Summary
にオンデマンド歩行を誘導する半自動微小電気流体方式
Abstract
線虫線虫（Caenorhabditis elegans）があるため、疾患関連遺伝子および経路と同様に栽培の容易さのその保全の生物医学研究のための多目的なモデル生物である。いくつかのC.線虫病モデルは、例えばドーパミン作動性（DA）ニューロン1の変性を伴うパーキンソン病（PD）などの神経変性疾患を含む、報告されている。導入遺伝子と神経毒性化学物質の両方が神経保護遺伝子や化合物の2,3のための神経変性と画面の基礎の調査を可能にし、ワームでDA神経変性とそれに伴う動きの欠陥を誘発するために使用されている。
C.のような下等真核生物の画面線虫は、神経信号伝達に影響を与える化合物及び遺伝子を同定するための効率的かつ経済的な手段を提供する。従来の画面は、通常手動で実行して目視で採点され、その結果、彼らは時間両論ですumingとヒューマンエラーを起こしやすい。さらに、細胞レベルの分析で最もフォーカスが移動を無視して、これは、運動障害のために特に重要なパラメータである。
我々はC.を制御し、定量化した新規マイクロ流体スクリーニングシステム（ 図1）を開発しましたマイクロチャネル内部電界刺激を用いエレガンス 'ロコモーション。我々は、直流（DC）は、フィールドが確実にカソードに向かって移動（ "走電性"）4オンデマンド誘導することが示されている。フィールドの極性を逆にすると、ワームがすぐに同様にその方向を反転させる。また、ドーパミン作動性や他の感覚ニューロンの欠陥は、スイミングレスポンス5を変更することが示されている。したがって、ニューロンのシグナル伝達における異常が読み出しとして歩行を用いて決定することができる。運動応答は、正確にそのような遊泳速度、本体の曲げ周波数および反転時間などのパラメータの範囲を使用して定量することができる。
4に比べて速く移動。これらの知見は、私たちが受動的に年齢や表現型6でワームをソートする新しいマイクロ流体デバイスを設計するために導いた。
また、パルスDCにワームの応答をテストし、電流（AC）電界を交互にしています。 Cの両方でさまざまなデューティ·サイクルのパルスDCフィールドは、効果的に生成された走電性エレガンスとそのいとこでbriggsae 7。別の実験で、1ヘルツから3キロヘルツまでの周波数を持つ対称ACフィールドはチャンネル8内ワームを固定化した。
マイクロ流体環境における電界の実装では、走電性アッセイの迅速かつ自動実行を可能にする。このアプローチは、因子のハイスループット遺伝的および化学的な画面を容易にすることを約束神経機能および生存に影響を与える。
Protocol
1。マスター金型製作のためのフォトリソグラフィー
- 30秒後、30秒、メタノール、アセトン、シリコンウェハー3インチ浴びる。 5分間のdH 2 0水で洗い流してください。
- N2ブローガンでウェハの表面を乾燥させる。 2分間140℃のホットプレート上のウェハを加熱。
- プラズマは、シリコンウェハ（1分間、50 W）の表面を酸化させる。
- 3ミリリットルSU-8フォトレジスト100（; 1,750 rpmで40秒）をスピンコートウェハの表面。
- 65℃のホットプレート上でプリベークコーティングウェーハ℃で10分間、その後95℃で2分間にわたって温度を上昇。さらに1時間のために、この設定を維持します。
- 希望するチャネル設計を含むフォトマスクの位置を合わせます。 UV光の550から600 MJ / cm 2と （350-400 nm）のに抵抗を公開。フォトマスクは、AutoCADで設計され、高解像度の印刷で透明で印刷することができる。
- Tをランピングポストベーク65℃のホットプレート上のウエハ℃で10分間で1分、95℃でC、以前のように彼は温度。
- 10〜15分間SU-8現像液にウェハを浸し。イソプロパノールでリンスすることにより、開発の完了を確認してください。白色の沈殿物が表示された場合は、開発を継続。マスターモールドは、 図2Aに示されている。
2。マイクロチャネル作製用ソフトリソグラフィ
- 3.5ミリリットルPDMS硬化剤と35ミリリットルポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマーベースを混ぜる。
- アルミホイルで裏打ちペトリ皿に製造されたマスターモールド（パターンが上向き）とブランクシリコンウエハーを置きます。
- マスター型皿と第二皿に15ミリリットルに20ミリリットルPDMSプレポリマーを注ぐ。優しく使い捨て木製のアプリケーターでそれらを押すことによってウェハの下にエアポケットを排除します。
- 両方の料理をカバーし、治すための日に取っておく。あるいは2について、より速く硬化のために、真空脱気装置を用いたPDMSから気泡を除去した後、80℃のホットプレート上に皿を残す°CHR。
- ウェーハから箔とPDMS皮を取り除きます。
- チャネルの両端に流体アクセスポートをパンチするためにハリスユニコア（2.5 mm）を使用します。同様のサイズのストリップにチャンネルとブランクPDMSをカットします。
