Summary
में मांग पर हरकत को उत्पन्न करने के लिए एक अर्द्ध स्वचालित माइक्रो विद्युत fluidic विधि
Protocol
1. मास्टर मोल्ड निर्माण के लिए photolithography
- 30 सेकंड के लिए तो 30 सेकंड और मेथनॉल के लिए एसीटोन में सिलिकॉन वेफर अंदर एक 3 स्नान. 5 मिनट के लिए DH 2 0 पानी से कुल्ला.
- एक एन 2 उड़ा बंदूक के साथ वेफर की सतह सूखी. 2 मिनट के लिए 140 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर गरम करें.
- प्लाज्मा सिलिकॉन वेफर (1 मिनट, 50 डब्ल्यू) की सतह oxidize.
- 3 मिलीग्राम SU 8 100 photoresist (; 1,750 आरपीएम 40 सेकंड) के साथ स्पिन कोट वेफर की सतह.
- 65 पर एक गर्म थाली पर पूर्व सेंकना लेपित वेफर डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए, फिर 95 डिग्री सेल्सियस से अधिक 2 मिनट के लिए तापमान को रैंप. एक अतिरिक्त 1 घंटे के लिए इस सेटिंग को बनाए रखें.
- वांछित चैनल डिजाइन युक्त photomask संरेखित करें. 550-600 पराबैंगनी प्रकाश का MJ / 2 सेमी (350-400 एनएम) के लिए विरोध का खुलासा. Photomasks AutoCAD में बनाया गया है और उच्च संकल्प मुद्रण के साथ एक पारदर्शिता पर मुद्रित किया जा सकता है.
- टी ramping, 10 मिनट के लिए 1 मिनट और 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर के बाद सेंकनापहले की तरह वह तापमान.
- 10-15 मिनट के लिए SU-8 डेवलपर समाधान में वेफर विसर्जित कर दिया. Isopropanol के साथ rinsing द्वारा विकास के पूरा होने के लिए जाँच करें. एक सफेद वेग दिखाई देता है, विकास के लिए जारी. मास्टर मोल्ड चित्रा 2A में दिखाया गया है.
2. Microchannel निर्माण के लिए शीतल लिथोग्राफी
- 3.5 मिलीलीटर PDMS इलाज एजेंट के साथ 35 मिलीलीटर polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer के आधार मिलाएं.
- एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लाइन में खड़ा पेट्री डिश में गढ़े मास्टर मोल्ड (पैटर्न का सामना करना पड़) और एक खाली सिलिकॉन वेफर रखें.
- दूसरी डिश में मास्टर मोल्ड पकवान और 15 मिलीलीटर में 20 मिलीलीटर PDMS prepolymer डालो. धीरे एक डिस्पोजेबल लकड़ी applicator के साथ उन पर दबाव द्वारा वेफर्स के नीचे हवा जेब हटा दें.
- दोनों व्यंजन कवर और इलाज करने के लिए एक दिन के लिए अलग सेट. वैकल्पिक रूप से 2 के लिए, तेजी से इलाज करने के लिए, एक वैक्यूम degasifier उपयोग कर PDMS से हवाई बुलबुले को हटाने और फिर 80 पर एक गर्म थाली पर बर्तन छोड़ डिग्री सेल्सियसघंटा.
- वेफर्स से पन्नी और PDMS छील निकालें.
- चैनल के दोनों सिरों पर तरल पदार्थ उपयोग बंदरगाहों पंच हैरिस विश्वविद्यालय कोर (2.5 मिमी) का प्रयोग करें. इसी आकार स्ट्रिप्स में चैनल और खाली PDMS कट.
- एक प्लाज्मा आक्सीकारक में चैनल, रिक्त PDMS पट्टी और एक गिलास स्लाइड (75 × 25 मिमी 2) लोड, संभावना एक cleanroom में स्थित है. 40 डब्ल्यू शक्ति से कम 40 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा को बेनकाब.
- खाली पट्टी के विपरीत दिशा में चैनल टुकड़ा और गिलास स्लाइड रहो. संबंधों को पूरा करने के लिए 2 घंटे के लिए अलग निर्धारित करें.
- 120 पर एक गर्म थाली पर विधानसभा प्लेस डिग्री सेल्सियस PDMS prepolymer का उपयोग कर मुक्का मारा जलाशयों के लिए, प्रत्येक लंबे अंदर कम से कम 6, (भीतरी व्यास 1/32 ", बाहरी व्यास 3/32") प्लास्टिक टयूबिंग देते हैं. एक या दोनों ट्यूबों को जोड़ना एक fluidic प्लास्टिक कनेक्टर सिरिंज कुर्की की अनुमति है, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिटिंग का उपयोग करने के लिए.
