Summary
En semi-automatiseret MikroElektroMekaniske strømningsteknisk metode til at inducere on-demand bevægelse i
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans er en alsidig model organisme til biomedicinsk forskning på grund af sin bevarelse af sygdomsrelaterede gener og stier samt dets lethed til dyrkning. Adskillige C. elegans sygdomsmodeller er blevet rapporteret, herunder neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom (PD), hvilket indebærer degeneration af dopaminerge (DA) neuroner 1.. Både transgener og neurotoksiske kemikalier er blevet anvendt til at inducere DA neurodegeneration og deraf bevægelse defekter i orme, der giver mulighed for undersøgelser grundlag af neurodegeneration og skærme til neurobeskyttende gener og forbindelser 2,3.
Skærme i lavere eukaryoter som C. elegans giver en effektiv og økonomisk middel til at identificere forbindelser og gener påvirker neuronal signalering. Konventionelle skærme er typisk udføres manuelt, og scorede ved visuel inspektion, hvorfor de er tid-consuming og tilbøjelige til menneskelige fejl. Derudover fleste fokuserer på celleniveau analyse samtidig ignorerer bevægelse, hvilket er en særlig vigtig parameter for bevægelsesforstyrrelser.
Vi har udviklet en ny mikrofluid screening (figur 1), der styrer og kvantificerer C. elegans 'bevægelse ved hjælp af elektrisk felt stimuli inde microchannels. Vi har vist, at en jævnstrøm (DC) felt robust kan fremkalde on-demand bevægelse mod katoden ("electrotaxis") 4.. Vende feltets polaritet forårsager ormen til hurtigt ændre sin retning. Vi har også vist, at defekter i dopaminerge og andre sensoriske neuroner ændrer svømning respons 5.. Derfor kan abnormaliteter i neuronal signalering bestemmes ved hjælp af bevægelse som en read-out. Bevægelsen respons kan præcist kvantificeres ved hjælp af en række parametre, såsom svømning hastighed, krop bøjning frekvens og tilbageførsel tid.
4.. Disse fund førte os til at designe en ny mikrofluid enhed til passivt at sortere orme efter alder og fænotype 6..
Vi har også testet reaktion orme til pulserende DC og vekselstrøm (AC) elektriske felter. Impuls DC marker med forskellige driftscyklusser effektivt genererede electrotaxis i både C. elegans og dens fætter C. briggsae 7.. I et andet eksperiment, immobiliseret symmetriske AC felter med frekvenser fra 1 Hz til 3 KHz orme inde i kanalen 8.
Gennemførelsen af det elektriske felt i en mikrofluid miljø giver mulighed for hurtig og automatiseret udførelse af electrotaxis analysen. Denne fremgangsmåde lover at lette high-throughput genetiske og kemiske skærme til faktorerpåvirker neuronal funktion og levedygtighed.
Protocol
1.. Fotolitografi for Master Mold Fabrication
- Bade en 3 i. silicium wafer i acetone i 30 sekunder og derefter methanol i 30 sek. Skyl med dH 2 0 vand i 5 min.
- Tør wafer overflade med en N2 slag pistol. Varm wafer på en varmeplade ved 140 ° C i 2 minutter.
- Plasma oxidere overfladen af silicium wafer (1 min, 50 W).
- Spin-coat wafer overflade med 3 ml SU-8 100 fotoresist (40 sek 1.750 rpm).
- Pre-bage det coatede wafer på en varm plade ved 65 ° C i 10 minutter, rampe derefter temperaturen op til 95 ° C i løbet af 2 min. Oprethold denne indstilling til yderligere 1 time.
- Juster en fotomaske indeholdende den ønskede kanal design. Udsætte modstå 550-600 mJ / cm 2 af UV-lys (350-400 nm). Fotomasker kan designes i AutoCAD og udskrives på en transparent med høj opløsning udskrivning.
- Post-bage skiven på en varm plade ved 65 ° C i 1 minut og 95 ° C i 10 min, ramping tHan temperatur som før.
- Fordyb wafer i SU-8 developer løsning til 10-15 min. Check for færdiggørelsen af udviklingsarbejdet ved skylning med isopropanol. Hvis en hvid bundfald, fortsætte med at udvikle. Den mastermodel er vist i figur 2A.
2.. Soft Litografi for mikrokanalplade Fabrication
- Bland 35 ml polydimethylsiloxan (PDMS) elastomer base med 3,5 ml PDMS hærder.
- Placer fabrikerede mastermodel (mønster opad) og en tom silicium wafer i petriskåle foret med aluminiumsfolie.
- Hæld 20 ml PDMS præpolymer i master mug fad og 15 ml i den anden skål. Eliminer luftlommer nedenunder wafers ved forsigtigt at trykke på dem med en engangs træ applikator.
- Dæk begge retter, og der er afsat til en dag til at helbrede. Alternativt, for hurtigere hærdning, fjerne luftbobler fra PDMS ved hjælp af en vakuum afgasningsmiddel og derefter forlade retterne på en varm plade ved 80 ° C i 2time.
- Fjern folien og træk PDMS fra wafers.
