Summary
Полуавтоматические микро-электро-жидкостный способ индукции по требованию локомоция
Protocol
1. Фотолитографии для изготовления Master Mold
- Купайтесь 3 дюйма кремниевых пластин в ацетоне в течение 30 секунд, а затем метанолом в течение 30 сек. Промыть дН 2 0 воде в течение 5 мин.
- Сухой поверхности пластины с пушечным ударом N2. Нагрейте пластину на горячей плите при 140 ° С в течение 2 мин.
- Плазменный окисления поверхности кремниевой пластины (1 мин, 50 Вт).
- Спин-пальто по поверхности пластины с 3 мл СУ-8 100 фоторезиста (40 сек; 1750 оборотов в минуту).
- Предварительно выпекать покрытием пластин на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 10 мин, затем нарастить температуру до 95 ° С в течение 2 мин. Поддерживать эту настройку для еще 1 час.
- Совместите фотошаблонов содержащих нужный канал дизайна. Expose противостоять 550-600 мДж / см 2 УФ-света (350-400 нм). Photomasks могут быть разработаны в AutoCAD и печатается на прозрачной пленке с высоким разрешение печати.
- После выпечки вафельных на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 1 мин и 95 ° C в течение 10 мин, наращивает тон температуре, как раньше.
- Погрузите вафельные в SU-8 разработчик решений в течение 10-15 мин. Проверьте завершение разработки промывкой изопропанола. Если появляется белый осадок, продолжают развиваться. Мастер форма показана на фиг.2А.
2. Мягкой литографии для изготовления Microchannel
- Смешайте 35 мл полидиметилсилоксана (ПДМС) эластомера основание с 3,5 мл PDMS отверждающего агента.
- Поместите изготовлены мастер-форма (шаблон вверх), и пустой кремниевой пластины в чашки Петри облицованы алюминиевой фольгой.
- Налить 20 мл PDMS форполимеру в блюдо мастер формы и 15 мл во второе блюдо. Устранения воздушных пробок под пластин, слегка нажав на них с одноразовой деревянной аппликатором.
- Обложка оба блюда и отложите в течение дня, чтобы вылечить. Кроме того, для более быстрого высыхания удалить пузырьки воздуха из PDMS с помощью вакуумного деаэратора, а затем оставить блюдо на горячей плите при 80 ° С в течение 2HR.
- Снимите фольгу и кожица PDMS от пластин.
- Используйте Харриса Uni-Core (2,5 мм) пробить жидкости портов доступа на обоих концах канала. Отрежьте канал и пустые PDMS в аналогичных размеров полос.
- Загрузите канал, пустой PDMS полосы и стекло (75 × 25 мм 2) в плазме окислитель, вероятно, находится в чистом помещении. Подвергать воздействию кислородной плазмы в течение 40 с при 40 Вт.
- Палка часть канала и стекло с противоположных сторон заготовки полосы. Выделить в течение 2 часов для завершения связи.
- Поместите сборку на горячей плите при температуре 120 ° C. Прикрепите пластиковые трубы (внутренний диаметр 1/32 ", наружным диаметром 3/32"), каждая не менее 6 дюймов длиной, с пробитыми резервуаров использованием PDMS форполимеру. Прикрепите жидкостный пластиковый разъем на одну или обе трубы, чтобы шприц привязанности, или использовать имеющиеся в продаже арматуры.
- Разрешить PDMS обеспечении трубки, чтобы вылечить. Вставьте 3 "длиной 22 калибра изолированной медной проволоки в EACч водохранилища, между входе в трубу и канал, и безопасную форполимеру PDMS. Готовое изделие показано на фиг.2В.
3. Эксперимент электротаксис
- Поместите микроканальным на сцене (желательно XY-подвижные) микроскопа с установленным на камеру, подключенную к монитору (рис. 1).
- Подключите блок питания или выходе усилителя провода к микроканальным в электродах. Простой источник питания постоянного тока достаточно, если только сигнал постоянного тока желательна, но усилитель подключен к функции генератора позволяет применять импульсного постоянного и переменного тока сигналы.
