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Bioengineering

Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de Published: May 2, 2013 doi: 10.3791/50226

Summary

Un método de micro-electro-fluido semi-automático para inducir la locomoción en la demanda de

Abstract

Los nematodo Caenorhabditis elegans es un organismo modelo para la investigación biomédica versátil debido a su conservación de los genes y las vías relacionadas con la enfermedad, así como su facilidad de cultivo. Varios C. modelos de enfermedad elegans han sido reportados, incluyendo trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Parkinson (EP), que implica la degeneración de dopaminérgico (DA), las neuronas 1. Tanto los transgenes y los productos químicos neurotóxicos se han utilizado para inducir la neurodegeneración DA y defectos movimiento consiguientes en gusanos, lo que permite las investigaciones sobre la base de la neurodegeneración y las pantallas de los genes neuroprotectores y compuestos 2,3.

Pantallas en eucariotas inferiores como C. elegans proporcionan un medio eficiente y económico para identificar compuestos y genes que afectan a la señalización neuronal. Pantallas convencionales se realizan típicamente de forma manual y marcados por inspección visual y, en consecuencia, son el tiempo-contrasUming y propenso a errores humanos. Además, la mayoría se centran en el análisis de nivel celular, mientras que haciendo caso omiso de la locomoción, que es un parámetro especialmente importante para los trastornos del movimiento.

Hemos desarrollado un nuevo sistema de selección de microfluidos (Figura 1) que controla y cuantifica C. locomoción elegans 'utilizando estímulos de campo eléctrico en el interior de microcanales. Hemos demostrado que un campo de corriente continua (CC) puede inducir robustamente en-demanda locomoción hacia el cátodo ("electrotaxis") 4. Invertir la polaridad del campo hace que el tornillo sin fin de revertir rápidamente su dirección. También hemos demostrado que los defectos en las neuronas sensoriales y dopaminérgicas otra alteran la respuesta de natación 5. Por lo tanto, las anormalidades en la señalización neuronal se puede determinar utilizando la locomoción como una lectura de salida. La respuesta del movimiento se puede cuantificar con precisión mediante una serie de parámetros tales como la velocidad de natación, frecuencia de flexión cuerpo y el tiempo de reversión.

4. Estos hallazgos llevaron a diseñar un nuevo dispositivo de microfluidos para ordenar pasivamente gusanos por la edad y el fenotipo 6.

También hemos puesto a prueba la respuesta de los gusanos a impulsos DC y alterna los campos eléctricos de corriente (AC). Campos de CC pulsada de diversos ciclos de trabajo efectivamente electrotaxis generados en tanto C. elegans y su primo C. briggsae 7. En otro experimento, los campos de CA simétricas con frecuencias que van desde 1 Hz a 3 KHz inmovilizados gusanos en el interior del canal 8.

Aplicación del campo eléctrico en un entorno microfluídico permite una ejecución rápida y automatizada del ensayo electrotaxis. Este enfoque promete para facilitar pantallas genéticas y químicas de alto rendimiento para los factoresque afecta a la función neuronal y la viabilidad.

Protocol

1. La fotolitografía de fabricación Molde Maestro

  1. Bañar una oblea de silicio de 3 pulgadas en acetona durante 30 segundos y después metanol durante 30 segundos. Enjuague con dH 2 0 agua durante 5 minutos.
  2. Seque la superficie de la oblea con una pistola de aire comprimido N2. Se calienta la oblea en una placa caliente a 140 ° C durante 2 min.
  3. Plasma oxidar la superficie de la oblea de silicio (1 min, 50 W).
  4. Spin-capa de la superficie de la oblea con 3 ml SU-8 100 fotosensible (40 seg; 1.750 rpm).
  5. Pre-hornear la oblea recubierta sobre una placa caliente a 65 ° C durante 10 min, a continuación, la rampa la temperatura hasta 95 ° C durante 2 min. Mantener esta configuración durante 1 h adicional.
  6. Alinear una fotomáscara con el diseño de canal deseado. Exponer al resistirse a 550-600 mJ / cm 2 de la luz UV (350-400 nm). Photomasks se pueden diseñar en AutoCAD y se imprimen en una transparencia con la impresión de alta resolución.
  7. Post-hornear la oblea en una placa caliente a 65 ° C durante 1 min y 95 ° C durante 10 min, el aumento gradual de tque la temperatura que antes.
  8. Sumerja la oblea de SU-8 solución de revelado durante 10-15 min. Compruebe la finalización del desarrollo de un enjuague con isopropanol. Si aparece un precipitado blanco, continuar con el desarrollo. El molde maestro se muestra en la Figura 2A.

