Summary
Procédé de micro-électro-fluidique semi-automatisé pour induire à la demande dans la locomotion
Abstract
Les Caenorhabditis elegans nématode est un modèle polyvalent organisme pour la recherche biomédicale en raison de sa conservation de gènes et les voies liées à la maladie ainsi que sa facilité de culture. Plusieurs C. modèles de maladies elegans ont été signalés, y compris les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (PD), ce qui implique la dégénérescence des dopaminergiques (DA) des neurones 1. Les deux transgènes et des produits chimiques neurotoxiques ont été utilisés pour induire DA neurodégénérescence et les anomalies de mouvement conséquente vers, permettant des enquêtes sur la base de la neurodégénérescence et les écrans des gènes et des composés 2,3 neuroprotecteurs.
Écrans chez les eucaryotes inférieurs comme C. elegans fournir un moyen efficace et économique pour identifier les composés et les gènes affectant la signalisation neuronale. Écrans classiques sont généralement effectuées manuellement et marqués par inspection visuelle, par conséquent, ils sont contre-tempsuming et sujettes à des erreurs humaines. En outre, la plupart se concentrent sur l'analyse du niveau cellulaire tout en ignorant locomotion, qui est un paramètre particulièrement important pour les troubles du mouvement.
Nous avons développé un système de criblage microfluidique roman (Figure 1) qui contrôle et quantifie C. La locomotion elegans de l'aide stimuli de champ électrique à l'intérieur de microcanaux. Nous avons montré qu'un champ courant continu (CC) peut induire robuste sur demande locomotion vers la cathode ("électrotaxie") 4. Inversion de polarité du champ entraîne le ver à inverser rapidement la direction ainsi. Nous avons également montré que les défauts dans les neurones sensoriels et d'autres dopaminergiques modifier la réponse de natation 5. Par conséquent, des anomalies dans la signalisation neuronale peuvent être déterminées en utilisant locomotion comme une lecture. La réponse du mouvement peut être quantifiée avec précision en utilisant une gamme de paramètres tels que la vitesse de nage, le corps fréquence de flexion et temps d'inversion.
4. Ces résultats nous ont amenés à concevoir un nouveau dispositif microfluidique pour trier passivement vers l'âge et le phénotype 6.
Nous avons également testé la réponse des vers à impulsions DC et courant alternatif champs électriques (AC). Champs continus pulsés de différents cycles efficacement électrotaxie générés à la fois C. elegans et sa cousine C. briggsae 7. Dans une autre expérience, symétriques champs AC avec des fréquences allant de 1 Hz à 3 kHz immobilisés vers l'intérieur du canal 8.
Mise en oeuvre du champ électrique dans un environnement microfluidique permet une exécution rapide et automatique du dosage électrotaxie. Cette approche promet de faciliter les écrans génétiques et chimiques à haut débit pour les facteursaffectant la fonction neuronale et la viabilité.
Protocol
1. Photolithographie pour Mold Maître Fabrication
- Baigner un 3 pouces plaquette de silicium dans de l'acétone pendant 30 sec, puis le méthanol pendant 30 sec. Rincer avec dH 2 0 eau pendant 5 min.
- Sécher la surface de la plaquette avec un pistolet à air de N2. Chauffer la tranche sur une plaque chauffante à 140 ° C pendant 2 min.
- Plasma oxyder la surface de la tranche de silicium (1 min, 50 W).
- Spin-coat surface de la plaquette avec 3 ml SU-8 100 photosensible (40 sec; 1,750 rpm).
- Pré-cuire la plaquette revêtue sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 10 min, puis la rampe la température jusqu'à 95 ° C en 2 minutes. Maintenir ce réglage pour un montant supplémentaire de 1 h.
- Aligner un masque photographique contenant la conception du canal désiré. Exposer la résister à 550-600 mJ / cm 2 de lumière UV (350-400 nm). Masques peuvent être conçus dans AutoCAD et imprimés sur un transparent avec impression haute résolution.
- Post-cuire la galette sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 1 min et 95 ° C pendant 10 min, rampe til température comme avant.
