Summary
Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção em
Abstract
Os nemátodo Caenorhabditis elegans é um organismo modelo versátil para a investigação biomédica devido à sua conservação dos genes e vias relacionadas com a doença, bem como a sua facilidade de cultivo. Vários C. elegans modelos da doença têm sido relatados, incluindo desordens neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson (PD), que envolve a degeneração de dopaminérgica (DA) neurónios 1. Ambos os transgenes e produtos químicos neurotóxicos têm sido utilizados para induzir a neurodegeneração promotor e consequentes defeitos de circulação em vermes, permitindo investigações sobre a base da neurodegeneração e telas para os genes e compostos neuroprotectores 2,3.
Telas em eucariotos mais baixas, como C. elegans proporcionar um meio eficiente e econômico para identificar os compostos e os genes que afetam a sinalização neuronal. Telas convencionais normalmente são realizados manualmente e marcado por inspeção visual e, conseqüentemente, eles são tempo-consuming e propenso a erros humanos. Além disso, a maior enfoque na análise nível celular, ignorando a locomoção, que é um parâmetro muito importante para desordens de movimento.
Desenvolvemos um novo sistema de rastreio de microfluidos (Figura 1), que controla e quantifica C. locomoção elegans 'usando estímulos campo elétrico no interior de microcanais. Mostrámos que um campo de corrente contínua (DC) pode induzir robustamente on-demand locomoção para o cátodo ("electrotaxis") 4. Invertendo a polaridade do campo faz com que o worm para reverter rapidamente a sua direção. Também mostrámos que os defeitos em neurónios sensoriais e outros dopaminérgicos alterar a resposta de natação 5. Portanto, anormalidades na sinalização neuronal pode ser determinada utilizando a locomoção como uma leitura. A resposta de movimento podem ser quantificados com precisão, utilizando uma gama de parâmetros, tais como velocidade de natação, corpo frequência de flexão e do tempo de reversão.
4. Estes resultados levaram-nos a projetar um novo dispositivo micro para classificar passivamente vermes por idade e fenótipo 6.
Também testamos a resposta de vermes para pulsado DC e alternada campos de corrente elétrica (AC). DC campos pulsados de vários ciclos electrotaxis efetivamente gerados, tanto C. elegans e seu primo C. briggsae 7. Numa outra experiência, os campos AC simétricas, com frequências que vão de 1 Hz a 3 kHz vermes imobilizada no interior do canal 8.
Implementação do campo elétrico em um ambiente de microfluídica permite a execução rápida e automatizada do ensaio electrotaxis. Esta abordagem promete facilitar telas genéticas e químicas de alto rendimento para os fatoresafetando a função neuronal e viabilidade.
Protocol
1. Fotolitografia para Master Mold Fabricação
- Banho de 3 cm da bolacha de silício em acetona durante 30 segundos e em seguida com metanol, durante 30 seg. Enxágüe com dH 2 0 água por 5 min.
- Seque a superfície do wafer com uma pistola de ar N2. Aquece-se a bolacha em uma chapa quente a 140 ° C durante 2 min.
- Plasma oxidar a superfície da bolacha de silício (1 min, 50 W).
- A superfície da bolacha de spin-revestimento com 3 ml SU-8 100 fotossensível (40 seg; 1.750 rpm).
- Pré-coze a pastilha revestida sobre uma placa quente a 65 ° C durante 10 min, depois rampa a temperatura até 95 ° C ao longo de 2 min. Manter essa configuração para uma 1 hora adicional.
- Alinhar um photomask contendo o projeto do canal desejado. Expor a resistir a 550-600 mJ / cm 2 de luz UV (350-400 nm). Máscaras podem ser projetados em AutoCAD e impresso em uma transparência com impressão de alta resolução.
- Pós-cozer a bolacha sobre uma placa quente a 65 ° C durante 1 min e 95 ° C durante 10 min, rampa tele temperatura como antes.
- Mergulhe o wafer em SU-8 solução reveladora por 10-15 min. Verifique para a conclusão do desenvolvimento de lavagem com isopropanol. Se um precipitado branco aparece, continuar a desenvolver. O molde mestre é mostrado na Figura 2A.
2. Litografia suave para Fabricação de microcanais
- Misture 35 ml polidimetilsiloxano (PDMS), base de elastômero com 3,5 ml de agente de cura PDMS.
- Coloque o molde mestre fabricado (padrão para cima) e uma pastilha de silício em branco em placas de Petri forradas com papel alumínio.
- Verter 20 mL de pré-polímero de PDMS no prato molde mestre e 15 ml no segundo prato. Eliminar bolsões de ar sob os wafers pressionando suavemente sobre eles com um aplicador de madeira descartáveis.
- Cubra ambos os pratos e reserve um dia para curar. Alternativamente, para a cura mais rápida, remover as bolhas de ar do PDMS usando um desgaseificador a vácuo e depois deixam-se os pratos em uma placa quente a 80 ° C durante 2hr.
- Retire o papel alumínio e retire o PDMS das bolachas.
- Utilizar a Harris Uni-Core (2,5 mm) para perfurar aberturas de acesso de fluidos em ambas as extremidades do canal. Corte o canal e branco PDMS em tiras de tamanho similar.
- Carregar o canal, a tira de placa de PDMS e uma lâmina de vidro (75 x 25 mm 2) no plasma de um oxidante, provavelmente localizado numa sala limpa. Expor a plasma de oxigênio por 40 segundos a 40 W de potência.
- Furar a peça de canal e lâmina de vidro para os lados opostos da tira de placa. Retiradas para 2 horas para completar a ligação.
- Coloque a montagem sobre uma placa quente a 120 ° C. Anexar tubos de plástico (diâmetro interno de 1/32 ", o diâmetro exterior de 3/32"), cada um, pelo menos, 6 cm de comprimento, com os reservatórios perfurados que utilizam pré-polímero de PDMS. Apor um conector de plástico fluídico para um ou ambos os tubos para permitir a ligação da seringa, ou utilizar acessórios disponíveis comercialmente.
- Permitir que o PDMS proteger a tubulação para curar. Insira 3 "comprimentos de calibre 22 fio de cobre isolado em each reservatório, entre o tubo de entrada e o canal, e seguro, com pré-polímero de PDMS. O produto final é mostrado na Figura 2B.
3. Electrotaxis Experiment
- Coloque a microcanais na fase (de preferência XY-móvel) de um microscópio com uma câmara montada ligada a um monitor (Figura 1).
- Ligue a fonte de alimentação ou fios de saída do amplificador para os eletrodos do microcanais. Uma simples fonte de alimentação DC é suficiente que apenas um sinal de corrente contínua for desejado, mas de um amplificador conectado a um gerador de funções permite a aplicação de sinais AC e DC pulsada bem.
- Aplica o tubo de saída do microcanal para uma seringa descartável. Imergir a boca do tubo de entrada em M9 tampão fisiológico e suavemente aspirar o líquido para dentro do canal por aplicação de uma pressão negativa no interior da seringa (quer manualmente ou utilizando uma bomba de seringa). Quando os tubos de entrada e de saída são ambas cheias com M9, desligar a seringa from o tubo. Nivelar os dois tubos para a mesma altura para impedir o fluxo de acionamento hidrostático.
- Aplicar uma tensão de CC para o canal e garantir que a resistência (R = V / I) é de cerca de 0,6 mohms (para uma redução de 50 mm de comprimento, 0,3 milímetros de largura e -0,1 mm de profundidade microcanal).
- Se estiver satisfeito com a integridade do canal, siga os passos acima para carregar os vermes de uma suspensão diluída para o canal.
- Retirar a seringa e hidrostática manipular o fluxo ajustando altura relativa dos tubos. É este método para colocar um sem-fim no centro do canal e, em seguida, colocar ambos os tubos no mesmo plano de elevação.
- Definir o fornecimento de energia para a tensão apropriada: 4-12 V / cm, para os animais fase L3, 4-10 V / cm, e para L4s 2-4 V / cm, para os adultos jovens. Ative o sinal elétrico e permitir que 1 min de pré-exposição para o worm para se aclimatar ao campo. O worm deve começar a se mover em direção ao cátodo. Quando o minuto passou, usar a câmera para começar a gravar.
- Para AC e pulsoexperimentos d CC, o campo elétrico resposta máxima pode ser adotada a partir do ciclo do sinal acima e freqüência e duty pode ser modulada como desejado 7, 8.
- Quando o experimento for concluído, remova todo o líquido (e vermes) do canal, lave-o com dH 2 0, e deixar o dispositivo em uma placa quente a 125 ° C para secar.
- Extrair dados locomotores de vídeos gravados manualmente usando NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou software de monitoramento verme baseada em MATLAB personalizado.
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Representative Results
Um vídeo representante electrotaxis um nematóide adulto jovem do tipo selvagem e sua posição e saídas de velocidade a partir do software de rastreamento verme são mostrados na Suplementar Video 1 e Figura 3. O próprio software de análise de movimento não reconhece a direção da polaridade do campo eo tempo de inversão de polaridade, mas sim, esta informação deve ser obtido a partir da fonte de vídeo. Isso pode ser feito usando um taco de áudio ou visual no vídeo ou escrevendo as condições experimentais e manipulações.
Electrotaxis dados de velocidade de um conjunto de animais de tipo selvagem (N2) e transgénicas (NL5901) são apresentados na Figura 4. Os animais NL5901 transportar gene α-sinucleína humana sob o controlo de unc-54 (gene da cadeia pesada da miosina) promotor. O expresso α-sinucleína no corpo músculos da parede agregados 9 e nossos resultados mostram que provoca anomalias no elecresposta trotactic. A velocidade de NL5901 vermes é significativamente mais lento do que o tipo selvagem. Para traçar o gráfico, calculamos a velocidade de vermes individuais e os resultados plotados em um gráfico de caixa utilizando o software estatístico Minitab ( http://www.minitab.com ). Além da velocidade, os outros parâmetros do movimento, tais como a resposta de viragem (tempo necessário para completar a inversão em resposta à mudança da polaridade do campo eléctrico) e da frequência corpo dobra (número médio de ondas sinusoidais por segundo), também pode ser analisada tal como descrito em outro lugar 5.