- Brug Harris Uni-Core (2,5 mm) til punch væske adgangsporte i begge ender af kanalen. Skær kanalen og blank PDMS ind samme størrelse strimler.
- Indlæse kanal, emnet PDMS strimler og et objektglas (75 × 25 mm 2) i en plasma-oxidationsmiddel, sandsynligvis placeret i et renrum. Udsættes for ilt plasma i 40 sek ved 40 W strøm.
- Stick kanal stykke og objektglas til modstående sider af emnet strimmel. Braklægning i 2 timer for at fuldføre limning.
- Placer samlingen på en varm plade ved 120 ° C. Fastgør plastslange (indvendig diameter 1/32 ", ydre diameter 3/32"), hver mindst 6 tommer lang, at de udstansede reservoirer med PDMS præpolymer. Anbringe et fluidisk plastik stik til den ene eller begge rør for at tillade sprøjte vedhæftet fil eller benytte kommercielt tilgængelige fittings.
- Tillad PDMS fastgørelse af slangen til at helbrede. Sæt 3 "længder af 22 gauge isoleret kobbertråd ind ØKh reservoir, mellem indløbsrøret og kanalen, og sikkert med PDMS præpolymer. Det færdige produkt er vist i figur 2B.
3.. Electrotaxis Experiment
- Placer mikrokanalplade på scenen (fortrinsvis XY-bevægelig) i et mikroskop med en monteret kamera forbundet til en monitor (figur 1).
- Tilslut strømforsyningen eller forstærkerens output ledningerne til mikrokanalplader elektroder. En simpel DC strømforsyning er tilstrækkeligt, hvis kun en DC-signal ønskes, men en forstærker forbundet til en funktion generator tillader anvendelse af pulserende DC og AC signaler så godt.
- Fastgør mikrokanalplade output rør til en engangssprøjte. Sænk mundingen af indløbsrøret i M9 fysiologisk buffer og forsigtigt stræber væske i kanalen ved at påføre et negativt tryk inde i sprøjten (enten manuelt eller ved hjælp af en sprøjtepumpe). Når ind-og udløb rør er begge fyldt med M9, fjernes sprøjten from røret. Niveau begge rør til den samme højde for at forhindre hydrostatisk drevet flow.
- Anvende en DC spænding til den kanal og sikre, at modstanden (R = V / I) er omkring 0,6 MOhm (for en 50 mm lang, 0,3 mm bred og ~ 0,1 mm dyb mikrokanalplade).
- Hvis tilfreds med kanalens integritet, følge ovenstående trin for at lægge orme fra en fortyndet suspension i kanalen.
- Afbryd sprøjten og hydrostatisk manipulere flowet ved at justere rørene relative højde. Brug denne metode til at placere en orm i midten af kanalen og derefter lægge begge rør fladt på samme højde.
- Sæt strømforsyningen til den rette spænding: 4-12 V / cm til L3 stage dyr, 4-10 V / cm for L4S og 2-4 V / cm for unge voksne. Aktivere det elektriske signal og tillader 1 min før eksposition for ormen at akklimatisere til feltet. Ormen skal begynde at bevæge sig mod katoden. Når minut er gået, skal du bruge kameraet til at starte optagelsen.
- Til AC og pulsd DC eksperimenter, kan den maksimale lydhør elektriske felt skal vedtages fra oven og hyppighed og duty cycle af signalet kan moduleres som ønsket 7, 8.
- Når eksperimentet er færdig, skal du fjerne al væske (og orme) fra kanalen, skyl den med dH 2 0, og lad enheden på en varmeplade ved 125 ° C for at tørre.
- Uddrag bevægelsesmæssigt data fra optagede videoer manuelt ved hjælp NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) eller tilpassede MATLAB-baserede orm tracking software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En repræsentativ video af en vildtype unge voksne nematode s electrotaxis og dets position og hastighed udgange fra ormen tracking software er vist i Supplerende Video 1 og figur 3. Bevægelsen analyse software i sig selv kan ikke genkende retningen af marken polaritet og tidspunktet for polaritetsreversering, men snarere, skal disse oplysninger indhentes fra kilden video. Dette kunne gøres ved hjælp af en lyd-eller visuel i videoen eller skrive ned eksperimentelle betingelser og manipulationer.
Electrotaxis hastighed data fra et sæt af vildtype (N2) og transgene dyr (NL5901) vises i fig. 4. De NL5901 dyr bære human α-synuclein-genet under kontrol af unc-54 (myosin tung kæde gen)-promotoren. Den udtrykte α-synuclein i kroppen væg muskler aggregater 9 og vores resultater viser, at det forårsager abnormiteter i elektrotrotactic respons. Hastigheden på NL5901 orme er betydeligt langsommere end vildtypen. For at plotte grafen, vi beregnet hastigheden på de enkelte orme og afbildet resulterer i en kasse plot hjælp Minitab statistisk software ( http://www.minitab.com ). Udover hastighed, andre parametre i bevægelse, såsom at dreje respons (tid det tager at fuldføre vending i reaktion på elektrisk felt polaritet ændring) og krop bøje frekvens (gennemsnitligt antal sinus bølger per sekund), kan også analyseres som beskrevet andetsteds 5..
