanarak pozitif / negatif kontroller göstermektedir. Bir nükleik asit ilişkili protein varlığında, ya da tek başına DNA (sol), DNA / RNA farklı oranları (orta) karışımları, ya da DNA (- Dische Ayrıca reaksiyon, bir açıklayıcı paneli (d) analit heterojen olarak değişir ki burada olduğunu göstermiştir 'HFQ'). Bu panellerayrıca metnin Örnek sonuç bölümünde tarif edilmektedir.

Şekil 4,
Şekil 4. Referans bileşimleri ile testlerden standart eğriler. Kalibrasyon eğrileri her deney için lineer tepki bölgenin bir kısmını temsil eden tasvir, (a), Bial, (b) ve en Dische (c) analizlerinin Benedict'in için gösterilmiştir. Lineer regresyon uyar ve ilgili korelasyon katsayıları her bir deney için belirtilir. Standart ekmek mayası RNA (b) ve calf thymus DNA'nın (c) Bu titrasyon seri analitlerin vardı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kolorimetrik testler hızla gibi daha ileri çalışmalar için hazırlık olarak proteinler, RNA veya tüm hücre lizat gelen kompleksleri arındırıcı karşılaşılan gibi biyomoleküler karışımlar, kimyasal yapısını değerlendirmek için basit bir yaklaşım sunmak Burada sunulan. Yapısal biyoloji gibi örnek heterojenlik gibi daha anadili gibi montajları, giderek büyük sorunlar, izlediği gibi, karmaşık ve çok bileşenli kompleksler oluşturduğu edilecektir. Supramoleküler meclisleri genellikle sadece marjinal istikrarlı ve başarılı izolasyonu (örn. olarak Spliceosomal snRNP kompleksleri 17,18 bulundu) daha az sıkı saflaştırma koşullar talep edebilir. Böyle hafif koşullar altında hem otantik ve sahte POI · · · NA etkileşimlerin bir hedef protein ve nükleik asit ile aşağı tayinlerde inat ve böylece müdahale olasılığı daha yüksektir. Gerekli bir ilk adım bu örneklerin kimyasal bileşenlerin türlerinden tanımlanmasıdır.

RNA, DNA ve protein tespit ve_content "> Yöntemleri belki de en önemlisi, miktar ve analitler, mevcut kaynaklar ve zaman kısıtlamaları konsantrasyonuna bağlı olarak ve değişir, analitlerin olasılıkla kimyasal bileşimi hakkında bir önceki bilgisine. proteinli madde ile tespit edilebilir spektroskopik olanlar (A 280), dahil olmak üzere birçok köklü yöntemler, hidrodinamik (jel elektroforezi), kütle spektrometresi ile büyük bir hassasiyet ve doğruluk ile kimyasal / kolorimetrik 19 (örneğin, peptit bağları için Biüre test) ve,,. Benzer şekilde, UA'lar , (A 260) spektroskopik florometrik, veya kimyasal analizi (burada açıklandığı gibi) ile tespit edilebilir. yöntem her tür karakteristik güçlü ve zayıf bulunmaktadır. Örneğin, PicoGreen, SYBR-Gold, ve siyanin bazlı diğer floresan boyalar için oldukça duyarlıdır nükleik asit (kolorimetrik testlerin ötesinde birçok büyüklük sırası), (örneğin, görüntü seçiciliği çeşitli derecelerde sergilerleroGreen çift sarmallı DNA, SYBR-Altın en UA'lar) bağlar, hem de kantitatif amaçlar için geniş dinamik aralıkları vardır. Boyalar etidiyum bromid benzer mutajenler olarak ele alınır;; boyalar algılama (toplu örnekler için jeller, spectrofluorometers için transilluminators) için daha gelişmiş ekipmanlar gerektirir, karşı kolorimetrik testlerin basit görsel okuma ve orada: Ancak, bu yaklaşım sınırsız değildir tahlil koşulları üzerindeki kısıtlamalar (;> 200 mM NaCl PicoGreen sinyal yoğunluk% 30 azalma, örneğin SYBR-Gold için 7-8,5 arasında önerilen pH aralığı) vardır. Böylece, kolorimetrik ve floresan merkezli tamamlayıcı testler şunlardır: nükleik asit boyalar hızlı kolorimetrik analiz yöntemleriyle negatif sonuç durumunda, ya da daha çok dikkatli bir şekilde (kantitatif) kolorimetrik testlerden ilk sonuçlar genişletmek olarak özellikle yararlı olabilir. Kolorimetrik NA protokolleri arasında temel bir yarar, kullanım kolaylığı için ek olarak, sadece iç eş güvenmek olmasıdırdeğerlikli NAS yapısı oldukça fold/3D yapıları, reaktivite, ya da sıra ile değişebilir biyopolimer herhangi diğer özellikleri daha.

