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Bioengineering

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis Published: May 2, 2013 doi: 10.3791/50226

Summary

에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체 방법

Abstract

선충 Caenorhabditis의 elegans의 때문에 질병 관련 유전자와 경로뿐만 아니라 재배의 용이성 자사의 보존 생물 의학 연구를위한 다양한 모델 생물이다. 여러 C. 엘레 질병 모델은 같은 도파민 (DA) 뉴런 1의 변성을 포함 파킨슨 병 (PD)와 같은 퇴행성 신경 질환 등이보고되었다. 도입 유전자와 신경 독성 화학 물질을 모두 신경 변성 및 신경 유전자와 화합물을 2,3에 대한 화면의 기초로 조사를 허용, DA의 신경 퇴화 및 웜의 필연적 인 움직임 결함을 유도하는 데 사용되었습니다.

C. 같은 낮은 진핵 생물의 화면 엘레은 신경 신호에 영향을 미치는 화합물 유전자를 식별 할 수있는 효율적이고 경제적 인 방법을 제공합니다. 기존의 스크린은 일반적으로 수동으로 수행하고 육안 검사에 의해 채점, 결과적으로, 그들은 시간이 단점입니다uming과 인간의 오류가 발생하기 쉬운. 또한, 세포 수준 분석에 대부분의 초점은 운동을 무시하면서, 이는 운동 장애를위한 특히 중요한 매개 변수입니다.

우리는 C.를 제어하고 정량화 새로운 마이크로 유체 심사 시스템 (그림 1) 개발 elegans의 '운동은 마이크로 내부 전기장 자극을 사용하여. 우리는 직류 (DC) 필드가 견고 음극쪽으로 운동 ( "electrotaxis"4) 주문형 유도 할 수있는 것으로 나타났습니다. 필드의 극성을 반전하면 웜이 빠르게뿐만 아니라 방향을 반전됩니다. 우리는 또한 도파민과 다른 감각 뉴런에 결함이 수영 응답 5을 변경 것으로 나타났습니다. 따라서 신경 세포의 신호 전달에 이상이 읽기 아웃으로 운동을 사용하여 확인할 수 있습니다. 운동 반응은 정확히 같은 속도, 몸을 구부리는 주파수와 반전 시간을 수영과 같은 매개 변수의 범위를 사용하여 정량화 할 수있다.

4에 비해 더 빠르게 이동합니다. 이러한 연구 결과는 우리가 수동적으로 연령과 표현형 (6)에 의해 벌레를 정렬하는 새로운 microfluidic 장치를 설계했다.

우리는 또한 펄스 DC에 웜의 반응을 테스트하고 전류 (AC) 전기 분야를 교류했다. C. 둘 다에있는 다양한 듀티 사이클 펄스 DC 필드 효과적으로 생성 electrotaxis 엘레과 사촌 C. 7 briggsae. 또 다른 실험에서, 1 Hz에서에서 3 kHz의 주파수 범위 대칭 AC 필드는 8 채널 내부의 벌레를 고정.

미세 환경에서 전기장의 구현은 electrotaxis 분석의 신속하고 자동 실행을 할 수 있습니다. 이 방법은 요소에 대한 높은 처리량 유전 및 화학 화면을 촉진하기 위해 약속신경 세포의 기능과 생존에 영향을 미치는.

Protocol

1. 마스터 금형 제작을위한 포토 리소그래피

  1. 30 초 후 30 초와 메탄올 아세톤 실리콘 웨이퍼 인치 3 목욕. 5 분 dH보다 2 0 물로 씻어.
  2. N2 블로우 총으로 웨이퍼의 표면을 건조. 2 분 동안 140 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 가열한다.
  3. 플라즈마 실리콘 웨이퍼 (1 분, 50 W)의 표면을 산화.
  4. 3 ML SU-8 100 포토 레지스트 (; 1,750 rpm으로 40 초)을 스핀 코팅 웨이퍼의 표면.
  5. 65 뜨거운 접시에 미리 구워 코팅 웨이퍼 ° C 10 분 후, 95 ° C 2 분 이상 온도를 진입로. 추가 1 시간이 설정을 유지합니다.
  6. 원하는 채널 설계를 포함하는 포토 마스크를 맞 춥니 다. 550-600 UV 빛의 엠제이 / ㎠ (350-400 nm의)에 저항을 노출합니다. 포토 마스크는 AutoCAD에서 설계 및 고해상도 인쇄와 투명에 인쇄 할 수 있습니다.
  7. T를 올렸에서 10 분 동안 1 분, 95 ° C, 65 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼 포스트 구워이전과 그 온도.
  8. 15 분 SU-8 개발자 용액에 웨이퍼를 담가. 이소프로판올로 세척함으로써 개발 완료를 확인합니다. 백색의 침전이 나타나면, 계속 개발. 마스터 형은 그림 2A에 표시됩니다.