Den electrotaxis protokol fungerer bedst med en synkroniseret population, som kan fås via behandling med en blegemiddel opløsning (natriumhypochlorit og 4 N natriumhydroxid i en 2:03 volumen ratio) 10.. Alle data præsenteres her er indhentet fra synkroniserede befolkninger at udelukke alder og scene-afhængige variation. Mens vi har brugt unge voksne (69 timer efter L1 på200C), kan andre etaper (L2 frem) også testes.
Figur 1. Skematisk af microfluidic screening platform for nematode electrotaxis assay. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Mastermodel (A) og færdigmonteret PDMS mikrokanalplade enhed (B).
Figur 3. Position vs tid (A) og momentan hastighed (B) udgange brugerdefinerede orm sporing program. Source video er Supplerende Video 1 nedenfor. Programmet beregner hastigheden kurven fra positionen tid-kurven, men tilsidesætter spikes ved beregningen af gennemsnitlig hastighed.
Figur 4.. Electrotaxis hastighed vildtype kontrol N2 og transgene NL5901 orme. NL5901 orme er betydeligt langsommere end kontrol med p> 0,0001. Signifikans bestemmes ved anvendelse af ikke-parametriske Mann-Whitney-testen. n = 10 for N2 og n = 23 for NL5901.
Supplerende Video 1. Electrotactic opførsel af unge voksne nematode i en mikrofluid kanal. Videoen starter med katode til højre. Udseende af glas pipette indikerer forestående polaritetsfejl, efterfølgende fjernelse af pipetten signaler øjeblik vending. Klik her for at sefilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drage fordel af den adfærdsmæssige fænomen først beskrevet af Gabel og kolleger og bygge på dielektroforetiske manipulation arbejde Chuang og kolleger 11,12, vores microfluidic-baserede electrotaxis assay giver en nem, robust og følsom metode til at undersøge neuronal aktivitet i orme anvender bevægelse som en udgang. Analysen bevægelighed parametre muliggør kvantitativ sammenligning mellem forskellige genotyper. Præcisionen af mikrokanalplade fabrikation og elektrisk felt ansøgning vedlagt både give et kontrollerbart miljø og et middel til at kommunikere med ormen til brug kontrol. Forskellige elektrisk signal bølgeformer har forskellige adfærdsmæssige refleksioner i ormen og er blevet anvendt til både at stimulere og hæmme bevægelse.
Den fælles-kanal design ifølge den foreliggende mikrofluid enhed kræver, at kun en enkelt orm scores ad gangen. Til dette skal orm opløsning være tilstrækkeligt fortyndet med M9buffer, før du forsøger at indlæse orme ind i kanalen. Det er vigtigt at påpege, at kanal operationer kan kompliceres af tilstedeværelsen af luftbobler og andre uregelmæssigheder, der påvirker det hydrostatiske tryk. Dette kunne elimineres ved at skylle kanalen med M9 og manipulere højden af indløbs-og udløbsrørene.
Assayet beskrevet her kan forbedres yderligere. En multi-channel microfluidic chip kunne accelerere orm screening, selv om det vil kræve integration af andre kontrolmekanismer såsom orm lastning, positionering og tracking. Yderligere automatisering af electrotaxis protokollen, især computer-styret flow management, vil øge effektiviteten. Disse forbedringer er i øjeblikket under udvikling i vores laboratorium.
Udvinding af bevægelseskomponenter data fra electrotaxis videoer blev oprindeligt udført manuelt ved hjælp ImageJ, hvilket er en langsom og kedelig proces. At øge effektiviteten og eliminere hUman fejl, er vi begyndt at bruge en orm sporing program tilpasset fra en original MATLAB-baserede pakke udviklet på California Institute of Technology 13.. Den software i øjeblikket behandler en enkelt orm videoer. Den nyeste version er velegnet til en bred vifte af assays, herunder kemisk behandlede orme og neuronale og muskel mutanter. En af dens begrænsninger er, at spontane tilbageførsler, observeret i visse neuronale mutanter (f.eks OSM-5) 5, ikke fortolkes korrekt. Sådanne orme skal analyseres manuelt.
Begrænsninger trods kan mikrofluidenheder electrotaxis anvendes i utallige sammenhænge, herunder drug discovery assays med ormen modeller for bevægelse-relaterede lidelser. I betragtning af dens modtagelighed til parallelisering er electrotaxis særligt velegnet til high-throughput screening applikationer. Genetisk og aldersbetinget analyse af electrotactic adfærd og neuronal degeneration kan også studeret med dettesystemet. Derudover kan orme sorteres efter alder eller fænotype at danne synkroniserede prøver eller for at identificere nye mutanter for forlæns genetiske skærme 6,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den microfluidic electrotaxis assay teknologi er blevet indgivet patent i USA og Canada.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada, Canada Research Stole Program, canadiske Institutes of Health Research, og Ontario Ministeriet for forskning og innovation gennem deres Early Eliteforsker Program for finansiel støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