- Прикрепить микроканальным в выходной трубки одноразового шприца. Погрузите устье впускной трубы в M9 физиологическом буфере и осторожно стремятся жидкости в канал, если отрицательное давление внутри шприца (либо вручную, либо с использованием шприца). Когда входной и выходной труб и заполненных М9, отсоединить шприц еПЗУ трубки. Уровня как трубы на ту же высоту, чтобы предотвратить поток с гидростатическим приводом.
- Применение напряжения постоянного тока в канал и гарантировать, что сопротивление (R = V / I) составляет около 0,6 МОм (при 50 мм, шириной 0,3 мм и ~ 0,1 мм в глубину микроканала).
- Если вы согласны с целостности канала, выполните указанные выше действия для загрузки червей разбавленной суспензии в канал.
- Отсоедините шприц и гидростатическим манипулировать потоком, регулируя относительную высоту трубы. Используйте этот метод, чтобы поместить червя в центре канала, а затем лежали обе трубы плоские на той же высоте.
- Установка блока питания к соответствующим напряжение: 4-12 В / см для животных L3 этап, 4-10 В / см в течение L4S и 2-4 В / см для молодых взрослых. Активируйте электрический сигнал и Подождите около 1 минуты до контакта для червя, чтобы акклиматизироваться к полю. Червь должны начать движение по направлению к катоду. Когда минута прошла, использовать камеру, чтобы начать запись.
- Для переменного и импульсногог DC экспериментах максимальный реагировать электрическое поле может быть принята сверху и частоту и рабочий цикл сигнал может быть модулирован в соответствии с пожеланиями 7, 8.
- Когда эксперимент закончен, удаления всей жидкости (и черви) из канала, промойте его дН 2 0, и оставить устройство на горячей плите при 125 ° С, чтобы высохнуть.
- Извлечение данных из двигательного видеозаписей вручную с помощью NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) или пользовательские MATLAB на основе червя отслеживания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель видео электротаксис дикого типа молодых взрослых нематод и его положение и скорость выхода из программы слежения червь приведены в дополнительном Video 1 и на фиг.3. Программное обеспечение анализа движения сама не распознает направление пол рность пол, а время изменения полярности, а, скорее, эта информация должна быть получена от источника видеосигнала. Это может быть сделано с помощью аудио или визуального сигнала в видео или записывать экспериментальных условиях и манипуляций.
Электротаксис передачи данных из набора дикого типа (N2) и трансгенных животных (NL5901) отображаются на рисунке 4. NL5901 животные являются носителями человеческого α-синуклеина под контролем UNC-54 (миозин гена тяжелой цепи) промоутером. Выраженные α-синуклеина в мышцах стенки тела 9 агрегатов и наши результаты показывают, что он вызывает нарушения в электронtrotactic ответа. Скорость NL5901 червей значительно медленнее, чем дикий тип. Чтобы построить график, мы рассчитали скорость отдельных червей и графических результатов в коробке Minitab участка на основе статистического программного обеспечения ( http://www.minitab.com ). В дополнение к скорости, другие параметры движения, такие как поворот ответа (время, необходимое для завершения разворота в ответ на изменение полярности электрического поля) и тело изгиб частоты (среднее число синусоидальных волн в секунду), также могут быть проанализированы, как описано в другом месте 5.
Электротаксис протокол лучше всего работает с синхронизированным населения, которые могут быть получены путем обработки раствором отбеливателя (гипохлорит натрия и 4 N гидроксида натрия в объемном соотношении 2:03) 10. Все представленные здесь данные были получены из синхронных населения, чтобы исключить возрасту и стадии-зависимые вариации. В то время как мы использовали молодые люди (69 ч после введения в L1200C), другие этапы (L2 и выше) также могут быть проверены.
Рисунок 1. Схема микрожидкостной платформы скрининга нематоды анализа электротаксис. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Мастер форм (А) и полностью собранном PDMS микроканальной устройство (В).
