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Bioengineering

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de Published: May 2, 2013 doi: 10.3791/50226

Summary

Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção em

Abstract

Os nemátodo Caenorhabditis elegans é um organismo modelo versátil para a investigação biomédica devido à sua conservação dos genes e vias relacionadas com a doença, bem como a sua facilidade de cultivo. Vários C. elegans modelos da doença têm sido relatados, incluindo desordens neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson (PD), que envolve a degeneração de dopaminérgica (DA) neurónios 1. Ambos os transgenes e produtos químicos neurotóxicos têm sido utilizados para induzir a neurodegeneração promotor e consequentes defeitos de circulação em vermes, permitindo investigações sobre a base da neurodegeneração e telas para os genes e compostos neuroprotectores 2,3.

Telas em eucariotos mais baixas, como C. elegans proporcionar um meio eficiente e econômico para identificar os compostos e os genes que afetam a sinalização neuronal. Telas convencionais normalmente são realizados manualmente e marcado por inspeção visual e, conseqüentemente, eles são tempo-consuming e propenso a erros humanos. Além disso, a maior enfoque na análise nível celular, ignorando a locomoção, que é um parâmetro muito importante para desordens de movimento.

Desenvolvemos um novo sistema de rastreio de microfluidos (Figura 1), que controla e quantifica C. locomoção elegans 'usando estímulos campo elétrico no interior de microcanais. Mostrámos que um campo de corrente contínua (DC) pode induzir robustamente on-demand locomoção para o cátodo ("electrotaxis") 4. Invertendo a polaridade do campo faz com que o worm para reverter rapidamente a sua direção. Também mostrámos que os defeitos em neurónios sensoriais e outros dopaminérgicos alterar a resposta de natação 5. Portanto, anormalidades na sinalização neuronal pode ser determinada utilizando a locomoção como uma leitura. A resposta de movimento podem ser quantificados com precisão, utilizando uma gama de parâmetros, tais como velocidade de natação, corpo frequência de flexão e do tempo de reversão.

4. Estes resultados levaram-nos a projetar um novo dispositivo micro para classificar passivamente vermes por idade e fenótipo 6.

Também testamos a resposta de vermes para pulsado DC e alternada campos de corrente elétrica (AC). DC campos pulsados ​​de vários ciclos electrotaxis efetivamente gerados, tanto C. elegans e seu primo C. briggsae 7. Numa outra experiência, os campos AC simétricas, com frequências que vão de 1 Hz a 3 kHz vermes imobilizada no interior do canal 8.

Implementação do campo elétrico em um ambiente de microfluídica permite a execução rápida e automatizada do ensaio electrotaxis. Esta abordagem promete facilitar telas genéticas e químicas de alto rendimento para os fatoresafetando a função neuronal e viabilidade.

Protocol

1. Fotolitografia para Master Mold Fabricação

  1. Banho de 3 cm da bolacha de silício em acetona durante 30 segundos e em seguida com metanol, durante 30 seg. Enxágüe com dH 2 0 água por 5 min.
  2. Seque a superfície do wafer com uma pistola de ar N2. Aquece-se a bolacha em uma chapa quente a 140 ° C durante 2 min.
  3. Plasma oxidar a superfície da bolacha de silício (1 min, 50 W).
  4. A superfície da bolacha de spin-revestimento com 3 ml SU-8 100 fotossensível (40 seg; 1.750 rpm).
  5. Pré-coze a pastilha revestida sobre uma placa quente a 65 ° C durante 10 min, depois rampa a temperatura até 95 ° C ao longo de 2 min. Manter essa configuração para uma 1 hora adicional.
  6. Alinhar um photomask contendo o projeto do canal desejado. Expor a resistir a 550-600 mJ / cm 2 de luz UV (350-400 nm). Máscaras podem ser projetados em AutoCAD e impresso em uma transparência com impressão de alta resolução.
  7. Pós-cozer a bolacha sobre uma placa quente a 65 ° C durante 1 min e 95 ° C durante 10 min, rampa tele temperatura como antes.
  8. Mergulhe o wafer em SU-8 solução reveladora por 10-15 min. Verifique para a conclusão do desenvolvimento de lavagem com isopropanol. Se um precipitado branco aparece, continuar a desenvolver. O molde mestre é mostrado na Figura 2A.