- PDMS के इलाज के लिए ट्यूबिंग हासिल करने की अनुमति दें. पूर्वी वायु कमान में 22 गेज अछूता तांबे के तार के 3 "लंबाई डालेंइनलेट ट्यूब और चैनल, और PDMS prepolymer साथ सुरक्षित के बीच ज जलाशय,. तैयार उत्पाद चित्रा 2B में दिखाया गया है.
3. Electrotaxis प्रयोग
- एक मॉनिटर (चित्रा 1) से जुड़े एक घुड़सवार कैमरे के साथ एक खुर्दबीन के मंच (अधिमानतः XY-जंगम) पर microchannel रखें.
- के microchannel के इलेक्ट्रोड के लिए बिजली की आपूर्ति या एम्पलीफायर के उत्पादन तारों कनेक्ट. केवल एक डीसी संकेत वांछित है अगर एक साधारण डीसी बिजली की आपूर्ति पर्याप्त है, लेकिन एक समारोह जनरेटर से जुड़ा एक एम्पलीफायर के रूप में अच्छी तरह से स्पंदित डीसी और एसी संकेतों के आवेदन की अनुमति देता है.
- एक डिस्पोजेबल सिरिंज के microchannel के उत्पादन ट्यूब देते हैं. डूब M9 के शारीरिक बफर में इनलेट ट्यूब का मुंह और धीरे सिरिंज के अंदर एक नकारात्मक दबाव (या तो स्वयं या एक सिरिंज पंप का उपयोग कर) को लागू करने से चैनल में तरल ख्वाहिश. इनलेट और आउटलेट ट्यूबों M9 के साथ भर रहे हैं दोनों जब, सिरिंज च काटनारॉम ट्यूब. तरलस्थैतिक रूप से संचालित प्रवाह को रोकने के लिए एक ही ऊंचाई तक दोनों ट्यूबों स्तर.
- चैनल के लिए एक डीसी वोल्टेज लागू करें और (आर वी = / मैं) (, लंबे समय से एक 50 मिमी के लिए 0.3 मिमी चौड़े और ~ 0.1 मिमी गहरी microchannel) MΩ 0.6 के आसपास है कि प्रतिरोध सुनिश्चित करते हैं.
- चैनल की ईमानदारी से संतुष्ट हैं, तो चैनल में एक पतला निलंबन से कीड़े लोड करने के लिए ऊपर दिए गए चरणों का पालन करें.
- सिरिंज डिस्कनेक्ट और तरलस्थैतिक रूप से ट्यूब 'रिश्तेदार ऊंचाई समायोजन करके प्रवाह में हेरफेर. चैनल के केंद्र में एक कीड़ा जगह तो एक ही ऊंचाई पर दोनों ट्यूबों फ्लैट रखना करने के लिए इस विधि का प्रयोग करें.
- एल 3 चरण जानवरों के लिए 4-12 वी / सेमी, L4s के लिए 4-10 वी / सेमी, और 2-4 वी / युवा वयस्कों के लिए सेमी: उचित वोल्टेज की बिजली की आपूर्ति निर्धारित करें. बिजली के संकेत को सक्रिय करने और क्षेत्र के लिए acclimatize करने कृमि के लिए पूर्व जोखिम से 1 मिनट की अनुमति है. कीड़ा कैथोड की ओर बढ़ शुरू करना चाहिए. मिनट बीत चुका है, रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए कैमरे का उपयोग करें.
- एसी और नाड़ी के लिए7, 8 के रूप में वांछित घ डीसी प्रयोगों, अधिकतम उत्तरदायी बिजली क्षेत्र संकेत के ऊपर और आवृत्ति और कर्तव्य चक्र से अपनाया जा सकता संग्राहक जा सकता है.
- प्रयोग समाप्त हो गया है, जब चैनल से सभी तरल (और कीड़े) को हटाने, DH 2 0 के साथ यह कुल्ला, और डिग्री सेल्सियस सूखे के लिए 125 पर एक गर्म थाली पर डिवाइस छोड़ दें.
- मैन्युअल एनआईएच ImageJ (का उपयोग कर दर्ज की वीडियो से locomotory डेटा निकालें http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) या कस्टम MATLAB आधारित कीड़ा ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर.