2. Litografía blanda para Fabricación Microchannel

  1. Mezclar 35 ml de polidimetilsiloxano (PDMS) con base de elastómero de 3,5 ml de agente de curado PDMS.
  2. Coloque el molde maestro fabricada (patrón hacia arriba) y una oblea de silicio en blanco en placas de Petri llenas de papel de aluminio.
  3. Verter 20 ml PDMS prepolímero en el plato de molde maestro y 15 ml en el segundo plato. Eliminar las burbujas de aire debajo de las obleas presionando suavemente con un aplicador de madera desechable.
  4. Cubra ambos platos y dejar de lado por un día para curar. Alternativamente, para el curado más rápido, eliminar las burbujas de aire de la PDMS con un desgasificador de vacío y luego dejar los platos en una placa caliente a 80 ° C durante 2hora
  5. Quite el papel de aluminio y la cáscara de la PDMS de las obleas.
  6. Utilice la Harris Uni-Core (2,5 mm) para perforar los puertos de acceso de fluidos en ambos extremos del canal. Cortar el canal y en blanco PDMS en tiras de tamaño similar.
  7. Cargar el canal, la tira de PDMS en blanco y un portaobjetos de vidrio (75 × 25 mm 2) en un plasma oxidante, probablemente situado en una sala limpia. Exponer al plasma de oxígeno durante 40 segundos a potencia 40 W.
  8. Pegar la pieza del canal y portaobjetos de vidrio a los lados opuestos de la tira en blanco. Ponga a un lado durante 2 horas para completar la unión.
  9. Coloque el conjunto sobre una placa caliente a 120 ° C. Conecte el tubo de plástico (diámetro interior de 1/32 ", diámetro exterior de 3/32"), cada uno por lo menos 6 pulgadas de largo, a los depósitos perforados utilizando PDMS prepolímero. Fije un conector de plástico fluídico a uno o ambos tubos para permitir la fijación jeringa, o utilizar accesorios disponibles comercialmente.
  10. Permitir el PDMS asegurar el tubo para curar. Inserte 3 "longitudes de calibre 22 alambre de cobre aislado en each depósito, entre el tubo de entrada y el canal, y seguro con PDMS prepolímero. El producto terminado se muestra en la Figura 2B.

3. Electrotaxis Experiment

  1. Coloque el microcanal en la etapa (preferiblemente XY-móvil) de un microscopio con una cámara montada conectado a un monitor (Figura 1).
  2. Conecte la fuente de alimentación o cables de salida del amplificador a los electrodos del microcanal. Una fuente de alimentación de CC simple es suficiente si sólo se desea una señal de CC, pero un amplificador conectado a un generador de funciones permite la aplicación de señales de CA y CC pulsada así.
  3. Fije el tubo de salida del microcanal a una jeringa desechable. Sumergir la boca del tubo de entrada en tampón fisiológico M9 y suavemente aspiran líquido en el canal mediante la aplicación de una presión negativa dentro de la jeringa (ya sea manualmente o usando una bomba de jeringa). Cuando los tubos de entrada y de salida son a la vez lleno de M9, desconecte la jeringa fROM del tubo. Nivel ambos tubos a la misma altura para evitar el flujo accionado hidrostáticamente.
  4. Aplicar un voltaje de CC para el canal y garantizar que la resistencia (R = V / I) es de alrededor de 0,6 mW (para una 50 mm de largo, 0,3 mm de ancho y 0,1 mm ~ microcanal profundo).
  5. Si está satisfecho con la integridad de la cadena, siga los pasos anteriores para cargar los gusanos de una suspensión diluida en el canal.
  6. Desconecte la jeringa y hidrostáticamente manipular el flujo mediante el ajuste de altura relativa de los tubos. Utilice este método para colocar un tornillo sin fin en el centro del canal y a continuación, establecer ambos tubos plana a la misma elevación.
  7. Establecer la fuente de alimentación a la tensión apropiada: 4-12 V / cm para L3 animales etapa, 4-10 V / cm para L4s, y 2-4 V / cm para los adultos jóvenes. Active la señal eléctrica y deje 1 min de pre-exposición para el gusano para aclimatarse al campo. El gusano debería comenzar a moverse hacia el cátodo. Cuando el momento ha pasado, usar la cámara para comenzar a grabar.
  8. Para CA y pulsod experimentos DC, el campo eléctrico máximo de respuesta puede ser adoptado de ciclo de la señal anterior y la frecuencia y actividad puede ser modulada deseada como 7, 8.
  9. Una vez finalizada experimento, eliminar todo el líquido (y gusanos) de la canal, enjuagarlo con dH 2 0, y dejar el dispositivo en una placa caliente a 125 ° C para secar.
  10. Extraer datos de locomoción de los vídeos grabados utilizando manualmente NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) o software de seguimiento del gusano MATLAB basado personalizado.