2. Litografia suave para Fabricação de microcanais

  1. Misture 35 ml polidimetilsiloxano (PDMS), base de elastômero com 3,5 ml de agente de cura PDMS.
  2. Coloque o molde mestre fabricado (padrão para cima) e uma pastilha de silício em branco em placas de Petri forradas com papel alumínio.
  3. Verter 20 mL de pré-polímero de PDMS no prato molde mestre e 15 ml no segundo prato. Eliminar bolsões de ar sob os wafers pressionando suavemente sobre eles com um aplicador de madeira descartáveis.
  4. Cubra ambos os pratos e reserve um dia para curar. Alternativamente, para a cura mais rápida, remover as bolhas de ar do PDMS usando um desgaseificador a vácuo e depois deixam-se os pratos em uma placa quente a 80 ° C durante 2hr.
  5. Retire o papel alumínio e retire o PDMS das bolachas.
  6. Utilizar a Harris Uni-Core (2,5 mm) para perfurar aberturas de acesso de fluidos em ambas as extremidades do canal. Corte o canal e branco PDMS em tiras de tamanho similar.
  7. Carregar o canal, a tira de placa de PDMS e uma lâmina de vidro (75 x 25 mm 2) no plasma de um oxidante, provavelmente localizado numa sala limpa. Expor a plasma de oxigênio por 40 segundos a 40 W de potência.
  8. Furar a peça de canal e lâmina de vidro para os lados opostos da tira de placa. Retiradas para 2 horas para completar a ligação.
  9. Coloque a montagem sobre uma placa quente a 120 ° C. Anexar tubos de plástico (diâmetro interno de 1/32 ", o diâmetro exterior de 3/32"), cada um, pelo menos, 6 cm de comprimento, com os reservatórios perfurados que utilizam pré-polímero de PDMS. Apor um conector de plástico fluídico para um ou ambos os tubos para permitir a ligação da seringa, ou utilizar acessórios disponíveis comercialmente.
  10. Permitir que o PDMS proteger a tubulação para curar. Insira 3 "comprimentos de calibre 22 fio de cobre isolado em each reservatório, entre o tubo de entrada e o canal, e seguro, com pré-polímero de PDMS. O produto final é mostrado na Figura 2B.

3. Electrotaxis Experiment

  1. Coloque a microcanais na fase (de preferência XY-móvel) de um microscópio com uma câmara montada ligada a um monitor (Figura 1).
  2. Ligue a fonte de alimentação ou fios de saída do amplificador para os eletrodos do microcanais. Uma simples fonte de alimentação DC é suficiente que apenas um sinal de corrente contínua for desejado, mas de um amplificador conectado a um gerador de funções permite a aplicação de sinais AC e DC pulsada bem.
  3. Aplica o tubo de saída do microcanal para uma seringa descartável. Imergir a boca do tubo de entrada em M9 tampão fisiológico e suavemente aspirar o líquido para dentro do canal por aplicação de uma pressão negativa no interior da seringa (quer manualmente ou utilizando uma bomba de seringa). Quando os tubos de entrada e de saída são ambas cheias com M9, desligar a seringa from o tubo. Nivelar os dois tubos para a mesma altura para impedir o fluxo de acionamento hidrostático.
  4. Aplicar uma tensão de CC para o canal e garantir que a resistência (R = V / I) é de cerca de 0,6 mohms (para uma redução de 50 mm de comprimento, 0,3 milímetros de largura e -0,1 mm de profundidade microcanal).
  5. Se estiver satisfeito com a integridade do canal, siga os passos acima para carregar os vermes de uma suspensão diluída para o canal.
  6. Retirar a seringa e hidrostática manipular o fluxo ajustando altura relativa dos tubos. É este método para colocar um sem-fim no centro do canal e, em seguida, colocar ambos os tubos no mesmo plano de elevação.
  7. Definir o fornecimento de energia para a tensão apropriada: 4-12 V / cm, para os animais fase L3, 4-10 V / cm, e para L4s 2-4 V / cm, para os adultos jovens. Ative o sinal elétrico e permitir que 1 min de pré-exposição para o worm para se aclimatar ao campo. O worm deve começar a se mover em direção ao cátodo. Quando o minuto passou, usar a câmera para começar a gravar.
  8. Para AC e pulsoexperimentos d CC, o campo elétrico resposta máxima pode ser adotada a partir do ciclo do sinal acima e freqüência e duty pode ser modulada como desejado 7, 8.
  9. Quando o experimento for concluído, remova todo o líquido (e vermes) do canal, lave-o com dH 2 0, e deixar o dispositivo em uma placa quente a 125 ° C para secar.
  10. Extrair dados locomotores de vídeos gravados manualmente usando NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou software de monitoramento verme baseada em MATLAB personalizado.