- Plonger la plaquette dans la solution de révélateur SU-8 pendant 10-15 min. Vérifiez achèvement du développement d'un rinçage avec de l'isopropanol. Si un précipité blanc apparaît, continuer à développer. Le moule maître est représenté sur la figure 2A.
2. Lithographie douce pour Fabrication Microchannel
- Mélanger 35 ml de polydiméthylsiloxane (PDMS) de la base d'élastomère avec 3,5 ml PDMS agent de durcissement.
- Placez le moule maître fabriqué (modèle vers le haut) et une plaquette de silicium vierge dans des boîtes de Pétri recouverte de papier d'aluminium.
- Verser 20 ml prépolymère PDMS dans le plat du moule maître et de 15 ml dans le second plat. Éliminer les poches d'air sous les plaquettes en appuyant doucement sur eux avec un applicateur jetable en bois.
- Couvrir les deux plats et mettre de côté pour un jour à guérir. Sinon, pour un durcissement plus rapide, éliminer les bulles d'air du PDMS en utilisant un dégazeur à vide et ensuite laisser les plats sur une plaque chauffante à 80 ° C pendant 2hr.
- Retirez le film et le zeste du PDMS à partir des plaquettes.
- Utilisez le Harris Uni-Core (2,5 mm) pour percer des orifices d'accès de fluide aux deux extrémités de la chaîne. Couper le canal et blanc PDMS en bandes de taille similaire.
- Charger le canal, la bande ébauche PDMS et d'une lame de verre (75 x 25 mm 2) dans un dispositif d'oxydation par plasma, probablement situé dans une salle blanche. Exposer à un plasma d'oxygène pendant 40 secondes à 40 W de puissance.
- Coller le morceau de canal et lame de verre à faces opposées de la bande ébauche. Mettez de côté pendant 2 heures pour achever le collage.
- Placez l'ensemble sur une plaque chauffante à 120 ° C. Fixer le tube en plastique (diamètre intérieur 1/32 ", diamètre extérieur de 3/32"), chacun au moins 6 po de long, les réservoirs percés à l'aide de PDMS prépolymère. Fixer un raccord en plastique fluidique à un ou deux tubes pour permettre la fixation de la seringue, ou utiliser des raccords disponibles dans le commerce.
- Laisser le PDMS fixer le tube à guérir. Insérez 3 "longueurs de calibre 22 fil de cuivre isolé dans each réservoir, entre le tube d'admission et le canal, et sûr PDMS prépolymère. Le produit fini est illustré à la figure 2B.
3. Électrotaxie Experiment
- Placer le microcanal sur la scène (de préférence XY mobile) d'un microscope avec une caméra montée reliée à un moniteur (Figure 1).
- Connectez l'alimentation ou les fils de sortie de l'amplificateur à des électrodes de la microcanaux. Une alimentation CC simple est suffisant, si seulement un signal de courant continu est souhaité, mais un amplificateur connecté à un générateur de fonction permet à l'application de courant continu à impulsions et des signaux alternatifs de même.
- Fixer le tuyau de sortie du micro-canal à une seringue jetable. Immerger l'embouchure du tube d'entrée dans un tampon physiologique, M9 et doucement aspirer du liquide dans le canal par application d'une pression négative à l'intérieur de la seringue (soit manuellement, soit en utilisant une pompe à seringue). Lorsque les tubes d'entrée et de sortie sont tous deux remplis de M9, déconnecter la seringue from le tube. Niveler les deux tubes à la même hauteur pour empêcher l'écoulement hydrostatique entraînée.
- Appliquer une tension de courant continu sur le canal et faire en sorte que la résistance (R = U / I) est d'environ 0,6 MQ (pour une longueur de 50 mm, 0,3 mm de largeur et d'environ 0,1 mm de profondeur à microcanaux).
- S'il est satisfait de l'intégrité de la chaîne, suivez les étapes ci-dessus pour charger les vers d'une suspension diluée dans le canal.