Protokoller reaksiyon ürünlerinin basit görsel muayene ile yapılır, özellikle en zorluklar karşısında sağlam Burada anlatılan; özel bakım daha nicel (spektrofotometrik) analizleri için alınmalıdır. Örneğin, Benedict'in tahlil içinde riboz yüksek konsantrasyonları varlığında oluşturan kırmızı çökeltici madde (PPT) önceden spektrofotometrik analiz çıkarılması gerekir, bu kolayca santrifüjleme yoluyla elde edilir. Dische en tahlil için, difenilamin reaktifi ilave ısıtma ile çözündürülmüş edilebilir bir beyaz ppt oluşumu eşlik eder, DNA varlığında formları açısı ölçümleri ile etkileşime girebilir ve önceki kantitatif analiz için kaldırılması gereken bir yeşil ppt. Buna ek olarak, her bir deney duyarlı olan kimyasal reaksiyonlar esas alınmaktadırpotansiyel interferents etmek gibi Girişte belirttiğimiz ve aşağıda daha ayrıntılı. Son olarak, biz bir DNA / RNA karışımı RNA yüksek göreli konsantrasyon Dische en testinin beklenen olumlu sonuç maskeleyebilir unutmayın; DNA için bu yanlış negatif RNA yüksek mol kesri de tepki gerçeğinden kaynaklanıyor, furfural ara ile, Dische en reaktifleri ile, daha çok DNA 2'-deoxypentose şeker ile reaksiyon tarafından üretilen mavi göre adduct renksiz bir ürün elde edilir.

Potansiyel Interferents: şeker, protein ve lipidlerin belirgin durumda ötesinde varsayımsal çapraz reaktivite (false positive) veya maskeli reaktivite (yanlış negatifler) nedeniyle bu kolorimetrik testleri ile sorun neden olabilecek diğer iki biyomoleküllerin vardır. Prensip olarak, hücresel lipidlerin çeşitli makul olarak şeker ile konjuge glycosylglycerols ve diğer glycerolipids, Glikosifingolipidler (örn., cere dahil olmak üzere, engelleyebilirbrosides), vb saccharolipids (örneğin, glukosamin türevleri), lipopolisakkaridinin, ve. Onlar nispeten nadirdir, karşı çok daha bol fosfolipidler, ve bu nedenle bizim testlerin saptama sınırlarının altında çünkü uygulamada, lipidlerin bu sınıflar lipofilik proteinleri ile çalışan bir sorun teşkil etmek olası değildir. Anılan hücresel lipidler en ziyade pentozlara daha Heksozların (galaktoz, glikoz) üzerine inşa edildiği için, Bial veya Dische en tayinlerde yanlış pozitif olarak müdahale etmemelidir. Yanlış pozitif verebilir Serbest monosakkaritler früktoz, galactofuranose, ya da diğer furanoses içerir. İlgili bir not olarak, istenmeyen şekerlerden girişime maltoz bağlayıcı protein (MBP) etiketler ile ifade rekombinant proteinler için bir sorun haline gelebilir. Afinite kromatografisi, bu tür füzyon yapıları saflaştırmak için kullanılan aşağıdaki, maltoz protein elüt edilmesi için kullanılmıştır ve bu alt-preparatlar kalıntı maltoz inci engel olacak bir düşünülebilirE Benedict'in assay (bu testlerin en genel / nonspesifik olduğunu; maltoz glikoz birimleri Bial veya Dische en altında tepki olmamalıdır). Böylece, bir rezidüel maltoz istenmeyen sonuçları vermemiş olmasını sağlamak için post-kromatografik aşamalarda dikkatli olurdu. Biz glukanıdır kısımları öyledir çünkü glikozilasyon proteinleri veya diğer glikoproteinlerin test etmedim, ama biz bu tür proteinlerin (veya glikolipid, proteoglikan veya diğer glycoconjugates) üzerine şeker varlığı için net bir olumlu sonuç elde etmek zor olacağını sanıyorum Bizim ölçümlerin duyarlılığı sınırının altında yalan. Prensip olarak, glikoz gibi ücretsiz bir aldohexose içeren bir çözelti, asit hidrolizi yoluyla glikozilasyon protein kurtuldu Benedict testi ile pozitif test edecek; benzer, gibi ksiloz gibi bir glikoprotein-türetilmiş pentoz, Bial olumlu bir sonuç elde edilmelidir tahlil. Ancak, uygulamada glikoproteinler için olumlu bir sonuç son derece h gerektirecektir çünkü düşük şeker / protein molar oranı da çarpma glikosile polipeptidler için IGH protein konsantrasyonları,,.

