Summary
Eine halbautomatische mikroelektromechanischen fluidischen Verfahren zur On-Demand-Fortbewegung in induzieren
Abstract
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein vielseitiges Modell für biomedizinische Forschung wegen seiner Erhaltung der krankheitsbedingten Gene und Signalwege sowie seiner einfachen Anbau. Mehrere C. elegans Erkrankungsmodellen berichtet worden, wie neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit (PD), welche die Degeneration dopaminerger (DA) Neuronen 1 umfasst. Beide Transgene und neurotoxische Chemikalien verwendet worden, um DA Neurodegeneration und damit verbundene Bewegung Defekte in Würmern zu induzieren, so dass für Untersuchungen der Grundlage der Neurodegeneration und Bildschirme für neuroprotektive Gene und Verbindungen 2,3.
Screens in niederen Eukaryoten wie C. elegans stellen ein effizientes und wirtschaftliches Mittel, um Verbindungen und Gene, die neuronale Signalübertragung identifizieren. Herkömmliche Bildschirme sind in der Regel manuell durchgeführt und erzielte durch visuelle Inspektion, folglich sind sie Zeit-consuming und anfällig für menschliche Fehler. Zusätzlich sind die meisten konzentrieren sich auf zellulärer Ebene Analyse unter Ignorierung Fortbewegung, ist das ein besonders wichtiger Parameter für Bewegungsstörungen.
Wir haben einen neuen mikrofluidischen Screening-System (Abbildung 1), die quantifiziert und steuert C entwickelt elegans 'Fortbewegung mit elektrischen Feldes innerhalb Mikrokanäle Reize. Wir haben gezeigt, dass ein Gleichstrom (DC)-Feld kann robust on-demand Fortbewegung in Richtung der Kathode ("electrotaxis") 4 induzieren. Umkehrung des Feldes Polarität der Wurm schnell seine Richtung umzukehren als gut. Wir haben auch gezeigt, dass Defekte in dopaminergen und anderen sensorischen Neuronen den Swimming Antwort 5 ändern. Daher kann Anomalien in neuronalen Signalübertragung ermittelt Fortbewegung als read-out werden. Die Bewegung Antwort kann genau quantifiziert werden mit einer Reihe von Parametern wie Geschwindigkeit Schwimmen, Körper Biegeeigenfrequenz und Wendezeit.
4 Larven. Diese Erkenntnisse führten wir eine neue Mikrofluidikvorrichtung passiv sortieren Würmer nach Alter und Phänotyp 6 entwerfen.
Wir haben auch die Reaktion der Würmer gepulsten DC getestet und Wechselstrom (AC) elektrische Felder. Pulsed DC Felder der verschiedenen Arbeitszyklen effektiv erzeugt electrotaxis sowohl in C. elegans und seinen Cousin C. briggsae 7. In einem anderen Experiment immobilisiert symmetrisch Wechselfelder mit einer Frequenz von 1 Hz bis 3 KHz Würmer in den Kanal 8.
Umsetzung des elektrischen Feldes in einem mikrofluidischen Umgebung ermöglicht eine schnelle und automatisierte Ausführung des electrotaxis Assay. Dieser Ansatz verspricht hohen Durchsatz genetischen und chemischen Faktoren für Bildschirme erleichternbeeinflussen neuronale Funktion und Lebensfähigkeit.
Protocol
1. Photolithographie für Master Mold Fabrication
- Bathe eine 3 Zoll Siliziumwafer in Aceton 30 sec und dann mit Methanol für 30 sek. Spülen Sie mit dH 2 0 Wasser für 5 min.
- Trocknen Sie die Oberfläche des Wafers mit einem N2 Blaspistole. Erhitzen des Wafers auf einer heißen Platte bei 140 ° C für 2 min.
- Plasma die Oxidation der Oberfläche des Silizium-Wafers (1 min, 50 W).
- Spin-Mantel der Oberfläche des Wafers mit 3 ml SU-8 Fotolack 100 (40 sec; 1.750 rpm).
- Pre-Bake der beschichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 10 min, dann die Rampe die Temperatur bis zu 95 ° C über 2 min. Halten Sie diese Einstellung für eine zusätzliche 1 Stunde.
- Richten Sie ein Photomaske mit dem gewünschten Kanal Design. Freilegen zu 550-600 mJ / cm 2 UV-Licht (350-400 nm) zu widerstehen. Photomasks können in AutoCAD entworfen und gedruckt auf einer Transparenz mit hoher Druckauflösung.
- Nachhärten des Wafers auf einer heißen Platte bei 65 ° C für 1 min und 95 ° C für 10 min, Rampen ter Temperatur wie zuvor.
- Tauchen Sie den Wafer in SU-8-Entwickler-Lösung für 10-15 min. Überprüfen Sie für die Fertigstellung der Entwicklung durch Spülen mit Isopropanol. Wenn ein weißer Niederschlag erscheint, weiter zu entwickeln. Die Master-Form ist in 2A gezeigt.
2. Soft-Lithographie für Microchannel Fabrication
- Mischen 35 ml Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerbasis mit 3,5 ml PDMS Härtungsmittel.
- Setzen Sie den Master hergestellt Form (Muster nach oben) und eine leere Siliziumwafer in Petrischalen mit Alufolie ausgekleidet.
- Gießen Sie 20 ml PDMS Prepolymer in die Urform Schale und 15 ml in das zweite Gericht. Beseitigen Sie Lufteinschlüsse unter den Wafern durch leichten Druck auf sie mit einem Einweg-Holz-Applikator.
- Titelbild beide Gerichte und beiseite für einen Tag, um zu heilen. Alternativ zur schnelleren Aushärtung entfernen Luftblasen aus dem PDMS mit einem Vakuumentgaseranlage und verlassen dann die Gerichte auf einer Heizplatte bei 80 ° C für 2hr.
- Entfernen Sie die Folie und schälen die PDMS von den Wafern.
- Verwenden Sie die Harris Uni-Core (2,5 mm), um Flüssigkeit Access Ports an beiden Enden des Kanals zu stanzen. Schneiden Sie den Kanal und leere PDMS in ähnlich große Streifen schneiden.
- Legen Sie den Kanal, den Rohling PDMS-Streifen und einen Glasträger (75 × 25 mm 2) in ein Plasma Oxidationsmittel, wahrscheinlich in einem Reinraum befindet. Expose zum Sauerstoff-Plasma für 40 sec bei 40 W Leistung.
- Haften die Kanalstück und Objektträger auf gegenüberliegenden Seiten des Rohlings Streifen. Beiseite für 2 Stunden, um die Bindung zu vervollständigen.
- Legen Sie die Baugruppe auf einer Heizplatte bei 120 ° C. Befestigen Kunststoffschlauch (Innendurchmesser 1/32 ", Außendurchmesser 3/32"), die jeweils mindestens 6 mm lang, um die ausgestanzten Behältern mit PDMS Prepolymer. Bringen Sie eine fluidische Kunststoff-Stecker auf eine oder beide Röhren Spritze Befestigung ermöglichen, oder verwenden Sie handelsübliche Armaturen.
- Lassen Sie das PDMS Sicherung der Schlauch zu heilen. Legen Sie 3 "Längen von 22-Gauge-isoliertem Kupferdraht in each Reservoir, zwischen dem Eingang und dem Rohr-Kanal und sicher mit PDMS Prepolymer. Das fertige Produkt wird in 2B gezeigt.
3. Electrotaxis Experiment
- Legen Sie die Mikrokanalstruktur auf der Bühne (vorzugsweise XY-bewegliche) eines Mikroskops mit einer fest montierten Kamera mit einem Monitor verbunden (Abbildung 1).
- Schließen Sie das Netzteil oder Ausgang des Verstärkers Drähte an der Mikrokanalstruktur der Elektroden. Eine einfache Gleichstromversorgung nicht ausreichend, wenn nur ein DC-Signal gewünscht wird, sondern ein Verstärker, der mit einem Funktionsgenerator ermöglicht Einsatz von gepulsten DC-und AC-Signale als auch.
- Bringen Sie die Mikrokanalstruktur den Ausgang Rohr zu einer Einwegspritze. Tauchen der Mund des Einlaßrohres in M9 physiologischen Puffer und sanft streben Flüssigkeit in dem Kanal durch Anlegen eines Unterdrucks im Inneren der Spritze (entweder manuell oder unter Verwendung einer Spritzenpumpe). Wenn die Ein-und Auslass Rohre sowohl mit M9 gefüllt, ziehen Sie die Spritze from die Röhre. Wert, den beide Rohre auf die gleiche Höhe hydrostatisch angetriebene Strömung zu verhindern.
- Anwenden einer Gleichspannung an den Kanal und zu gewährleisten, dass der Widerstand (R = V / I) beträgt etwa 0,6 MOhm (für eine 50 mm lang, 0,3 mm breit und 0,1 mm tief ~ Mikrokanal).
- Wenn mit dem Kanal die Integrität erfüllt, befolgen Sie die obigen Schritte, um Würmer aus einer verdünnten Suspension laden in den Kanal.
- Trennen Sie die Spritze und hydrostatisch manipulieren die durch Einstellen der Röhrchen relative Höhe. Verwenden Sie diese Methode, um einen Wurm in der Mitte des Kanals zu platzieren und dann legen die beiden Rohre flach auf der gleichen Höhe.
- Stellen Sie die Stromversorgung auf die entsprechende Spannung: 4-12 V / cm für L3 Stadium Tiere, 4-10 V / cm für L4s und 2-4 V / cm für junge Erwachsene. Aktivieren Sie das elektrische Signal und damit 1 min von Vorbelichtung für die Schnecke auf dem Gebiet akklimatisieren. Der Wurm sollte beginnen, sich in Richtung der Kathode. Wenn die Minute vergangen ist, verwenden Sie die Kamera, um die Aufnahme zu starten.
- Für AC-und Impuls-d DC Experimente, die maximale Reaktion elektrische Feld kann von oben und von Frequenz und Tastverhältnis des Signals angenommen werden kann wie gewünscht moduliert 7, 8.
- Als Experiment beendet ist, entfernen Sie alle Flüssigkeit (und Würmer) aus dem Kanal, spülen Sie es mit dH 2 0, und lassen Sie das Gerät auf einer Heizplatte bei 125 ° C zu trocknen.
- Auszug Bewegungsapparates Daten von aufgenommenen Videos manuell mit NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) oder benutzerdefinierte MATLAB-basierten Wurm-Tracking-Software.
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Representative Results
Eine repräsentative Video von einem Wildtyp-young adult Nematoden electrotaxis und ihre Position und Geschwindigkeit Ausgänge von der Schnecke Tracking-Software sind in Ergänzende Video 1 und Abbildung 3 dargestellt. Die Bewegungsanalyse-Software selbst nicht erkennt die Richtung des Feldes Polarität und die Zeit der Umpolung, sondern müssen diese Informationen von der Quelle Video erhalten werden. Dies könnte mit Hilfe eines Audio-oder visuellen Hinweis in der Video-oder aufzuschreiben experimentellen Bedingungen und Manipulationen werden.
Electrotaxis Geschwindigkeit Daten aus einer Reihe von Wildtyp-(N2) und transgenen Tieren (NL5901) sind in Abbildung 4 dargestellt. Die NL5901 Tiere tragen menschliche α-Synuclein-Gen unter der Kontrolle von unc-54 (Myosin schwere Kette-Gen)-Promotor. Das exprimierte α-Synuclein in Körper Wand Muskeln Aggregate 9 und unsere Ergebnisse zeigen, dass es Anomalien in der Elek verursachttrotactic Antwort. Die Geschwindigkeit der NL5901 Würmer ist deutlich langsamer als der Wildtyp. Um die Grafik zu plotten, berechneten wir die Geschwindigkeit einzelner Würmer und aufgetragen Ergebnisse in einem Box-Plot mit Minitab Statistical Software ( http://www.minitab.com ). Neben Geschwindigkeit, andere Parameter der Bewegung, wie Drehen Reaktion (Zeit, um die Auflösung in Reaktion auf ein elektrisches Feld Polaritätswechsel vervollständigen) und Körper Biegen Frequenz (durchschnittliche Anzahl von Sinuswellen pro Sekunde), können ebenfalls analysiert, wie an anderer Stelle beschrieben werden, 5.
Die electrotaxis Protokoll arbeitet am besten mit einem synchronisierten Bevölkerung, die durch Behandlung mit einer Bleichlösung (Natriumhypochlorit und 4 N Natriumhydroxid in 2:3 Volumenverhältnis) 10 erhalten werden kann. Alle hier präsentierten Daten wurde aus synchronisierten Populationen auszuschließen alters-und Phase-Variation. Zwar haben wir junge Erwachsene (69 h post-L1 an verwendet200C), können auch andere Stufen (L2 ff.) auch getestet werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der mikrofluidischen Screening-Plattform für Nematoden electrotaxis Assay. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Master-Form (A) und komplett montiert PDMS Mikrokanalvorrichtung (B).
Abbildung 3. Position gegen die Zeit (A) und momentane Geschwindigkeit (B) Ausgaben benutzerdefinierter Wurm Tracking-Programm. Source Video Ergänzende Video 1 unten. Das Programm berechnet die Velocity-Kurve von der Position-Zeit-Kurve, sondern missachtet die Spikes bei der Berechnung der durchschnittlichen Geschwindigkeit.
Abbildung 4. Electrotaxis Geschwindigkeit der Wildtyp-Kontrolle N2 und transgene NL5901 Würmer. NL5901 Würmer sind deutlich langsamer als Kontrolle mit p> 0,0001. Die Signifikanz wird unter Verwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney Test. n = 10 für N2 und n = 23 für NL5901.
