Summary
En semi-automatisert mikro-elektro-fluidic metode for å indusere on-demand bevegelse i
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans er en allsidig modell organisme for biomedisinsk forskning på grunn av sin bevaring av sykdomsrelaterte gener og gangstier samt sin enkle dyrking. Flere C. elegans sykdomsmodeller har blitt rapportert, inkludert neurodegenerative lidelser så som Parkinsons sykdom (PD), som innebærer degenerasjon av dopaminerge (DA) neuroner 1. Begge transgener og nevrotoksiske kjemikalier har blitt brukt til å indusere DA nevrodegenerasjon og påfølgende bevegelse defekter i ormer, noe som åpner for undersøkelser av grunnlaget for nevrodegenerasjon og skjermer for nervecellene gener og forbindelser 2,3.
Skjermer i lavere eukaryoter som C. elegans gi en effektiv og økonomisk måte å identifisere forbindelser og gener som påvirker nevrale signalering. Konvensjonelle skjermer er vanligvis utføres manuelt og scoret ved visuell inspeksjon, derfor de er tid-consuming og utsatt for menneskelige feil. I tillegg, mest fokus på cellenivå analyse og overser bevegelse, som er en spesielt viktig parameter for bevegelsesforstyrrelser.
Vi har utviklet en ny microfluidic screening system (Figur 1) som kontrollerer og kvantifiserer C. elegans 'bevegelse ved hjelp av elektriske feltet stimuli inne microchannels. Vi har vist at en likespenning (DC)-feltet kan robustly indusere on-demand bevegelse mot katoden ("electrotaxis") 4. Reversere feltets polaritet fører til at ormen å raskt snu retningen også. Vi har også vist at defekter i dopaminerge og andre sensoriske nerveceller endre svømming respons fem. Derfor kan unormalt i nevrale signalering bestemmes ved hjelp av bevegelse som en skrivebeskyttet ut. Bevegelsen respons kan være nøyaktig kvantifiseres ved hjelp av en rekke parametere som svømming hastighet, kroppen bøyd frekvens og reversering tid.
fire. Disse funnene førte oss til å designe en ny microfluidic enhet til passivt sorterer ormer etter alder og fenotype seks.
Vi har også testet responsen av ormer på pulserende DC og vekselstrøm (AC) elektriske felt. Taktet felt av ulike avgifter sykluser effektivt genererte electrotaxis både C. elegans og sin fetter C. briggsae 7. I et annet eksperiment, immobilisert symmetriske AC felt med frekvenser fra 1 Hz til 3 kHz ormer inne i kanalen 8.
Gjennomføring av det elektriske felt i et mikrofluidteknisk miljø muliggjør rask og automatisert utførelse av electrotaxis analysen. Denne tilnærmingen lover å legge til rette for høy gjennomstrømming genetiske og kjemiske skjermer for faktorerpåvirker nevronal funksjon og levedyktighet.
Protocol
En. Photolithography for Master Mold Fabrication
- Bade en 3 i. silisiumskive i aceton i 30 sekunder og deretter metanol i 30 sek. Rens med dH 2 0 vann i 5 min.
- Tørk wafer overflate med en N2 blåserør. Varm opp skiven på en varm plate ved 140 ° C i 2 min.
- Plasma oksidere overflaten av silisiumskiven (1 minutt, 50 W).
- Spin-coat wafer overflate med 3 ml SU-8 100 fotoresist (40 sekunder; 1750 rpm).
- Pre-bake den belagte skive på en kokeplate ved 65 ° C i 10 min, deretter rampe temperaturen opp til 95 ° C i løpet av 2 min. Opprettholde denne innstillingen for en ytterligere 1 time.
- Justere en photomask inneholder ønsket kanal design. Utsett motstå til 550-600 mJ / cm 2 av UV-lys (350-400 nm). Fotomasker kan utformes i AutoCAD og skrives ut på en transparent med høy oppløsning utskrift.
- Post-bake skiven på en kokeplate ved 65 ° C i 1 min og 95 ° C i 10 min, med gradient than temperatur som tidligere.
- Dypp wafer i SU-8 utvikler løsning for 10-15 min. Se etter ferdigstillelse av utbygging ved å skylle med isopropanol. Hvis et hvitt bunnfall vises, videreutvikle. Master mugg er vist i figur 2A.
2. Myk Litografi for microchannel Fabrication
- Bland 35 ml polydimetylsiloksan (PDMS) elastomer base med 3,5 ml PDMS herdemiddel.
- Plasser fabrikkert mester mold (mønster vendt opp) og en blank silisium wafer i petriskåler foret med aluminiumsfolie.
- Hell 20 ml PDMS forpolymer inn master mold fatet og 15 ml inn i den andre parabolen. Eliminere luftlommer under wafere ved å trykke forsiktig på dem med en disponibel tre applikator.
- Dekke både retter og sett til side for en dag å kurere. Alternativt, for raskere herding, fjerne luftbobler fra PDMS ved hjelp av et vakuum og deretter la degasifier rettene på en varm plate ved 80 ° C i 2hr.