- Déconnecter la seringue et hydrostatique manipuler le flux de réglage de la hauteur par rapport aux tubes d'. Utilisez cette méthode pour mettre un ver dans le centre du chenal et puis posez les deux tubes plats à la même altitude.
- Régler l'alimentation sur la tension appropriée: 4-12 V / cm pour les animaux de scène L3, 4-10 V / cm pour L4s et 2-4 V / cm pour les jeunes adultes. Activez le signal électrique et permettre 1 min de pré-exposition pour le ver de s'acclimater au terrain. Le ver devrait commencer à se déplacer vers la cathode. Lorsque la minute est passée, utiliser l'appareil photo pour commencer l'enregistrement.
- Pour AC et le poulsd expériences DC, le champ électrique en réponse au maximum peut être adoptée de cycle du signal ci-dessus et de la fréquence et de service peuvent être modulées à volonté 7, 8.
- Quand l'expérience est terminée, retirer tout le liquide (et vers) du canal, le rincer avec dH 2 0, et laisser l'appareil sur une plaque chauffante à 125 ° C pour sécher.
- Extraire des données locomotrices de vidéos enregistrées manuellement à l'aide NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou un logiciel de suivi de ver MATLAB basée personnalisé.
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Representative Results
Une vidéo représentant des électrotaxie d'un type sauvage jeune adulte nématodes et de sa position et sorties de la vitesse du logiciel de suivi du ver sont présentés dans la vidéo supplémentaire 1 et la Figure 3. Le logiciel d'analyse de mouvement lui-même ne reconnaît pas le sens de la polarité du champ et le moment de l'inversion de polarité, mais plutôt, cette information doit être obtenue à partir de la source vidéo. Cela pourrait être fait en utilisant un signal sonore ou visuel dans la vidéo ou l'écriture des conditions expérimentales et des manipulations.
Données de vitesse électrotaxie à partir d'un ensemble d'animaux de type sauvage (N2) et transgéniques (NL5901) sont affichés dans la figure 4. Les NL5901 animaux portent gène α-synucléine humaine sous le contrôle d'unc-54 (gène de la chaîne lourde de la myosine) promoteur. Le exprimé α-synucléine dans le corps muscles mur agrégats 9 et nos résultats montrent qu'il provoque des anomalies dans l'électionréponse trotactic. La vitesse de NL5901 vers est nettement plus lent que le type sauvage. Pour tracer le graphique, nous avons calculé la vitesse de Pandore individuels et tracés résultats dans une boîte à moustaches aide d'un logiciel statistique Minitab ( http://www.minitab.com ). En plus de la vitesse, d'autres paramètres de mouvement, comme l'intervention de rotation (temps nécessaire pour achever la reprise en réponse au changement de polarité du champ électrique) et le corps fréquence de flexion (nombre moyen d'ondes sinusoïdales par seconde), peut également être analysé comme décrit ailleurs 5.
Le protocole électrotaxie fonctionne mieux avec une population synchronisée, qui peut être obtenu par traitement avec une solution d'eau de Javel (hypochlorite de sodium et 4 N d'hydroxyde de sodium dans un rapport en volume de 02:03) 10. Toutes les données présentées ici ont été obtenues à partir de populations synchronisées pour écarter la variation de l'âge et du stade-dépendante. Alors que nous avons utilisé les jeunes adultes (69 h post-L1 à200C), d'autres étapes (L2 delà) peut également être testé.
Figure 1. Schéma de plate-forme de criblage microfluidique pour l'analyse de électrotaxie de nématodes. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Dispositif microcanal PDMS de moule principal (A) et entièrement assemblé (B).
Figure 3. Position par rapport au temps (A) et la vitesse instantanée (B) sorties du programme de suivi du ver de coutume. SourCE vidéo est une vidéo supplémentaire 1 ci-dessous. Le programme calcule la courbe de vitesse à partir de la courbe poste à temps mais ne tient pas compte des pointes lors du calcul de la vitesse moyenne.
Figure 4. Vitesse électrotaxie de N2 de contrôle de type sauvage et les vers NL5901 transgéniques. NL5901 vers sont nettement plus lent que le contrôle avec p> 0,0001. Elle est déterminée en utilisant le test de Mann-Whitney non paramétrique. n = 10 pour les N2 et n = 23 pour NL5901.