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Representative Results

Un representante de vídeo electrotaxis una de tipo salvaje joven de nematodos adultos y su posición y salidas de velocidad desde el software de seguimiento de gusano se muestran en la complementaria de vídeo 1 y la Figura 3. El software de análisis de movimiento en sí mismo no reconoce la dirección de la polaridad de campo y el momento de la inversión de la polaridad; más bien, esta información se debe obtener de la fuente de vídeo. Esto se podría hacer utilizando una señal de audio o visual en el vídeo o la escritura se establecen las condiciones experimentales y manipulaciones.

Datos de velocidad electrotaxis de un conjunto de animales de tipo salvaje (N2) y transgénicos (NL5901) se muestran en la Figura 4. Los NL5901 animales llevan gen α-sinucleína humana bajo el control de unc-54 (gen de la cadena pesada de miosina) promotor. El expresó α-sinucleína en el cuerpo músculos de la pared agregados 9 y nuestros resultados muestran que causa anomalías en la elecrespuesta trotactic. La velocidad de NL5901 gusanos es significativamente más lenta que la de tipo salvaje. Para trazar la gráfica, se calculó la velocidad de gusanos individuales y trazan los resultados en un gráfico de caja utilizando el software estadístico Minitab ( http://www.minitab.com ). Además de la velocidad, otros parámetros de movimiento, tales como la respuesta de torneado (tiempo necesario para completar la inversión en respuesta a cambio de polaridad del campo eléctrico) y la frecuencia de flexión cuerpo (número medio de ondas sinusoidales por segundo), también puede ser analizada como se describe en otro lugar 5.

El protocolo electrotaxis funciona mejor con una población sincronizada, que se puede obtener a través de tratamiento con una solución de lejía (hipoclorito de sodio y 4 N de hidróxido de sodio en una relación en volumen 02:03) 10. Todos los datos aquí presentados se obtuvieron de poblaciones sincronizados para descartar la variación con la edad y la etapa dependiente. Aunque hemos utilizado los adultos jóvenes (de 69 horas después de la L1 en200C), otras etapas (L2 en adelante) también puede ser probado.

Figura 1
Figura 1. Esquema de la plataforma de control de microfluidos para el ensayo electrotaxis nematodos. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2
Figura 2. Maestro molde (A) y totalmente montado PDMS dispositivo de microcanal (B).

Figura 3
Figura 3. Posición frente al tiempo (A) y la velocidad instantánea (B) salidas de programa de seguimiento de gusano de encargo. Sourvídeo ce es complementario Video 1 a continuación. El programa calcula la curva de velocidad de la curva de posición-tiempo, pero no tiene en cuenta los picos en el cálculo de la velocidad media.

Figura 4
La Figura 4. Electrotaxis velocidad de N2 de control de tipo salvaje y gusanos NL5901 transgénicos. NL5901 gusanos son significativamente más lento que el de control con p> 0,0001. Importancia se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney no paramétrica. n = 10 para el N2 y n = 23 para NL5901.

Complementario Video 1. Electrotactic comportamiento de los jóvenes adultos de nematodos en un canal de microfluidos. Vídeo comienza con el cátodo a la derecha. Aparición de una pipeta de vidrio indica inminente inversión de polaridad y la eliminación posterior de las señales de pipeta momento de la reversión. Haz clic aquí para ver lapelícula.