2. 마이크로 채널 제작 용 소프트 리소그래피

  1. 3.5 ML PDMS 경화제와 함께 35 ML 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 중합체 기반을 섞는다.
  2. 알루미늄 호일로 늘어선 페트리 접시에 제작 된 마스터 몰드 (모양이 위를 향하게)와 빈 실리콘 웨이퍼를 놓습니다.
  3. 두 번째 접시에 마스터 금형 접시 15 ML에 20 ML PDMS의 프리폴리머를 붓는다. 부드럽게 일회용 나무 주걱으로 그들을 눌러 웨이퍼 아래에 공기 주머니를 제거합니다.
  4. 두 접시를 커버하고 치료하는 일에 대해 따로 설정합니다. 또는 2, 빠른 치료를 위해, 진공 degasifier를 사용하여 PDMS에서 기포를 제거하고 80 뜨거운 접시에 요리를 남겨 ° C시간.
  5. 웨이퍼에서 호일 PDMS 껍질을 제거합니다.
  6. 채널의 양쪽 끝에서 유체 액세스 포트를 펀치 해리스 유니 코어 (2.5 mm)을 사용합니다. 비슷한 크기의 스트립에 채널과 빈 PDMS를 잘라.
  7. 플라즈마 산화에 채널 빈 PDMS 스트립 유리 슬라이드 (75 × 25mm 2)로드 가능성 클린 룸에 위치해 있습니다. 40 W 전원에서 40 초 동안 산소 플라즈마에 노출.
  8. 빈 스트립의 반대편에 채널 조각과 유리 슬라이드를 붙입니다. 결합을 완료하는 데 2​​ 시간 방치.
  9. 120 핫 플레이트에 어셈블리를 배치 ° C. PDMS의 예비 중합체를 사용하여 구멍을 뚫은 저수지, 각 장기에 최소 6 in (내경 1 / 32 ", 외경 3 / 32") 플라스틱 튜브를 연결합니다. 하나 또는 두 개의 튜브에 부착는 유체 플라스틱 커넥터 주사기 첨부를 허용하거나, 상업적으로 이용 가능한 피팅을 사용합니다.
  10. PDMS는 치료하는 튜브를 확보 할 수 있습니다. EAC로 22 게이지 절연 구리 와이어의 3 "길이를 삽입입구 관 및 채널과 PDMS 예비 중합체와 보안 사이의 시간 저수지. 완성 된 제품은 그림 2B에 표시됩니다.

3. Electrotaxis 실험

  1. 모니터 (그림 1)에 연결 장착 된 카메라 현미경의 무대 (가급적 XY-이동)에 마이크로 놓습니다.
  2. 의 마이크로 전극에 전원 공급 장치 또는 앰프의 출력 선을 연결합니다. 만 DC 신호가 필요한 경우 단순 DC 전원 공급 장치는 충분하지만, 함수 발생기에 연결된 앰프뿐만 아니라 펄스 DC 및 AC 신호의 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
  3. 일회용 주사기에의 마이크로 출력 튜브를 연결합니다. 잠수함 M9 생리 버퍼에있는 입구 관의 입과 부드럽게은 주사기 내부의 부압 (수동 또는 주사기 펌프를 사용)를 적용하여 채널에 액체를 열망. 입구와 출구 튜브 M9로 채워 둘 때, 주사기 F를 분리롬 관. 수압 구동 흐름을 방지하기 위해 같은 높이에 두 튜브를 수평.
  4. 채널에 DC 전압을 적용하고 (R = V / I)이 (긴 50mm를위한 0.3 mm 폭 ~ 0.1 mm 깊이 마이크로) MΩ 0.6 주위에 그 저항을 확인합니다.
  5. 채널의 무결성을 만족하는 경우, 채널에 희석 현탁액에서 웜을로드 위의 단계를 수행하십시오.
  6. 주사기를 분리하고 수압 관 '상대 높이를 조정하여 흐름을 조작 할 수 있습니다. 채널의 중심에있는 벌레를 놓고 같은 높이에 두 튜브가 평평하다이 방법을 사용합니다.
  7. L3 단계 동물 용 4-12 V / cm의 L4S 4-10 V / cm, 2-4 V / 젊은 성인을위한 CM : 적절한 전압 전원 공급 장치를 설정합니다. 전기 신호를 활성화하고 현장에 순응하는 웜 사전 노출의 1 분을 허용합니다. 웜은 음극쪽으로 이동을 시작합니다. 분이 경과하면 녹음을 시작하려면 카메라를 사용합니다.
  8. AC 및 펄스7, 8을 원하는대로 D DC 실험, 최대 반응 전계 신호의 이상과 주파수 및 듀티 사이클에서 채택 될 수 변조 할 수 있습니다.
  9. 실험이 완료되면, 채널에서 모든 액체 (와 웜)를 제거, dH보다 2 0으로 헹굼 ° C 건조 125 핫 플레이트에 장치를 둡니다.
  10. 수동으로 NIH ImageJ에 (사용 녹화 된 비디오에서 locomotory 데이터를 추출 http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) 또는 사용자 정의 MATLAB 기반의 웜 추적 소프트웨어입니다.