- プラズマ酸化剤にチャネル、ブランクPDMSストリップとスライドガラス（75×25ミリメートル2）をロード、おそらくクリーンルームに位置。 40 Wパワーで40秒間酸素プラズマにさらす。
- ブランクストリップの反対側へのチャネルピースとスライドガラスを貼り付けます。結合を完了するには2時間のために取っておく。
- 120℃のホットプレート上にアセンブリを置き℃にPDMSプレポリマーを使用してパンチの貯水池に、それぞれの長い少なくとも6インチ（内径1/32 "、外径3/32"）プラスチックチューブを取り付けます。一方または両方のチューブに貼り、流体プラスチックコネクタシリンジ添付ファイルを許可するか、市販の金具を使用する。
- PDMSは、治すためにチューブを固定できます。 EACに22ゲージの絶縁銅線の3 "の長さを挿入hの入口管とチャネルの間に貯水池と、PDMSプレポリマーで固定します。完成品は、 図2Bに示されている。
3。走電性実験
- モニタ（ 図1）に接続され搭載されたカメラと顕微鏡のステージ（望ましくはXY-可動）にマイクロチャネルを置きます。
- のマイクロ電極に電源やアンプの出力線を接続。 DC信号が所望される場合にのみ、単純なDC電源は十分であるが、関数発生器に接続された増幅器も同様にパルスDC及びAC信号の印加を可能にする。
- 使い捨て注射器にマイクロチャネルの出力管を取り付けます。水没M9生理的緩衝液中入口管の口をゆっくりと注射器（手動またはシリンジポンプを用いて）内の負圧を適用してチャネルに液体を熱望する。入口および出口管はM9が充填されている両方の場合には、注射器fを切断するロムチューブ。静水圧駆動流を防止するために同じ高さの両方の管を水平。
- チャネルに直流電圧を印加し、その抵抗性を確保（R = V / I）は0.6MΩ（長さ50mm、幅の広い0.3ミリメートルとマイクロチャネルの深〜0.1ミリメートルの場合）程度である。
- チャンネルの整合性に満足している場合、チャネルに希釈懸濁液からワームをロードするには、上記の手順に従ってください。
- シリンジを外し、水圧管の相対的な高さを調整することにより、流れを操作します。チャネルの中心にワームを配置し、同じ高さで、両方のチューブが平らにするために、このメソッドを使用します。
- L3段動物のための4-12 V / cmのL4sための4-10 V / cmであり、若者のために2-4 V / cmで：適切な電圧の電源を設定します。電気信号をアクティブにして、フィールドに順応するためにワームの事前暴露の1分を可能にします。ワームは、陰極に向かって移動を開始する必要があります。分が経過すると、録音を開始するには、カメラを使用しています。
- ACおよびパルスに対する7,8を必要に応じて、dはDC実験では、最大応答電界が信号の前記周波数およびデューティサイクルから採用することができるが変調することができる。
- 実験が終了すると、チャネルからすべての液体（やワーム）を削除、のdH 2 0でそれを洗い流し、そして℃の乾燥する125℃のホットプレート上のデバイスにしておきます。
- 手動NIH ImageJの（使用して録画したビデオからの運動器官のデータを抽出http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）またはカスタムMATLABベースのワームトラッキングソフトウェアを。
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Representative Results
ワームトラッキングソフトウェアから野生型若い成人線虫の走電性とその位置と速度出力の代表的な映像は補足ビデオ1及び図3に示します。運動解析ソフトウェア自体は、フィールド極性の方向と極性反転の時間を認識していない、むしろ、この情報は、ソースビデオから取得する必要があります。これは、ビデオ、オーディオやビジュアルキューを使用したり、実験条件や操作を書き留めて行うことができる。
野生型（N2）及びトランスジェニック動物（NL5901）のセットから走電性速度データを図4に表示されている。 NL5901動物はUNC-54（ミオシン重鎖遺伝子）プロモーターの制御下にヒトα-シヌクレイン遺伝子を運ぶ。体壁の筋肉を集約9にα-シヌクレイン発現させ、我々の結果は、それが電気の異常を引き起こすことを示しているtrotactic応答。 NL5901ワームの速度が野生型よりも大幅に遅くなります。グラフをプロットするために、我々は個々のワームの速度を計算し、Minitabの統計ソフトウェアを（使用してボックスプロットの結果をプロットhttp://www.minitab.com ）。他の場所で説明したように加えて、速度、例えば旋回応答（電界の極性変化に応答して逆転を完了するのに要する時間）と本体折り曲げ周波数（1秒あたりの正弦波の平均数）などの動きの他のパラメータも、分析することができる5。