Vidéo supplémentaire 1. comportement Electrotactic de jeune nématode adulte dans un canal microfluidique. Vidéo commence avec la cathode vers la droite. Apparition de pipette en verre indique l'inversion de polarité imminente; l'élimination ultérieure des signaux pipette moment de renversement. Cliquez ici pour voirfilm.
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Discussion
Profitant du phénomène comportemental d'abord décrit par Gabel et ses collègues et en s'appuyant sur le travail de manipulation diélectrophorétique de Chuang et ses collègues 11,12, notre test de électrotaxie microfluidique à base offre une méthode simple, robuste et sensible pour sonder l'activité neuronale dans les vers utilisant le mouvement comme une sortie. L'analyse des paramètres de mouvement permet une comparaison quantitative entre les différents génotypes. La précision de fabrication de microcanaux et l'application du champ électrique ainsi fournir un environnement contrôlable à la fois et un moyen de communication avec la vis sans fin pour le contrôle de la locomotion. Différentes formes d'ondes de signaux électriques ont des reflets de comportement chez le ver et ont été utilisés à la fois à stimuler et à inhiber la locomotion.
La conception unique canal du dispositif microfluidique présente nécessite qu'un seul ver être marqué à la fois. Pour cela, une solution de ver doit être suffisamment dilué avec M9mémoire tampon avant d'essayer de charger des vers dans le canal. Il est important de souligner que les opérations de canal peuvent être compliqués par la présence de bulles d'air et autres irrégularités affectant la pression hydrostatique. Ceci a pu être éliminé par rinçage du canal avec M9 et la manipulation de l'élévation de l'orifice d'entrée et les tubes de sortie.
L'essai décrit ici peut encore être amélioré. Une puce microfluidique multi-canal pourrait accélérer le dépistage du ver, même si elle nécessitera l'intégration d'autres mécanismes de contrôle tels que le ver chargement, le positionnement et le suivi. Poursuite de l'automatisation du protocole électrotaxie, en particulier la gestion des flux contrôlé par ordinateur, permettra d'accroître l'efficacité. Ces améliorations sont en cours de développement dans notre laboratoire.
Extraction des données de locomotion de électrotaxie vidéos a été réalisée manuellement en utilisant ImageJ, qui est un processus lent et fastidieux. Pour accroître l'efficacité et d'éliminer hUman erreur, nous avons commencé à utiliser un programme de suivi de ver adapté d'un package MATLAB basée originale développée à l'Institut de Technologie de Californie 13. Le logiciel traite actuellement vidéos mono-ver. La dernière version est adapté à une large gamme d'essais, y compris les vers traités chimiquement et neuronales et mutants musculaires. Un de ses limitations est que les inversions spontanées observées dans certains mutants neuronales (par exemple, OSM-5) 5, ne sont pas interprétés correctement. Ces vers doivent être analysées manuellement.
Limitations nonobstant, électrotaxie microfluidiques peuvent être appliqués dans des contextes multiples, y compris des tests de découverte de médicaments avec des modèles de ver de troubles liés au mouvement. Compte tenu de sa susceptibilité à la parallélisation, électrotaxie est particulièrement bien adapté pour les applications de criblage à haut débit. L'analyse génétique et dépend de l'âge de comportement electrotactic et la dégénérescence neuronale peut également être étudiée avec cettesystème. En outre, les vers peuvent être triés par âge ou le phénotype pour former des échantillons synchronisés ou d'identifier de nouveaux mutants pour les écrans avant génétiques 6,14.
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Disclosures
La technologie d'analyse électrotaxie microfluidique a été déposé de brevet aux États-Unis d'Amérique et le Canada.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les sciences naturelles et en génie de recherches du Canada, Programme des chaires de recherche du Canada, Instituts de recherche en santé du Canada et le ministère de la Recherche et de l'Innovation de l'Ontario par l'entremise de leur Programme de bourses des chercheurs pour un soutien financier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
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