Burada anlatılan tahlil protokolleri uzatıldı ve küçük örneklem büyüklüğü sınırları işlemek için adapte edilebilir - örneğin, küçük miktarlar veya analit konsantrasyonu düşük. Kısıtlı numune miktarları için biz reaksiyonlarına (örneğin, PCR tüpleri ve inkübasyon aşaması için bir PCR kullanarak) 100-ul aralığı küçülttüm olabilir bulduk. Düşük konsantrasyonlarda (algılama sınırına yakın), de küçük hacimli numuneler için bir plaka okuyucu ile donatılmış bir spektrofotometre kullanılabilir; tür senaryolarda, sadece beklenen zorluk öncesinde absorbans ölçümleri istenmeyen herhangi bir çöktürücü kaldırılması olacaktır. Basit görsel muayene sınırlı algılama aralığı olmasına rağmen, burada açıklanan yaklaşımın bir avantajı ısıtma üzerine anında analiz edilebilen örnekleri ile, verimliliği ve çabukluğu.

"Protokollerin> Uygulamalar co-burada arındırıcı bileşikler, RNA veya DNA'nın saflık değerlendirmesi ve rezidüel NA veya protein örneklerinin şeker kontaminasyon tespiti tanımlama içerir sundu. Örneğin, bizim testleri ile tespit istenmeyen NA çıkarılabilir Bu tür uygulamalar için alternatif yaklaşımlar olmasına rağmen kimyasal yollarla (RNA örneğin, alkalin hidroliz) veya enzimatik sindirim (örneğin, nükleaz tedavisi) ile bir protein prep., burada açıklanan yöntemlerin zaman ve maliyet açısından oldukça verimli ve can bu nedenle, kolaylıkla bir deney akışı içine entegre edilebilir. serbest indirgeyici şeker, RNA, DNA ya da protein ya da eş temizleyici bileşimlerin belirlenmesi erken aşağı saflaştırma aşamaları uygulanarak, tasarım, karşı zahmetli deneme ve yanılma çalışmalar rehberlik eder. bizim protokolleri takiben yaygın bir adımı tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu, ya da DNA alon bir kurtarma yolu ile, DNA ve protein RNA izolasyon olabilir,e (tiyosiyanat ile hariç). 20 fenol-kloroform ekstraksiyonu sonucunda UA saflığını belirlemek için aşağıdaki deneyler kolorimetrik elektroforez ya da DNase tedavi için basit bir alternatif olarak kullanılabilir. Bu ve diğer yollarla, burada açıklanan kolorimetrik analizler protein ve heterojen biyomoleküler örneklerinde RNA, DNA ve protein bileşenleri ortaya çıkması için hızlı ve sağlam bir sistem elde etmek için NA tayini için köklü yöntemleri ile kombine edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma Virginia Üniversitesi ve Jeffress Memorial Trust (J-971) tarafından finanse edildi. Biz yararlı tartışmalar ve elyazmasının eleştirel okuma L. Columbus, K. Jain ve P. Randolph ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875
Concentrated HCl VWR BDH3030
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877
Diphenylamine Aldrich 112763
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Ethanol Koptec V1101
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
  2. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
  3. Ausubel, F. M. Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. 4th, Wiley. (1999).
  4. Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. 4th, John Wiley & Sons. (2011).
  5. Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. The Biochemistry of the Nucleic Acids. 10th, Chapman and Hall. (1986).
  6. Rice, P. A., Correll, C. C. Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. RSC Pub. (2008).
  7. Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. (2012).
  8. Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
  9. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
  10. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  11. Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
  12. Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
  13. Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
  14. Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
  15. Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
  16. Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
  17. Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
  18. Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
  19. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, (Pt. 2), 99-108 (1999).
  20. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).More

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter