Summary
שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה ב
Abstract
את Caenorhabditis elegans נמטודות הוא אורגניזם מודל תכליתי למחקר ביו בגלל השימור של גנים הקשורים למחלות ושבילים, כמו גם את קלות הטיפוח שלה. כמה ג מודלים המחלה elegans כבר דיווחו, כולל הפרעות ניווניות כגון מחלת הפרקינסון (PD), הכולל ניוון של דופאמין (DA) תאי עצב 1. שני transgenes והכימיקלים neurotoxic היו בשימוש כדי לגרום לניוון מוחיה תובע וליקויי תנועה וכתוצאה מכך בתולעים, מה שמאפשר לחקירות הבסיס של ניוון מוחיים והמסכים לגנים ותרכובות 2,3 neuroprotective.
מסכים באאוקריוטים נמוכים כמו ג elegans לספק אמצעי יעיל וחסכוני לזיהוי תרכובות וגנים המשפיעים על איתות העצבית. מסכי קונבנציונליים מבוצעים בדרך כלל באופן ידני וכבש על ידי בדיקה חזותית, וכתוצאה מכך, הם זמן חסרונות- uming ונוטה לטעויות אנוש. בנוסף, רובם מתמחים בניתוח רמה תאי תוך התעלמות מתנועה, שהוא פרמטר חשוב במיוחד להפרעות תנועה.
אנחנו פיתחו מערכת microfluidic הקרנת רומן (איור 1) ששולטת ומכמת ג התנועה 'אלגנס באמצעות גירויי שדה חשמליים בתוך microchannels. אנחנו הראינו כי שדה (DC) זרם ישיר וחסונה יכול לגרום על פי דרישת תנועה לכיוון הקתודה ("electrotaxis") 4. היפוך הקוטביות של השדה גורם לתולעת להפוך את כיוונו במהירות גם כן. יש לנו גם הראו כי פגמים בעצב סנסורי דופאמין ואחרים לשנות את תגובת שחייה 5. לכן, ניתן לקבוע ליקויים באיתות העצבית באמצעות תנועה כקריאה החוצה. תגובת התנועה ניתן לכמת במדויק תוך שימוש במגוון של פרמטרים כגון שחייה מהירות, תדירות כיפוף גוף וזמן היפוך.
S = "jove_content"> העבודה שלנו גילתה כי תגובת electrotactic משתנה עם גיל. באופן ספציפי, הצעירים להגיב לטווח תחתון של שדות חשמליים ולנוע מהר יותר בהשוואה לזחלים 4. ממצאים אלה הובילו אותנו לעצב מכשיר microfluidic חדש למיין תולעים פסיביים על ידי גיל ופנוטיפ 6.
כמו כן, אנו צריכים לבדוק את התגובה של תולעים ל DC פעם לסירוגין ושדות (AC) זרם חשמלי. שדות DC פעם של מחזורי החובה שונים electrotaxis שנוצר בצורה יעילה בשניהם ג elegans ובת דודתו ג briggsae 7. בניסוי נוסף, שדות סימטריים AC עם תדרים הנעים בין הרץ 1 עד 3 קילוהרץ משותק תולעים בתוך הערוץ 8.
יישום של השדה החשמלי בסביבת microfluidic מאפשר ביצוע מהיר ואוטומטי של assay electrotaxis. גישה זו מבטיחה להקל על מסכי גנטיים וכימיים תפוקה גבוהה עבור גורמיםהמשפיע על תפקוד וכדאיות עצביים.
Protocol
1. Photolithography לייצור עובש מאסטר
- להתרחץ 3 פנימה פרוסות סיליקון באצטון למשך 30 שניות ולאחר מכן מתנול למשך 30 שניות. לשטוף עם DH 2 0 מים למשך 5 דקות.
- לייבש השטח של רקיק עם אקדח מכת N2. מחממים את פרוסות על צלחת חמה ב 140 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- פלזמה חמצן פני השטח של פרוסות סיליקון (1 דקות, 50 וואט).
- פני השטח של רקיק ספין מעיל עם SU-8 100 photoresist 3 מ"ל (40 שניות; 1,750 סל"ד).
- טרום לאפות את רקיק המצופה על צלחת חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן כבש את הטמפרטורה עד 95 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות. לשמור על הגדרה זו עבור שעה 1 נוספת.
- יישר photomask המכיל את עיצוב הערוץ הרצוי. לחשוף להתנגד ל550-600 mJ / 2 ס"מ של אור האולטרה סגול (350-400 ננומטר). Photomasks יכול להיות מתוכנן בAutoCAD ומודפס על שקיפות עם הדפסה ברזולוציה גבוהה.
- לאחר לאפות את רקיק על צלחת חמה על 65 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ו -95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לא rampingהוא הטמפרטורה כמו קודם.
- לטבול את פרוסות סיליקון ב- SU 8 מפתח פתרון עבור 10-15 דקות. בדקו להשלמת פיתוח על ידי שטיפה עם isopropanol. אם משקע לבן מופיע, להמשיך ולפתח. עובש האב מוצג באיור 2 א.
2. יתוגרפיה הרכה לייצור microchannel
- מערבבים 35 מ"ל polydimethylsiloxane (PDMS) בסיס אלסטומר עם סוכן ריפוי מיליליטר PDMS 3.5.
- מניחים את התבנית בתבנית הבסיס מפוברקת (דפוס פונה כלפי מעלה) ופרוסות סיליקון ריקה לצלחות פטרי מרופדות ברדיד אלומיניום.
- יוצקים 20 prepolymer PDMS מ"ל לתוך צלחת אדון העובש ו15 מ"ל למנה השנייה. לחסל את כיסי אוויר מתחת לפרוסות בעדינות על ידי לחיצה עליהם עם מוליך עץ חד פעמי.
- לכסות את שתי המנות ומניחים בצד ליום אחד כדי לרפא. לחלופין, לריפוי מהיר יותר, להסיר בועות אוויר מPDMS באמצעות degasifier ואקום ולאחר מכן לעזוב את המנות על צלחת חמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 2משאבי אנוש.
- הסר את נייר הכסף ולקלף את PDMS מהוופלים.
- השתמש האריס Uni-Core (2.5 מ"מ) לאגרוף יציאות גישה נוזלים בשני הקצוות של הערוץ. חותכים את הערוץ וPDMS הריק לרצועות בגודל דומה.
- טען את הערוץ, PDMS הרצועה הריקה ושקופיות זכוכית (75 × 25 מ"מ 2) לחמצן פלזמה, סביר להניח ממוקם בחדר נקי. לחשוף לפלזמת חמצן במשך 40 שניות בכוח 40 וואט.
- היצמד פיסת הערוץ ושקופיות זכוכית לצדדים מנוגדים של הרצועה הריקה. מניח בצד לשעה 2 כדי להשלים את המליטה.
- הנח את המכלול על צלחת חמה ב 120 ° C. צרף צינורות פלסטיק (קוטר פנימי 1/32 ", קוטר חיצוני 3/32"), שכל אחד לפחות 6 אינץ' ארוך, למאגרים באמצעות אגרוף prepolymer PDMS. להדביק מחבר פלסטיק fluidic לאחד או שני הצינורות כדי לאפשר למזרק מצורף, או להשתמש באבזרים זמינים מסחרי.
- לאפשר את PDMS אבטחת צינורות כדי לרפא. הכנס 3 "אורכים של 22 חוטי נחושת מבודדים מד לEACשעות מאגר, בין צינור הכניסה והערוץ, ומאובטח עם PDMS prepolymer. המוצר המוגמר הוא שמוצג באיור 2.
3. ניסוי Electrotaxis
- הנח את microchannel על הבמה (רצוי XY-מטלטלין) של מיקרוסקופ עם מצלמה מותקנת מחוברת למוניטור (איור 1).
- חבר את אספקת החשמל או חוטי היציאה של המגבר לאלקטרודות של microchannel. אספקת חשמל DC פשוט די אם רק אות DC היא רצויה, אבל מגבר המחובר לגנרטור פונקציה מאפשר יישום של פעם DC ואותות AC גם כן.
- צרף צינור הפלט של microchannel למזרק חד פעמי. להטביע את הפה של צינור היניקה בחיץ M9 פיסיולוגי ועדינות שואפת נוזל לתוך הערוץ על ידי יישום שלילי לחץ בתוך המזרק (באופן ידני או באמצעות משאבת מזרק). כאשר צינורות הכניסה ויציאה שניהם מלאים בM9, נתק את F המזרקROM הצינור. רמת שני הצינורות לאותו הגובה כדי למנוע זרימת hydrostatically מונעת.
- החל מתח DC לערוץ ולהבטיח כי התנגדות (R = V / I) היא בסביבות 0.6 MΩ (עבור 50 מ"מ אורך, 0.3 מ"מ רוחב ו ~ microchannel עמוק 0.1 מ"מ).
- אם מרוצה מהיושרה של הערוץ, בצע את השלבים שלעיל כדי לטעון תולעים מהשעיה מדוללת לתוך התעלה.
- נתק את המזרק וhydrostatically לתפעל את הזרימה על ידי התאמת הגובה היחסי של הצינורות. השתמש בשיטה זו כדי למקם את תולעת במרכזו של הערוץ ולאחר מכן להניח את שני הצינורות שטוחים באותו הגובה.
- הגדר את אספקת החשמל למתח המתאים: 4-12 ס"מ V / לבעלי חיים בשלב L3, 4-10 V / ס"מ לL4s ו2-4 V / ס"מ למבוגרים צעירים. הפעל את האות החשמלית ולאפשר 1 דקות של חשיפה טרום לתולעת להתאקלם לשדה. התולעת צריכה להתחיל לנוע לכיוון הקתודה. כאשר דקות חלפו, להשתמש במצלמה כדי להתחיל בהקלטה.
- עבור AC ודופקניסויי DC D, ניתן לאמץ את השדה החשמלי התגובה המקסימלי ממחזור של האות לעיל ותדירות והחובה יכולה להיות מווסת המועדפים 7, 8.
- כאשר הניסוי נגמר, להסיר את כל הנוזל (ותולעים) מהערוץ, לשטוף אותו עם DH 2 0, ולהשאיר את המכשיר על צלחת חמה ב 125 מעלות צלזיוס לייבוש.
- לחלץ נתונים מlocomotory קטעי וידאו מוקלטים באופן ידני באמצעות NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/ תוכנת מעקב תולעת מבוססת MATLAB המותאם אישית), או.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סרטון מייצג של electrotaxis של נמטודות מבוגר הצעירה פראי סוג והמיקום שלה ותפוקות מהירות מתוכנת מעקב התולעת מוצג בוידאו משלים 1 ואיור 3. תוכנת ניתוח התנועה עצמה אינה מזהה את הכיוון של קוטביות שדה ואת הזמן של היפוך קוטביות, אלא במידע זה יש לקבל ממקור הווידאו. זה יכול להיעשות באמצעות אות קולית או חזותית בוידאו או לכתוב את התנאים ומניפולציות ניסיוניים.
נתונים במהירות Electrotaxis מקבוצה של חיות בר מסוג (N2) ומהונדסות (NL5901) מוצגים באיור 4. את NL5901 החיות נושאות את גן α-synuclein אנושי תחת השליטה של אמרגן UNC-54 (גן שרשרת כבד שרירן). הביעו α-synuclein בגוף של שרירי דופן אגרגטים 9 והתוצאות שלנו מראים שזה גורם להפרעות בelecתגובת trotactic. המהירות של NL5901 תולעים היא איטית יותר באופן משמעותי מסוג בר. כדי להתוות את הגרף, חישבנו את המהירות של תולעים בודדים וזממנו תוצאות במגרש קופסה באמצעות תוכנה סטטיסטית Minitab (http://www.minitab.com). בנוסף למהירות, פרמטרים אחרים של תנועה, כגון הפיכת תגובה (זמן שנדרש כדי להשלים את ההיפוך בתגובה לשינוי קוטביות שדה חשמלי) וכיפוף גוף תדר (מספר הממוצע של סינוס גלים לשנייה), יכולה גם להיות מנותחות כמתואר במקום אחר 5.
Electrotaxis הפרוטוקול עובד הכי טוב עם אוכלוסייה מסונכרנת, אשר ניתן להשיג באמצעות טיפול בתמיסת כלור (hypochlorite נתרן ו4 N סודיום הידרוקסיד ביחס נפח 2:3) 10. כל הנתונים המוצגים כאן התקבלו מאוכלוסיות מסונכרנות כדי לשלול גיל ושלב תלוי בוריאציה. אמנם יש לנו בשימוש מבוגרים צעירים (לאחר 69 שעות בL1200C), שלבים אחרים (L2 ואילך) יכולים גם להיבדק.
איור 1. סכמטי של פלטפורמת הקרנת microfluidic עבור assay electrotaxis נמטודות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. עובש מאסטר () והתאסף מלא מכשיר microchannel PDMS (ב ').
איור 3. עמדה כפונקציה של זמן () ומהירות רגעית (ב) תפוקות של תכנית מעקב מותאמת אישית. תולעת חמוצהסרטון וידאו CE הוא משלים 1 להלן. התכנית מחשבת את עקומת מהירות מהעקום עמדה פעמית אך מתעלמת מהקוצים בעת חישוב מהירות ממוצעת.
איור 4. מהירות Electrotaxis של N2 בקרת wild-type ותולעי NL5901 מהונדסים. NL5901 תולעים הן איטיות יותר באופן משמעותי משליטה עם p> 0.0001. משמעות נקבעת באמצעות מבחן מאן ויטני, שאינם פרמטרית. n = 10 ולN2 N = 23 עבור NL5901.
וידאו משלים 1. התנהגות Electrotactic של נמטודות מבוגר הצעירה בערוץ microfluidic. סרטון מתחיל בקתודה בצד ימין. מראה של זכוכית פיפטה מציין היפוך קוטביות הממשמש ובא; ההסרה הבאה של פיפטה רגע האותות של היפוך. לחץ כאן לצפייהסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניצול של התופעה התנהגותית שתוארה לראשונה על ידי גייבל ועמיתיו ובונים על עבודת המניפולציה dielectrophoretic של צ'ואנג ועמיתים 11,12, assay electrotaxis microfluidic מבוסס שלנו מספק שיטה קלה, חזקה ורגישה לבדיקת פעילות עצבית בתולעים באמצעות תנועה כ פלט. הניתוח של פרמטרים תנועה מאפשר השוואת כמותית בין גנוטיפים שונים. הדיוק של ייצור ויישום microchannel שדה חשמלי לספק גם יחד סביבה לשליטה ואמצעים ליצירת קשר עם התולעת לבקרת תנועה. יש צורות גל אותות חשמליות שונות השתקפויות התנהגותיים שונות בתולעת והיו בשימוש כדי לעורר ומעכבות את תנועת שניהם.
עיצוב הערוץ היחיד של מכשיר microfluidic הנוכחי דורש שרק תולעת אחת להיות קלע בכל פעם. לשם כך, פתרון תולעת חייבת להיות מדולל מספיק עם M9מאגר לפני שתנסה לטעון תולעים לתוך התעלה. חשוב לציין שיכול להיות מסובכת פעילות ערוץ על ידי הנוכחות של בועות אוויר ואי סדרים אחרים המשפיעים על הלחץ ההידרוסטטי. זה יכול להתבטל על ידי שטיפה עם ערוץ M9 ומניפולצית הגובה של צינורות הכניסה ולשקע.
Assay המתואר כאן ניתן לשפר עוד יותר. שבב microfluidic רב ערוצית יכול להאיץ הקרנת תולעת, למרות שזה ידרוש שילוב של מנגנוני בקרה אחרים, כגון טעינת תולעת, מיצוב ומעקב. אוטומציה נוספת של פרוטוקול electrotaxis, ניהול תזרים מבוקר מחשב במיוחד, תגדיל את היעילות. שיפורים אלה בשלבי פיתוח במעבדה שלנו.
חילוץ של נתונים מתנועת סרטוני electrotaxis בוצע במקור באופן ידני באמצעות ImageJ, שהוא תהליך איטי ומייגע. כדי להגביר את היעילות ולחסל שעותאומן שגיאה, התחילו להשתמש בתכנית מעקב המותאמת תולעת מחבילה מבוססת MATLAB מקורי שפותחה במכון טכנולוגי של קליפורניה 13. התוכנה כיום מעבדת וידאו יחידה תולעת. הגרסה העדכנית ביותר היא מתאימה למגוון רחב של מבחני, כולל תולעים שטופלו כימיים ועצביים ומוטציות שרירים. אחת ממגבלותיו הוא שהיפוכים ספונטניים, שנצפו במוטנטים עצביים מסוימים (למשל, OSM-5) 5, אינם מתפרשים בצורה נכונה. תולעים אלה חייבים להיות מנותחים באופן ידני.
על אף מגבלות, יכול להיות מיושם בהקשרי electrotaxis microfluidic עצום, כוללים מבחני גילוי סמים עם מודלים תולעת של הפרעות הקשורות לתנועה. בהתחשב amenability לעמות, electrotaxis הוא מתאים במיוחד גם ליישומי הקרנת תפוקה גבוהה. ניתוח גנטי ותלוי גיל של התנהגות electrotactic וניוון עצבי יכול להיות גם למד עם זהמערכת. בנוסף, תולעים עשויים להיות ממוינים על פי גיל או פנוטיפ ליצירת דגימות מסונכרנות או לזהות מוטציות חדשות לקדימה מסכי גנטיים 6,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
טכנולוגית assay electrotaxis microfluidic כבר הגישה בקשה לפטנט בארצות הברית של אמריקה וקנדה.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה, תכנית כיסאות מחקר בקנדה, מכון קנדי לחקר בריאות, ואונטריו משרד המחקר והחדשנות באמצעות תכנית פרס החוקרים הראשונה שלהם לתמיכה כספית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