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Representative Results

Um vídeo representante electrotaxis um nematóide adulto jovem do tipo selvagem e sua posição e saídas de velocidade a partir do software de rastreamento verme são mostrados na Suplementar Video 1 e Figura 3. O próprio software de análise de movimento não reconhece a direção da polaridade do campo eo tempo de inversão de polaridade, mas sim, esta informação deve ser obtido a partir da fonte de vídeo. Isso pode ser feito usando um taco de áudio ou visual no vídeo ou escrevendo as condições experimentais e manipulações.

Electrotaxis dados de velocidade de um conjunto de animais de tipo selvagem (N2) e transgénicas (NL5901) são apresentados na Figura 4. Os animais NL5901 transportar gene α-sinucleína humana sob o controlo de unc-54 (gene da cadeia pesada da miosina) promotor. O expresso α-sinucleína no corpo músculos da parede agregados 9 e nossos resultados mostram que provoca anomalias no elecresposta trotactic. A velocidade de NL5901 vermes é significativamente mais lento do que o tipo selvagem. Para traçar o gráfico, calculamos a velocidade de vermes individuais e os resultados plotados em um gráfico de caixa utilizando o software estatístico Minitab ( http://www.minitab.com ). Além da velocidade, os outros parâmetros do movimento, tais como a resposta de viragem (tempo necessário para completar a inversão em resposta à mudança da polaridade do campo eléctrico) e da frequência corpo dobra (número médio de ondas sinusoidais por segundo), também pode ser analisada tal como descrito em outro lugar 5.

O protocolo electrotaxis funciona melhor com uma população sincronizado, o qual pode ser obtido por meio de tratamento com uma solução de lixívia (hipoclorito de sódio e 4 N hidróxido de sódio numa proporção em volume de 02:03), 10. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos a partir de populações sincronizados para descartar a idade e fase dependente da variação. Embora tenhamos usado adultos jovens (69 horas pós-L1 na200C), (L2 outras fases subsequentes) também podem ser testados.

Figura 1
Figura 1. Esquemático da plataforma de triagem microfluídicos para ensaio electrotaxis nematóide. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 2
Figura 2. Molde principal (A) e totalmente montado do dispositivo de microcanal PDMS (B).

Figura 3
Figura 3. Posição em função do tempo (A) e velocidade instantânea (B) A produção de programa de rastreamento verme personalizado. Sourvideo ce é Suplementar Video 1 abaixo. O programa calcula a curva de velocidade a partir da curva de tempo de posição, mas ignora as pontas quando o cálculo da velocidade média.

Figura 4
Figura 4. Velocidade electrotaxis de N2 controle do tipo selvagem e vermes transgênicos NL5901. NL5901 vermes são significativamente mais lento do que o controle com p <0,0001. A significância é determinada usando o teste de Mann-Whitney não-paramétrico. n = 10 para N2, e n = 23 para NL5901.

Complementar Video 1. Comportamento Electrotactic de nematóide adulto jovem em um canal microfluídicos. Vídeo começa com cátodo para a direita. Aparência de vidro pipeta indica inversão de polaridade iminente; posterior remoção dos sinais momento de reversão da pipeta. Clique aqui para verfilme.

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Discussion

Aproveitando-se do fenômeno comportamental descrita pela primeira vez por Gabel e colegas e com base no trabalho de manipulação dieletroforética de Chuang e colegas 11,12, nosso ensaio electrotaxis baseado em microfluídica fornece um método fácil, robusto e sensível para investigar a atividade neuronal em vermes usando o movimento como uma saída. A análise dos parâmetros de movimento permite a comparação quantitativa entre os diferentes genótipos. A precisão de fabrico de microcanais e aplicação de campo eléctrico em conjunto proporcionam tanto um ambiente controlado e um meio para comunicar com o sem-fim para o controle de locomoção. Diferentes formas de onda de sinais eléctricos ter diferentes reflexões comportamentais no sem-fim e têm sido utilizadas tanto para estimular e inibir a locomoção.