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Representative Results
कीड़ा ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर से एक जंगली प्रकार युवा वयस्क निमेटोड के electrotaxis और अपनी स्थिति और वेग outputs के एक प्रतिनिधि वीडियो पूरक वीडियो 1 और 3 चित्र में दिखाया जाता है. आंदोलन विश्लेषण सॉफ्टवेयर ही क्षेत्र polarity के दिशा और polarity उत्क्रमण के समय पहचान नहीं है, बल्कि, इस जानकारी का स्रोत वीडियो से प्राप्त किया जाना चाहिए. इस वीडियो में एक ऑडियो या दृश्य संकेत का उपयोग कर या प्रयोगात्मक शर्तों और जोड़तोड़ नीचे लेखन किया जा सकता है.
जंगली प्रकार (एन 2) और ट्रांसजेनिक जानवर (NL5901) का एक सेट से Electrotaxis गति आंकड़ा चित्रा 4 में प्रदर्शित कर रहे हैं. NL5901 जानवरों unc-54 (मायोसिन भारी श्रृंखला जीन) प्रमोटर के नियंत्रण के तहत मानव α-synuclein जीन ले. शरीर में α-synuclein व्यक्त की दीवार की मांसपेशियों समुच्चय 9 और हमारे परिणाम यह चुनाव में असामान्यताएं के कारण होता है जो दिखानेtrotactic प्रतिक्रिया. NL5901 कीड़े की गति जंगली प्रकार की तुलना में काफी धीमी है. ग्राफ साजिश करने के लिए, हम व्यक्तिगत कीड़े की गति की गणना की और Minitab सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर (का उपयोग कर एक बॉक्स साजिश में परिणाम साजिश रची http://www.minitab.com ). कहीं वर्णित के रूप में करने के अलावा गति, ऐसे मोड़ प्रतिक्रिया (बिजली के क्षेत्र ध्रुवता परिवर्तन के जवाब में उत्क्रमण को पूरा करने के लिए लिया गया समय) और शरीर झुकने आवृत्ति (प्रति सेकंड साइन लहरों की औसत संख्या) के रूप में आंदोलन के अन्य मानकों, यह भी विश्लेषण किया जा सकता है 5.
electrotaxis प्रोटोकॉल एक ब्लीच समाधान (एक 02:03 अनुपात मात्रा में सोडियम हाइपोक्लोराइट और 4 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड) 10 के साथ उपचार के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जो एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या के साथ सबसे अच्छा काम करता है. यहाँ प्रस्तुत डाटा उम्र और अवस्था पर निर्भर भिन्नता से इनकार करने के सिंक्रनाइज़ आबादी से प्राप्त हुई थी. हम युवा वयस्कों (69 घंटे के बाद एल 1 पर इस्तेमाल किया है200C), दूसरे चरण (L2 के बाद) भी परीक्षण किया जा सकता है.
चित्रा 1. निमेटोड electrotaxis परख के लिए microfluidic स्क्रीनिंग मंच के योजनाबद्ध. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. मास्टर मोल्ड (ए) और पूरी तरह से इकट्ठे PDMS microchannel डिवाइस (बी).
चित्रा 3. स्थिति बनाम समय (ए) और तात्कालिक वेग (बी) कस्टम कीड़ा ट्रैकिंग कार्यक्रम के आउटपुट. खट्टेCE के वीडियो से नीचे पूरक वीडियो 1 है. कार्यक्रम की स्थिति के समय वक्र से वेग वक्र की गणना करता है, लेकिन औसत गति की गणना करते समय spikes के disregards.
4 चित्रा. जंगली प्रकार नियंत्रण एन 2 और ट्रांसजेनिक NL5901 कीड़े की Electrotaxis गति. NL5901 कीड़े पी> 0.0001 साथ नियंत्रण की तुलना में काफी धीमी गति से कर रहे हैं. महत्व गैर पैरामीट्रिक मान व्हिटनी परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. एन NL5901 के लिए एन 2 और n = 23 = 10.
पूरक वीडियो 1. एक microfluidic चैनल में युवा वयस्क निमेटोड का Electrotactic व्यवहार. वीडियो सही करने के लिए कैथोड के साथ शुरू होता है. कांच विंदुक का प्रस्तुतिकरण आसन्न ध्रुवता उलट इंगित करता है; पलटने की पिपेट संकेतों पल के बाद हटाने. देखने के लिए यहां क्लिक करेंफिल्म.