- Ta av folien og skrelle den PDMS fra wafere.
- Bruk Harris Uni-kjerne (2,5 mm) for å lage hull i fluid tilgang porter ved begge ender av kanalen. Skjær kanalen og blank PDMS inn like store strimler.
- Laste kanal, den tomme PDMS stripe og en glass-slide (75 × 25 mm 2) inn i en plasma oksidant, sannsynligvis ligger i et renrom. Utsettes for oksygen plasma i 40 sekunder ved 40 W effekt.
- Kleb kanal stykke og glass-slide med motsatte sider av den tomme strimmel. Satt til side i 2 timer for å fullføre bindingen.
- Plasser montering på en varm plate ved 120 ° C. Fest plastrør (indre diameter 1/32 ", ytre diameter 3/32"), hver i det minste 6 tommer lang, til de utstansede reservoarer ved hjelp av PDMS forpolymer. Fest en fluidic plast-kontakt til en eller begge rør for å tillate sprøyte vedlegg, eller bruke kommersielt tilgjengelig tilbehør.
- Tillat PDMS fester slangen å kurere. Sett 3 "lengder på 22 gauge isolert kobbertråd inn EACh reservoaret, mellom inntaket rør og kanaler, og fest med PDMS forpolymer. Det ferdige produkt er vist i figur 2B.
3. Electrotaxis Experiment
- Plasser microchannel av stadium (fortrinnsvis XY-bevegelig) av et mikroskop med et montert kamera koplet til en monitor (figur 1).
- Koble til strømforsyningen eller forsterkerens utgang ledninger til microchannel elektroder. En enkel likestrømforsyning er tilstrekkelig hvis bare en DC-signal er ønsket, men en forsterker koplet til en funksjonsgenerator muliggjor anvendelse av pulsert DC-og AC-signaler i tillegg.
- Fest microchannel utgang rør til en engangssprøyte. Senk munningen av innløpsrøret i M9 fysiologisk buffer og forsiktig aspirere væske inn i kanalen ved å påføre et negativt trykk inne i sprøyten (enten manuelt eller ved hjelp av en sprøytepumpe). Når innløp og utløp rør er begge fylt med M9, koble sprøyten from røret. Nivå begge rørene til samme høyde for å hindre hydrostatisk drevet flyt.
- Påfør en likespenning til kanalen og sørge for at motstanden (R = V / I) er rundt 0,6 MΩ (for en 50 mm lang, 0,3 mm bred og ~ 0,1 mm dyp microchannel).
- Hvis fornøyd med kanalens integritet, følg trinnene over for å legge ormer fra en fortynnet suspensjon inn i kanalen.
- Koble sprøyten hydrostatisk manipulere strømmen ved å justere rørene relative høyde. Bruk av denne metoden for å plassere en orm i midten av kanalen og deretter legge begge rørene flate i samme høyde.
- Sett strømforsyningen på riktig spenning: 4-12 V / cm for L3 scenen dyr, 4-10 V / cm for L4S, og 2-4 V / cm for unge voksne. Aktiver elektrisk signal og la en min av pre-eksponering for ormen å akklimatisere til feltet. Ormen bør begynne å bevege seg mot katoden. Når minuttet har gått, bruker kameraet for å starte innspillingen.
- For AC og pulsd DC eksperimenter, kan den maksimale respons elektriske feltet bli vedtatt ovenfra og frekvens og driftssyklus av signalet kan moduleres etter ønske 7, 8..
- Når eksperimentet er ferdig, fjerner all væske (og ormer) fra kanalen, skyll den med dH 2 0, og la enheten på en varm plate på 125 ° C til tørk.
- Utdrag motorisk data fra innspilte videoer manuelt ved hjelp av NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) eller egendefinerte MATLAB-basert orm sporing programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En representant video av en vill-type ung voksen nematode er electrotaxis og sin posisjon og hastighet utganger fra ormen sporing er vist i Supplementary Video 1 og figur 3. Bevegelsen analyse selve programvaren ikke gjenkjenner retning av feltet polaritet og tidspunktet for polaritet reversering, heller, må denne informasjonen innhentes fra kilden video. Dette kan gjøres ved hjelp av en lyd-eller visuell indikator på video eller skrive ned eksperimentelle forhold og manipulasjoner.
Electrotaxis speed data fra et sett med vill-type (N2) og transgene dyr (NL5901) vises i figur 4. De NL5901 dyr bære menneskelig α-synuclein genet under kontroll av unc-54 (myosin heavy kjeden genet) promoter. Det uttrykkes α-synuclein i kroppen veggen muskler tilslag 9 og våre resultater viser at det fører til unormalt i elektrotrotactic respons. Hastigheten på NL5901 ormer er betydelig tregere enn vill type. For å plotte grafen, regnet vi hastigheten på enkelte ormer og plottet resulterer i et boksplott ved hjelp av Minitab statistisk programvare ( http://www.minitab.com ). I tillegg til hastighet, andre parametere for bevegelse, slik som å dreie respons (tiden det tar å fullføre reversering som respons på elektrisk felt polaritet forandring) og legeme bøying frekvens (gjennomsnittlig antall sinusbølger per sekund), kan også bli analysert som beskrevet andre steder 5.