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Representative Results

웜 추적 소프트웨어에서 야생형 젊은 성인 선충의 electrotaxis 그 위치와 속도 출력의 대표적인 비디오 보충 비디오 1과 그림 3에 나와 있습니다. 동작 분석 소프트웨어 자체 필드 극성의 방향 및 극성 반전의 시간을 인식하지 않고 오히려이 정보는 소스 비디오에서 얻을 수 있어야합니다. 이 동영상의 오디오 또는 시각적 신호를 사용하거나 실험 조건 및 조작을 작성 할 수 있습니다.

야생형 (N2) 및 형질 전환 동물 (NL5901)의 집합에서 Electrotaxis 속도 데이터는 그림 4에 표시됩니다. NL5901 동물 UNC-54 (마이 오신 중쇄 유전자) 발기인의 통제하에 인간 α-synuclein의 유전자를 가지고. 몸에 α-synuclein의 표현 벽 근육 집계 9 우리의 결과는 ELEC에 이상이 발생한다는 것을 보여trotactic 응답. NL5901 웜의 속도는 야생형보다 훨씬 느립니다. 그래프를 플롯하기 위해, 우리는 각 웜의 속도를 계산 미니탭 통계 소프트웨어 (사용 상자 플롯 결과 플롯 http://www.minitab.com를 ). 다른 설명으로뿐만 아니라 속도, 같은 회전 응답 (전기장의 극성 변화에 대한 응답으로 반전을 완료하는 데 걸리는 시간)과 몸 구부리는 주파수 (초당 사인 파의 평균 수)와 같은 운동의 다른 매개 변수는 또한 분석 할 수 있습니다 5.

electrotaxis 프로토콜은 표백제 용액 (2:3 부피비 차아 염소산 나트륨 4 N 수산화 나트륨) 10와 치료를 통해 얻을 수있는 동기화 인구에서 가장 잘 작동합니다. 여기에 제시된 모든 데이터는 나이와 무대에 따라 변화를 배제하기 위해 동기화 인구로부터 얻은 것입니다. 우리는 젊은 성인 (69 시간 후 L1에서 사용하는 동안200C)는 다른 단계는 (L2 이후)도 테스트 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 선충 electrotaxis 분석을위한 미세 유체 심사 플랫폼의 개략도. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. 마스터 몰드 (A)와 완전히 조립 PDMS 마이크로 장치 (B).

그림 3
그림 3. 위치 대 시간 (A)와 순간 속도 (B) 정의 웜 추적 프로그램의 출력을 제공한다. 신CE 영상은 아래 보충 비디오 1입니다. 이 프로그램은 위치 - 시간 곡선에서 속도 곡선을 계산하지만 평균 속도를 계산할 때 스파이크를 무시합니다.

그림 4
그림 4. 야생 형 제어 N2 및 형질 전환 NL5901 웜의 Electrotaxis 속도. NL5901 웜 P> 0.0001로 제어보다 훨씬 느립니다. 중요성은 비모수 맨 - 휘트니 테스트를 사용하여 결정됩니다. N NL5901에 대한 N2 및 N = 23 = 10.

보충 비디오 1. 미세 유체 채널에서 젊은 성인 선충의 Electrotactic 행동. 비디오가 오른쪽으로 음극으로 시작됩니다. 유리 피펫의 모습은 긴박한 극성 반전을 나타냅니다 반전의 피펫 신호의 순간 이후에 제거. 보려면 여기를 클릭하십시오영화.