Ergänzende Video 1. Electrotactic Verhalten der jungen Erwachsenen Nematoden in einem mikrofluidischen Kanal. Video beginnt mit Kathode nach rechts. Aussehen der Glaspipette zeigt bevorstehende Umpolung; anschließende Entfernung der Pipette Signale Moment der Umkehr. Klicken Sie hier zur AnsichtFilm.
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Discussion
Unter Ausnutzung der Verhaltens-Phänomen erstmals von Gabel und Kollegen und Gebäude auf dem dielektrophoretischen Manipulation Arbeit von Chuang und Kollegen 11,12 beschrieben, stellt unsere Mikrofluidik-basierten electrotaxis Assay eine einfache, robuste und sensitive Methode, um neuronale Aktivität in Worms mit Bewegung als Sonde einen Ausgang. Die Analyse der Parameter der Bewegung ermöglicht quantitative Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen. Die Präzision der Fertigung und Mikrokanalstruktur elektrischen Feldes zusammen sowohl eine kontrollierbaren Umfeld und ein Mittel, um mit dem Wurm für Fortbewegungssteuersystem kommunizieren. Verschiedene elektrische Signal Wellenformen haben unterschiedliche Verhaltens-Reflexionen in der Schnecke und wurden verwendet, um sowohl stimulieren und hemmen Fortbewegung.
Der einkanalige Konstruktion der vorliegenden Mikrofluidik-Vorrichtung erfordert, dass nur eine einzige Schnecke zu einem Zeitpunkt erzielt. Dafür muss Wurm Lösung ausreichend mit M9 verdünnt werdenpuffern, bevor Sie Würmer in den Kanal zu laden. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass Channel-Operationen durch die Anwesenheit von Luftblasen und andere Unregelmäßigkeiten im hydrostatischen Druck kann kompliziert sein. Dies könnte durch Spülen des Kanals mit M9 und Manipulieren der Höhe der Einlaß-und Auslassrohre beseitigt werden.
Der Test hier beschriebenen kann weiter verbessert werden. Ein Mehrkanal-Mikrofluidik-Chip beschleunigen könnte Wurm Screening, obwohl es die Integration anderer Kontrollmechanismen wie Wurm Belastung, Positionierung und Tracking benötigen. Weitere Automatisierung der electrotaxis Protokoll, vor allem Computer-gesteuerten Flow-Management, wird die Effizienz zu steigern. Diese Erweiterungen sind derzeit in der Entwicklung in unserem Labor.
Extraktion von Daten aus Fortbewegung electrotaxis Videos wurde ursprünglich manuell mit ImageJ, die ein langsamer und langwieriger Prozess ist, durchgeführt. Um die Effizienz zu erhöhen und zu beseitigen human Fehler, haben wir begonnen, einen Wurm Tracking-Programm von einer ursprünglichen MATLAB-basiertes Paket am California Institute of Technology entwickelte 13 angepasst zu verwenden. Die Software verarbeitet derzeit einzigen Wurm-Videos. Die neueste Version ist geeignet für eine Vielzahl von Tests, einschließlich chemisch behandelten Würmer und neuronalen und Muskel-Mutanten. Eines seiner Einschränkungen ist, dass spontane Umkehrungen in bestimmten neuronalen Mutanten (zB OSM-5) 5 beobachtet, sind nicht korrekt interpretiert. Solche Würmer manuell analysiert werden.
Einschränkungen ungeachtet kann mikrofluidischen electrotaxis in unzähligen Zusammenhängen, einschließlich Wirkstoffforschung Assays mit Wurm Modelle der Bewegung-Erkrankungen angewandt werden. In Anbetracht seiner Eignung für Parallelisierung wird electrotaxis besonders gut für das Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen geeignet. Genetische und altersabhängigen Analyse electrotactic Verhalten und neuronale Degeneration kann auch mit diesem untersucht werdenSystem. Zusätzlich können Würmer nach Alter oder Phänotyp synchronisiert Proben bilden oder neue Mutanten für Vorwärts genetischen Bildschirme 6,14 identifizieren sortiert werden.
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Disclosures
Die mikrofluidischen electrotaxis Assay-Technologie ist zum Patent wurde in den Vereinigten Staaten von Amerika und Kanada eingereicht.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Research Chairs Programm, Canadian Institutes of Health Research und Ontario Ministerium für Forschung und Innovation durch ihre frühe Forscher Award Programm für die finanzielle Unterstützung bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92x16mm Petri Dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hotplate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
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