A concepção de um único canal do presente dispositivo de microfluidos, que requer apenas um único sem-fim ser marcados de cada vez. Para isso, a solução de sem-fim deve ser suficientemente diluída com M9o buffer antes de tentar carregar vermes para o canal. É importante salientar que as operações de canal pode ser complicado pela presença de bolhas de ar e outras irregularidades que afectam a pressão hidrostática. Isto pode ser eliminado por lavagem com o canal de M9 e manipulando a elevação dos tubos de entrada e de saída.

O ensaio aqui descrito pode ser melhorado ainda mais. Um chip de multi-canal microfluídico pode acelerar rastreio sem fim, embora possa requerer integração de outros mecanismos de controlo, tais como carga sem-fim, o posicionamento e controlo. Maior automatização do protocolo electrotaxis, especialmente a gestão do fluxo controlado por computador, irá aumentar a eficiência. Essas melhorias estão atualmente em desenvolvimento em nosso laboratório.

Extracção de dados de vídeos electrotaxis locomoção foi inicialmente realizada manualmente, utilizando o ImageJ, que é um processo lento e tedioso. Para aumentar a eficiência e eliminar herro uman, nós começamos a usar um programa de rastreamento verme adaptado de uma embalagem original baseada em MATLAB desenvolvido no Instituto de Tecnologia da Califórnia 13. O software processa atualmente videos único sem-fim. A versão mais recente é adequado para uma ampla gama de ensaios, incluindo vermes tratados quimicamente e neuronais e mutantes musculares. Uma de suas limitações é que reversões espontâneas, observadas em alguns mutantes neuronais (eg, osm-5) 5, não são interpretados corretamente. Tais vermes devem ser analisados ​​manualmente.

Limitações não obstante, microfluídicos electrotaxis pode ser aplicado em inúmeros contextos, incluindo ensaios de descoberta de drogas com modelos sem-fim de distúrbios relacionados ao movimento. Dada a sua responsabilidade para com a paralelização, electrotaxis é particularmente adequado para aplicações high-throughput screening. A análise genética e idade-dependente do comportamento electrotactic e degeneração neuronal também pode ser estudado com estesistema. Além disso, os vermes podem ser classificados por idade ou fenótipo para formar amostras sincronizadas ou para identificar novos mutantes para a frente telas genéticos 6,14.

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Disclosures

A tecnologia de ensaio electrotaxis microfluídicos foi apresentado para a patente nos Estados Unidos da América e Canadá.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia do Canadá, Canadá programa de Cátedras de Pesquisa, Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, e Ontário Ministério da Investigação e da Inovação através de seu Programa de investigadores em início Prêmio de apoio financeiro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone CALEDON Labs 1200-1-30
Methanol CALEDON Labs 6700-1-30
Isopropanol CALEDON Labs 8600-1-40
SU-8 Microchem Corp. Y131273 SU-8 100
SU-8 Developer Microchem Corp. Y020100
92x16mm Petri Dish Sarstedt 82.1473.001
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Contains elastomer base and curing agent
Function generator Tektronix Inc. Model AFG3022B
Amplifier Trek Inc. Model 2210-CE
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4506 Model 11 ELITE
Hotplate Fisher Scientific 11675916Q Model HP131725Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Tags

Bioengenharia Comportamento Biologia Molecular Biologia Celular Neurociência Neurobiologia Biofísica Engenharia Mecânica microfluídica, C. elegans Síndromes neurotoxicidade toxicidade por drogas síndromes neurotoxicidade Agentes Biológicos Ensaios de high-throughput screening testes de toxicidade Locomotion Doenças do Sistema Nervoso electrotaxis locomoção natação movimento neurodegeneração a sinalização neuronal dopamina os neurônios modelo animal
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Tong, J., Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion. J. Vis. Exp. (75), e50226, doi:10.3791/50226 (2013).

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