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Discussion

Aprovechando el fenómeno de comportamiento descrito por primera vez por Gabel y sus colegas y basándose en el trabajo de manipulación dielectroforética de Chuang et al 11,12, nuestro ensayo electrotaxis microfluidos basada en un método sencillo, robusto y sensible para investigar la actividad neuronal en los gusanos que utilizan el movimiento como una salida. El análisis de los parámetros de movimiento permite la comparación cuantitativa entre diferentes genotipos. La precisión de la fabricación de microcanal y la aplicación del campo eléctrico en conjunto proporcionan tanto un entorno controlable y un medio para comunicarse con el tornillo sin fin para el control de la locomoción. Diferentes formas de onda de señales eléctricas tienen diferentes reflexiones de comportamiento en el tornillo sin fin y se han utilizado para estimular y tanto inhibir la locomoción.

El diseño de un solo canal de la presente dispositivo de microfluidos requiere que sólo un único tornillo sin fin se obtuvo a la vez. Para esto, solución gusano debe diluir lo suficiente con M9búfer antes de intentar cargar los gusanos en el canal. Es importante señalar que las operaciones de los canales puede ser complicado por la presencia de burbujas de aire y otras irregularidades que afectan a la presión hidrostática. Esto podría ser eliminado por lavado el canal con M9 y la manipulación de la elevación de los tubos de entrada y salida.

El ensayo descrito aquí se puede mejorar aún más. Un chip de microfluidos multicanal podría acelerar la detección gusano, aunque requerirá la integración de otros mecanismos de control, tales como la carga de gusano, de posicionamiento y de seguimiento. Además la automatización del protocolo electrotaxis, especialmente la gestión del flujo controlado por ordenador, se incrementará la eficiencia. Estas mejoras se están desarrollando actualmente en nuestro laboratorio.

La extracción de los datos de locomoción a partir de vídeos electrotaxis originalmente se lleva a cabo manualmente usando ImageJ, que es un proceso lento y tedioso. Para aumentar la eficiencia y eliminar hUman error, hemos empezado a utilizar un programa de seguimiento de gusano adaptado de un paquete original basada en MATLAB desarrollado en el Instituto de Tecnología de California 13. El software procesa actualmente vídeos solo gusano. La versión más reciente es adecuado para una amplia gama de ensayos que incluyen gusanos tratadas químicamente y neuronales y mutantes musculares. Una de sus limitaciones es que reversiones espontáneas, observados en ciertos mutantes neuronales (por ejemplo, OSM-5) 5, no se interpretan correctamente. Tales gusanos deben ser analizados manualmente.

Limitaciones a pesar, electrotaxis microfluidos pueden aplicarse en innumerables contextos, incluyendo ensayos de descubrimiento de fármacos con modelos gusano de trastornos relacionados con el movimiento. Teniendo en cuenta su susceptibilidad a la paralelización, electrotaxis está particularmente bien adaptado para las aplicaciones de cribado de alto rendimiento. El análisis genético y dependiente de la edad de la conducta electrotactic y la degeneración neuronal también puede ser estudiada con estesistema. Además, los gusanos pueden ser ordenadas por edad o fenotipo para formar muestras sincronizadas o identificar nuevos mutantes para las pantallas adelante genéticos 6,14.

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Disclosures

El ensayo de la tecnología de microfluidos electrotaxis ha sido presentada por patente en los Estados Unidos de América y Canadá.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a las Ciencias Naturales e Ingeniería del Consejo de Investigación de Canadá, Canadá Programa de Cátedras de Investigación, Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Ontario Ministerio de Investigación e Innovación a través de su Programa de Premios investigadores temprana de apoyo financiero.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone CALEDON Labs 1200-1-30
Methanol CALEDON Labs 6700-1-30
Isopropanol CALEDON Labs 8600-1-40
SU-8 Microchem Corp. Y131273 SU-8 100
SU-8 Developer Microchem Corp. Y020100
92x16mm Petri Dish Sarstedt 82.1473.001
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Contains elastomer base and curing agent
Function generator Tektronix Inc. Model AFG3022B
Amplifier Trek Inc. Model 2210-CE
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4506 Model 11 ELITE
Hotplate Fisher Scientific 11675916Q Model HP131725Q

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References

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Tong, J., Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion. J. Vis. Exp. (75), e50226, doi:10.3791/50226 (2013).

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