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Discussion
पहले चुआंग और उनके सहयोगियों 11,12 के dielectrophoretic हेरफेर काम पर Gabel और उनके सहयोगियों और इमारत से वर्णित व्यवहार घटना का लाभ उठाते हुए, हमारे microfluidic आधारित electrotaxis परख आंदोलन के रूप में उपयोग करते हुए कीड़े में neuronal गतिविधि की जांच के लिए एक आसान, मजबूत और संवेदनशील तरीका प्रदान करता है एक उत्पादन. आंदोलन मापदंडों का विश्लेषण अलग जीनोटाइप के बीच मात्रात्मक तुलना की अनुमति देता है. एक साथ microchannel के निर्माण और बिजली क्षेत्र के आवेदन की सटीक एक चलाया पर्यावरण और हरकत नियंत्रण के लिए कृमि के साथ संवाद करने के लिए एक साधन के दोनों प्रदान करते हैं. विभिन्न बिजली के संकेत लहर आकार कीड़ा में अलग व्यवहार प्रतिबिंब है और दोनों को उत्तेजित और हरकत को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
वर्तमान microfluidic डिवाइस के एक चैनल डिजाइन केवल एक कीड़ा एक समय पर स्कोर किया जाना चाहिए. इस के लिए, कीड़ा समाधान पर्याप्त M9 के साथ पतला होना चाहिएचैनल में कीड़े लोड करने के लिए प्रयास करने से पहले बफर. यह चैनल संचालन हवाई बुलबुले और हीड्रास्टाटिक दबाव को प्रभावित करने वाले अन्य अनियमितताओं की उपस्थिति से जटिल हो सकता है कि बाहर बात करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस M9 के साथ चैनल निस्तब्धता और इनलेट और आउटलेट ट्यूबों की ऊंचाई जोड़ तोड़ से समाप्त किया जा सकता है.
यहाँ वर्णित परख आगे सुधार किया जा सकता है. यह ऐसी कीड़ा लोडिंग, स्थिति और ट्रैकिंग के रूप में अन्य नियंत्रण तंत्र के एकीकरण की आवश्यकता होगी, हालांकि एक मल्टी चैनल microfluidic चिप, कीड़ा स्क्रीनिंग में तेजी लाने सकता है. Electrotaxis प्रोटोकॉल के आगे स्वचालन, विशेष रूप से कंप्यूटर नियंत्रित प्रवाह प्रबंधन, दक्षता में वृद्धि होगी. इन उन्नत हमारी प्रयोगशाला में विकास के अंतर्गत वर्तमान में हैं.
Electrotaxis वीडियो से हरकत डेटा की निकासी मूल रूप से एक धीमी और थकाऊ प्रक्रिया है जो ImageJ, का उपयोग करते हुए मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया गया था. दक्षता बढ़ाने के लिए और ज को खत्म करने के लिएउमान त्रुटि, हम प्रौद्योगिकी 13 के कैलिफोर्निया संस्थान में विकसित की एक मूल MATLAB आधारित पैकेज से अनुकूलित एक कीड़ा ट्रैकिंग प्रोग्राम का उपयोग शुरू कर दिया है. सॉफ्टवेयर वर्तमान में एक कीड़ा वीडियो प्रक्रियाओं. नवीनतम संस्करण रासायनिक इलाज कीड़े और neuronal और मांसपेशियों म्यूटेंट सहित assays की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है. अपनी सीमाओं में से एक निश्चित न्यूरोनल म्यूटेंट (जैसे, OSM -5) 5 में मनाया सहज बदलाव, सही ढंग से व्याख्या नहीं कर रहे हैं. इस तरह के कीड़े मैन्युअल विश्लेषण किया जाना चाहिए.
सीमाओं के बावजूद, microfluidic electrotaxis आंदोलन से संबंधित विकारों का कीड़ा मॉडल के साथ दवाओं की खोज के assays सहित असंख्य संदर्भों में लागू किया जा सकता है. Parallelization को इसकी ज़िम्मा ध्यान में रखते हुए, electrotaxis विशेष रूप से अच्छी तरह से उच्च throughput स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल है. Electrotactic व्यवहार और neuronal अध: पतन की जेनेटिक और उम्र पर निर्भर विश्लेषण भी इस के साथ अध्ययन किया जा सकता हैप्रणाली. इसके अतिरिक्त, कीड़े उम्र या सिंक्रनाइज़ नमूने लिए फार्म या आगे आनुवंशिक स्क्रीन 6,14 के लिए नई म्यूटेंट की पहचान करने के लिए phenotype के द्वारा हल किया जा सकता है.
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Disclosures
microfluidic electrotaxis परख प्रौद्योगिकी अमेरिका और कनाडा के संयुक्त राज्य अमेरिका में पेटेंट के लिए दायर की गई है.
Acknowledgments
लेखकों को वित्तीय सहायता के लिए अपने प्रारंभिक शोधकर्ताओं पुरस्कार कार्यक्रम के माध्यम से प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल, कनाडा अनुसंधान अध्यक्षों कार्यक्रम, स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा, और अनुसंधान और नवाचार के ओंटारियो मंत्रालय को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
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