O protocolo electrotaxis funciona melhor com uma população sincronizado, o qual pode ser obtido por meio de tratamento com uma solução de lixívia (hipoclorito de sódio e 4 N hidróxido de sódio numa proporção em volume de 02:03), 10. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos a partir de populações sincronizados para descartar a idade e fase dependente da variação. Embora tenhamos usado adultos jovens (69 horas pós-L1 na200C), (L2 outras fases subsequentes) também podem ser testados.
Figura 1. Esquemático da plataforma de triagem microfluídicos para ensaio electrotaxis nematóide. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Molde principal (A) e totalmente montado do dispositivo de microcanal PDMS (B).
Figura 3. Posição em função do tempo (A) e velocidade instantânea (B) A produção de programa de rastreamento verme personalizado. Sourvideo ce é Suplementar Video 1 abaixo. O programa calcula a curva de velocidade a partir da curva de tempo de posição, mas ignora as pontas quando o cálculo da velocidade média.
Figura 4. Velocidade electrotaxis de N2 controle do tipo selvagem e vermes transgênicos NL5901. NL5901 vermes são significativamente mais lento do que o controle com p <0,0001. A significância é determinada usando o teste de Mann-Whitney não-paramétrico. n = 10 para N2, e n = 23 para NL5901.
Complementar Video 1. Comportamento Electrotactic de nematóide adulto jovem em um canal microfluídicos. Vídeo começa com cátodo para a direita. Aparência de vidro pipeta indica inversão de polaridade iminente; posterior remoção dos sinais momento de reversão da pipeta. Clique aqui para verfilme.
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Discussion
Aproveitando-se do fenômeno comportamental descrita pela primeira vez por Gabel e colegas e com base no trabalho de manipulação dieletroforética de Chuang e colegas 11,12, nosso ensaio electrotaxis baseado em microfluídica fornece um método fácil, robusto e sensível para investigar a atividade neuronal em vermes usando o movimento como uma saída. A análise dos parâmetros de movimento permite a comparação quantitativa entre os diferentes genótipos. A precisão de fabrico de microcanais e aplicação de campo eléctrico em conjunto proporcionam tanto um ambiente controlado e um meio para comunicar com o sem-fim para o controle de locomoção. Diferentes formas de onda de sinais eléctricos ter diferentes reflexões comportamentais no sem-fim e têm sido utilizadas tanto para estimular e inibir a locomoção.
A concepção de um único canal do presente dispositivo de microfluidos, que requer apenas um único sem-fim ser marcados de cada vez. Para isso, a solução de sem-fim deve ser suficientemente diluída com M9o buffer antes de tentar carregar vermes para o canal. É importante salientar que as operações de canal pode ser complicado pela presença de bolhas de ar e outras irregularidades que afectam a pressão hidrostática. Isto pode ser eliminado por lavagem com o canal de M9 e manipulando a elevação dos tubos de entrada e de saída.
O ensaio aqui descrito pode ser melhorado ainda mais. Um chip de multi-canal microfluídico pode acelerar rastreio sem fim, embora possa requerer integração de outros mecanismos de controlo, tais como carga sem-fim, o posicionamento e controlo. Maior automatização do protocolo electrotaxis, especialmente a gestão do fluxo controlado por computador, irá aumentar a eficiência. Essas melhorias estão atualmente em desenvolvimento em nosso laboratório.
Extracção de dados de vídeos electrotaxis locomoção foi inicialmente realizada manualmente, utilizando o ImageJ, que é um processo lento e tedioso. Para aumentar a eficiência e eliminar herro uman, nós começamos a usar um programa de rastreamento verme adaptado de uma embalagem original baseada em MATLAB desenvolvido no Instituto de Tecnologia da Califórnia 13. O software processa atualmente videos único sem-fim. A versão mais recente é adequado para uma ampla gama de ensaios, incluindo vermes tratados quimicamente e neuronais e mutantes musculares. Uma de suas limitações é que reversões espontâneas, observadas em alguns mutantes neuronais (eg, osm-5) 5, não são interpretados corretamente. Tais vermes devem ser analisados manualmente.
Limitações não obstante, microfluídicos electrotaxis pode ser aplicado em inúmeros contextos, incluindo ensaios de descoberta de drogas com modelos sem-fim de distúrbios relacionados ao movimento. Dada a sua responsabilidade para com a paralelização, electrotaxis é particularmente adequado para aplicações high-throughput screening. A análise genética e idade-dependente do comportamento electrotactic e degeneração neuronal também pode ser estudado com estesistema. Além disso, os vermes podem ser classificados por idade ou fenótipo para formar amostras sincronizadas ou para identificar novos mutantes para a frente telas genéticos 6,14.
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Disclosures
A tecnologia de ensaio electrotaxis microfluídicos foi apresentado para a patente nos Estados Unidos da América e Canadá.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia do Canadá, Canadá programa de Cátedras de Pesquisa, Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, e Ontário Ministério da Investigação e da Inovação através de seu Programa de investigadores em início Prêmio de apoio financeiro.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).