Рисунок 3. Позиция в зависимости от времени (А) и мгновенная скорость (В) выходы пользовательские программы слежения червя. КислыйCE видео Дополнительное видео 1 ниже. Программа вычисляет скорость кривой с позиции времени кривая но игнорирует шипы при расчете средней скорости.
Рисунок 4. Электротаксис скоростью дикого типа управления N2 и трансгенных червей NL5901. NL5901 червей значительно медленнее, чем управление с р> 0,0001. Значение определяется с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. N = 10 для N2 и N = 23 для NL5901.
Дополнительное видео 1. Electrotactic поведение молодых взрослых нематод в микрофлюидном канала. Видео начинается с катода вправо. Появление стеклянной пипетки указывает на неизбежный переполюсовки; последующее удаление момент пипетки сигналы разворота. Щелкните здесь для просмотрафильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Воспользовавшись тем, что поведенческий феномен впервые описан Габель и коллег и здания на работу диэлектрофореза манипуляции Чжуан 11,12 и коллеги, наши микрожидкостной основе анализа электротаксис обеспечивает простой, надежный и чувствительный метод для исследования активности нейронов в червей использующих движение выход. Анализ движения параметров позволяет количественное сравнение между различными генотипами. Точность изготовления и микроканальным применении электрического поля вместе обеспечивают как контролируемую среду и средств для общения с червем для передвижения контроля. Различные формы волны электрического сигнала имеют различные поведенческие отражения в червя и были использованы для как стимулировать, так и подавлять передвижения.
Одноканальный конструкция настоящего Микрожидкостных устройство требует, чтобы только один червь забито одновременно. Для этого червь раствор должен быть достаточно разбавляют М9буфер, прежде чем пытаться загрузить червей в канал. Важно отметить, что канал операции могут быть осложнен наличием пузырьков воздуха и других нарушений, влияющих на гидростатическое давление. Это может быть устранено путем промывки канала с M9 и манипулирования высоты на входе и выходе трубы.
Анализ, описанный здесь, могут быть улучшены. Многоканальный микрофлюидного чипа может ускорить червь скрининга, хотя это потребует интеграции другие механизмы управления, такие как червь загрузки, позиционирования и слежения. Дальнейшая автоматизация протокола электротаксис, особенно с компьютерным управлением потоком управления, будет способствовать повышению эффективности. Эти усовершенствования в настоящее время разрабатываются в нашей лаборатории.
Извлечение данных из передвижение видео электротаксис была изначально выполнена вручную с помощью ImageJ, которое является медленным и трудоемким процессом. Для повышения эффективности и устранения чУмань ошибки, мы начали использовать программу отслеживания червя взято из оригинальной MATLAB-пакет на базе разработанной в Калифорнийском технологическом институте 13. Программное обеспечение в настоящее время обрабатывает одно-червь видео. Последний вариант подходит для широкого спектра анализов, включающих химически обработанной червей и нейронные и мышечные мутантов. Один из ее ограничений является спонтанным разворотов, наблюдаемых в некоторых нейронов мутантов (например, ОСМ-5) 5, не интерпретируются правильно. Такие черви должны быть проанализированы вручную.
Ограничения несмотря на это, микрожидкостной электротаксис может быть применена во множестве контекстов, в том числе лекарственных препаратов анализы с червячной моделей движения расстройств, связанных с. Учитывая его ответственностью перед распараллеливания, электротаксис особенно хорошо подходит для высокопроизводительных приложений скрининга. Генетические и возрастной анализ electrotactic поведение и дегенерации нейронов также могут быть изучены с этимсистемы. Кроме того, черви могут быть отсортированы по возрасту или фенотипа, чтобы сформировать синхронизированные образцов или для выявления новых мутантов для прямой генетический скрининг 6,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Микрожидкостных анализа электротаксис технология была подана на патент в Соединенных Штатах Америки и Канаде.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады, Канада Исследование программы кафедр, Канадский институт исследований в области здравоохранения, и Онтарио министерство исследований и инноваций через их раннего премии Исследователи Программы финансовой поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