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Discussion

처음으로 추앙와 동료 11,12의 dielectrophoretic 조작 작업에 GABEL 및 동료와 건물에 의해 기술 된 행동 현상을 활용, 우리의 마이크로 유체 기반 electrotaxis 분석은 운동을 같이 사용하여 웜에 신경 활동을 조사하기 쉽고 강력하고 중요한 방법을 제공합니다 출력. 운동 매개 변수의 분석은 서로 다른 유전자형 사이의 정량적 인 비교를 할 수 있습니다. 함께 마이크로 제조 및 전기 분야의 응용 프로그램의 정밀도는 제어 환경 운동 제어를위한 웜과 통신 할 수있는 수단을 모두 제공합니다. 다른 전기 신호의 파형 모양 웜의 여러 행동 반사가 두 자극하고 운동을 억제하는 데 사용되었습니다.

현재 microfluidic 장치의 단일 채널 디자인은 하나의 웜이 시간에 득점해야합니다. 이를 위해, 웜 솔루션은 충분히 M9로 희석해야합니다채널에 벌레를로드하기 전에 버퍼입니다. 그것은 채널 작업이 기포와 수압에 영향을 미치는 다른 부정의 존재에 의해 복잡하게 될 수 있다는 점을 지적하는 것이 중요합니다. 이 M9와 채널을 세척하고 입구와 출구 튜브의 높이를 조작하여 제거 할 수 있습니다.

여기에 설명 된 분석은 더욱 향상 될 수 있습니다. 이 같은 웜 로딩, 위치 및 추적과 같은 다른 제어 메커니즘의 통합을 필요로하지만 다 채널 미세 유체 칩, 웜 검사를 가속화 할 수 있습니다. electrotaxis 프로토콜의 추가 자동화, 특히 컴퓨터 제어 흐름 관리 효율성을 증가 할 것이다. 이러한 향상된 기능은 우리의 실험실에서 개발 중이다.

electrotaxis 동영상에서 운동 데이터의 추출은 원래 느리고 지루한 과정입니다 ImageJ에를 사용하여 수동으로 수행 하였다. 효율성을 높이고 시간을 제거하려면우만 오류, 우리는 기술 13의 캘리포니아 연구소에서 개발 된 원래의 MATLAB 기반의 패키지에서 적응 웜 추적 프로그램을 사용하기 시작했다. 이 소프트웨어는 현재 단일 웜 비디오를 처리합니다. 최신 버전은 화학적으로 처리 된 웜, 신경과 근육의 돌연변이를 포함한 분석의 넓은 범위에 적합합니다. 한계 중 하나는 특정 신경 세포의 돌연변이 (예를 들어, OSM-5) 5에서 관찰 된 자발적인 반전이 올바르게 해석되지 않은 것입니다. 웜은 수동으로 분석해야합니다.

제한에도 불구하고, 미세 유체 electrotaxis은 운동 관련 질환의 웜 모델과 약 발견 분석 등 수많은 상황에 적용 할 수 있습니다. 병렬화에의 복종 할 의무 고려 electrotaxis은 특히 높은 처리량 검사 응용 프로그램에 적합합니다. electrotactic 행동 및 신경 변성의 유전과 나이에 따라 분석도이 함께 공부 할 수 있습니다시스템. 또한, 웜은 연령이나 동기 샘플을 형성하는 또는 앞으로 유전자 스크린 6,14에 대한 새로운 돌연변이를 식별하는 표현형으로 분류 할 수있다.

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Disclosures

미세 electrotaxis 분석 기술은 미국과 캐나다, 미국에 특허 출원되어 있습니다.

Acknowledgments

저자는 재정 지원에 대한 자신의 조기 연구원 상 프로그램을 통해 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회, 캐나다 연구 의자 프로그램, 건강 연구의 캐나다 연구소, 그리고 연구와 혁신의 온타리오 교육부 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone CALEDON Labs 1200-1-30
Methanol CALEDON Labs 6700-1-30
Isopropanol CALEDON Labs 8600-1-40
SU-8 Microchem Corp. Y131273 SU-8 100
SU-8 Developer Microchem Corp. Y020100
92x16mm Petri Dish Sarstedt 82.1473.001
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Contains elastomer base and curing agent
Function generator Tektronix Inc. Model AFG3022B
Amplifier Trek Inc. Model 2210-CE
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4506 Model 11 ELITE
Hotplate Fisher Scientific 11675916Q Model HP131725Q

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References

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Tong, J., Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion. J. Vis. Exp. (75), e50226, doi:10.3791/50226 (2013).

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