走電性プロトコルは、漂白剤溶液（2時03体積比で次亜塩素酸ナトリウムと4 N水酸化ナトリウム）10を用いた治療を介して取得することができシンクロナイズド人口、で最高の作品。ここで紹介するすべてのデータは年齢とステージ依存変動を除外するために同期化された集団から得られた。我々は、若い成人（69時間後-L1で使用されているが200C）、他のステージは（L2以降）もテストすることができます。
図1。線虫の走電性アッセイのためのマイクロ流体スクリーニングプラットフォームの回路図。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。マスターモールド（A）と完全に組み立てられたPDMSマイクロ流路デバイス（B）。
図3。位置対時間（）と瞬間速度（B）カスタムワーム追跡プログラムの出力は。サワーCEビデオは下記補足ビデオ1です。プログラムは、位置 - 時間曲線から速度曲線を算出し、平均速度を算出する際にスパイクを無視。
図4。野生型コントロールN2とジェニックNL5901ワームの走電性速度。NL5901ワームは、p> 0.0001とコントロールよりも大幅に遅くなります。有意性は、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を用いて決定される。 NL5901用N2とn = 23 N = 10。
補足ビデオ1。マイクロ流体チャネルの若い成人線虫のElectrotactic挙動。ビデオでは、右側に陰極から始まる。ガラスピペットの外観は、差し迫った極性反転を示し、反転のピペット信号モーメントのその後の除去。 表示するにはここをクリック映画。
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Discussion
最初荘や同僚11,12の誘電泳動操作作業にガベルと同僚や建物によって記述行動現象を利用して、当社のマイクロ流体ベースの走電性アッセイは、動きをとして使用してワームに神経活動を調べるため、簡単に堅牢かつ感度の高い方法を提供しています出力。運動パラメータの解析は異なる遺伝子型間の定量的な比較を可能にします。マイクロ流路の作製と電界印加の精度が一緒に制御可能な環境と運動制御用のワームと通信するための手段の両方を提供します。異なる電気信号の波形は、ウォームで異なる行動の反射を持ち、両方の運動を刺激し、阻害するために使用されてきた。
現在のマイクロ流体デバイスのシングルチャネル設計は、単一のワームが一度に得点されている必要があります。このため、ウォーム溶液を十分にM9希釈しなければならないチャネルにワームをロードする前にバッファ。チャンネル操作が静水圧に影響を及ぼす気泡や他の不規則性の存在によって複雑になることを指摘することが重要である。これは、M9のチャネルをフラッシュし、入口および出口管の昇降を操作することによって除去することができる。
ここに記載されたアッセイをさらに向上させることができる。このようなウォームローディング、位置決めやトラッキングなどの他の制御機構の統合を必要とするが、マルチチャネルマイクロ流体チップは、ウォームスクリーニングを加速することができる。走電性プロトコルのさらなる自動化、特にコンピュータ制御フロー管理は、効率性を増加させる。これらの機能強化は、我々の研究室で現在開発中である。
走電性動画から移動データの抽出は、もともと低速かつ面倒なプロセスであるImageJのを使用して手動で行われた。効率を高めるとhを除去するウマンエラー、我々は技術13のカリフォルニア工科大学で開発されたオリジナルのMATLABベースのパッケージから適応ワームの追跡プログラムを使用し始めている。ソフトウェアは、現在シングルワームの動画を処理します。最新バージョンは、化学的に処理されたワームや神経や筋肉の変異体を含むアッセイの広い範囲に適しています。その制限の1つは、特定の神経変異体で観察された自発的逆転、（ 例えば 、OSM-5）が正しく解釈されないことである。このようなワームは、手動で分析する必要があります。
限界にもかかわらず、マイクロ流体走電性は、運動に関連した障害のウォームモデルと創薬アッセイを含む無数の文脈で適用することができる。並列化への従順を考慮し、走電性は、特にハイスループットスクリーニング用途に適している。 electrotactic行動と神経変性の遺伝と年齢依存性分析は、これで勉強することがシステム。さらに、ワームは同期サンプルを形成するために、または転送遺伝子スクリーニング6,14の新しい変異体を識別するために、年齢や表現型によってソートすることもできる。
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Disclosures
マイクロ流体走電性アッセイ技術は、アメリカとカナダ、米国で特許を申請しました。
Acknowledgments
著者は、財政支援のために彼らの初期の研究者賞プログラムを通じて自然科学とカナダの工学研究評議会、カナダリサーチチェアプログラム、保健研究のカナダの協会、および研究とイノベーションのオンタリオ州省に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
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