Den electrotaxis protokollen fungerer best med en synkronisert befolkning, som kan fås via behandling med et blekemiddel (natriumhypokloritt og 4 N natriumhydroksid i en 2:03 volum ratio) 10. Alle data som presenteres her er hentet fra synkroniserte populasjoner for å utelukke alder-og scene-avhengige variasjon. Mens vi har brukt unge voksne (69 hr post-L1 på200C), kan andre faser (L2 og utover) også testes.
Figur 1. Skjematisk av microfluidic screening plattform for nematode electrotaxis analysen. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Master mold (A) og ferdig montert PDMS microchannel enhet (B).
Figur 3. Posisjon mot tid (A) og momentan hastighet (B) utganger av tilpassede orm sporing program. Source video er Supplementary Video 1 nedenfor. Programmet beregner hastighet kurve fra stillingen-tid kurve, men ser bort fra toppene ved beregning av gjennomsnittlig hastighet.
Figur 4. Electrotaxis hastighet av vill type kontroll N2 og transgene NL5901 ormer. NL5901 ormer er betydelig tregere enn kontroll med p> 0,0001. Betydning bestemmes ved hjelp av ikke-parametrisk Mann-Whitney test. n = 10 for N2 og n = 23 for NL5901.
Supplerende Video 1. Electrotactic oppførselen til ung voksen nematode i en microfluidic kanal. Video begynner med katoden til høyre. Utseende av glass pipette indikerer forestående polaritet reversering; påfølgende fjerning av pipetten signaler øyeblikks reversering. Klikk her for å sefilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å dra nytte av atferdsmessige fenomen først beskrevet av Gabel og kolleger og bygge på dielectrophoretic manipulasjon arbeidet med Chuang og kolleger 11,12, gir vår mikrofluidteknisk-baserte electrotaxis analysen en enkel, robust og sensitiv metode for å sondere neuronal aktivitet i ormer som bruker bevegelse som en utgang. Analysen av bevegelse parametere tillater kvantitativ sammenligning mellom forskjellige genotyper. Presisjonen av microchannel fabrikasjon og elektrisk felt anvendelse sammen tilveiebringer både et kontrollerbart miljø og et middel for å kommunisere med den orm for bevegelse kontroll. Forskjellige elektriske signal bølgeformer har ulike atferdsmessige refleksjoner i ormen og har blitt brukt til både stimulere og hemme bevegelse.
Den enkanals utforming av den foreliggende mikrofluidteknisk enheten krever at bare et enkelt orm scores på en gang. For dette, må ormen løsning være tilstrekkelig fortynnet med M9buffer før du forsøker å laste ormer inn i kanalen. Det er viktig å påpeke at kanal operasjoner kan kompliseres ved nærværet av luftbobler og andre uregelmessigheter som påvirker det hydrostatiske trykk. Dette kan elimineres ved å spyle-kanal med M9 og manipulere heving av innløp-og utløp-rør.
Analysen som beskrives her, kan forbedres ytterligere. Et flerkanals microfluidic chip kunne akselerere ormen screening, men det vil kreve integrasjon av andre kontrollmekanismer som ormen lasting, posisjonering og sporing. Ytterligere automatisering av electrotaxis protokollen, spesielt datastyrt flow management, vil øke effektiviteten. Disse forbedringene er for tiden under utvikling i vårt laboratorium.
Utvinning av bevegelsesmønstrene data fra electrotaxis videoer ble opprinnelig utført manuelt ved hjelp ImageJ, som er en langsom og langtekkelig prosess. For å øke effektiviteten og eliminere hUman feil, har vi begynt å bruke en orm sporing program tilpasset fra en opprinnelig MATLAB-basert pakke utviklet ved California Institute of Technology 13. Programvaren behandler for tiden single-ormen videoer. Den nyeste versjonen er egnet for et bredt spekter av tester, inkludert kjemisk behandlet ormer og nevrale og muskel mutanter. En av begrensningene er at spontane reverseringer, observert i enkelte nevrale mutanter (f.eks osm-5) 5, ikke er tolket riktig. Slike ormer må analyseres manuelt.
Begrensninger tross, kan microfluidic electrotaxis brukes i utallige sammenhenger, inkludert drug discovery analyser med ormen modeller av bevegelse-relaterte lidelser. Vurderer sin amenability til parallellisering, er electrotaxis spesielt godt egnet for high-throughput screening programmer. Genetisk og alder-avhengige analyse av electrotactic atferd og neuronal degenerasjon kan også bli studert med dettesystem. I tillegg kan ormer bli sortert etter alder eller fenotype å danne synkronisert prøver eller å identifisere nye mutanter for fremover genetiske skjermer 6,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Microfluidic electrotaxis analysen teknologi har blitt arkivert for patent i USA og Canada.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Research Stoler Program, kanadiske Institutes of Health Research, og Ontario Ministry of Research and Innovation gjennom sin Tidlig Forskere Award Program for økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
