Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis Published: May 2, 2013 doi: 10.3791/50226
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biology, McMaster University, 2Department of Mechanical Engineering, McMaster University

Summary

Içinde isteğe bağlı hareket ikna etmek için bir yarı-otomatik mikro-elektro-akışkan yöntemi

Abstract

Nematod Caenorhabditis elegans için hastalıkla ilişkili gen ve yollar yanı sıra yetiştirme kolaylığı onun korunması biyomedikal araştırmalar için çok yönlü bir model organizmadır. Çeşitli C. elegans hastalık modelleri gibi dopaminerjik (DA) nöronlar 1 dejenerasyon içeren Parkinson hastalığı (PD), nörodejeneratif hastalıkların da dahil olmak üzere, bildirilmiştir. Transgenlerin ve nörotoksik kimyasal hem de nörodejenerasyonun ve sinir-koruyucu genler ve bileşikler için ekranlar 2,3 temelinde soruşturma sağlayan, DA ve nörodejenerasyonunun solucanlar buna bağlı olarak hareket kusurlar ikna etmek için kullanılmıştır.

C gibi düşük ökaryotlarda Ekranlar elegans nöronal sinyal etkileyen bileşikler ve genleri tanımlamak için verimli ve ekonomik bir yol sağlar. Geleneksel ekranlar genellikle elle yapılan ve görsel kontrol atacak, dolayısıyla, zaman-eksileriniuming ve insan hataları eğilimli. Ayrıca, hücresel seviyede analiz en odak hareket ihmal ederek, bu hareket bozuklukları için özellikle önemli bir parametredir.

Biz C. kontrol ve rakamlarla yeni bir mikroakışkan tarama sistemi (Şekil 1) geliştirdik elegans 'hareket mikro içinde elektrik alan uyaranlara kullanarak. Bir Doğru Akım (DC) alanında sağlam katot doğru hareket ("electrotaxis") 4-talep neden olduğunu göstermiştir. Alanın kutup değiştirme solucan hızlı bir şekilde de yönünü tersine çevirmek için neden olur. Ayrıca dopaminerjik ve diğer duyusal nöronlarda kusurları yüzme yanıt 5 değiştirebilir göstermiştir. Bu nedenle, nöronal sinyal anormallikleri bir okuma-out olarak hareket kullanılarak belirlenebilir. Hareket cevap doğru hız, vücut bükme frekans ve ters zaman yüzme gibi parametreleri bir dizi kullanarak ölçülebilir.

4 ile karşılaştırıldığında daha hızlı hareket. Bu bulgular bize pasif yaş ve fenotip 6 ile solucanlar sıralamak için yeni bir mikroakışkan cihaz tasarımı yol açtı.

Ayrıca darbeli DC solucanlar tepki test edilmiş ve Akım (AC) elektrik alanları Alternatif var. C. hem de çeşitli İş döngülerinin Pulsed DC alanlarında etkili oluşturulan electrotaxis elegans ve kuzeni C 7 briggsae. Başka bir deneyde, 1 Hz ila 3 kHz arasında frekanslarda simetrik AC alanları kanal 8 içine solucanlar immobilize.

Microfluidic ortamda elektrik alan uygulanması electrotaxis testin hızlı ve otomatik yürütme sağlar. Bu yaklaşım faktörler için yüksek verimli genetik ve kimyasal ekranlar kolaylaştırmak için vaat ediyornöronal fonksiyonu ve canlılığı etkileyen.

Protocol

1. Usta Kalıp İmalat için Fotolitografi

  1. 30 saniye sonra 30 saniye ve metanol için aseton içinde silikon in 3 batırın. 5 dakika boyunca dH 2 0 su ile durulayın.
  2. Bir N2 darbe silahla gofret yüzeyini kurulayın. 2 dakika süreyle 140 ° C sıcak bir plaka üzerinde gofret ısıtın.
  3. Plazma silikon (1 dk, 50 B) yüzeyi okside eder.
  4. 3 ml SU-8 100 fotorezist (; 1.750 rpm 40 saniye) ile Spin-kat gofret yüzeyi.
  5. 65 sıcak bir plaka üzerinde önceden fırında kaplı gofret ° C 10 dakika, daha sonra 95 ° C üzerinde 2 dakika sıcaklık rampa. Ek olarak 1 saat boyunca bu ayar koruyun.
  6. İstenen kanal tasarımı içeren bir photomask hizalayın. 550-600 UV ışık mJ / cm 2 (350-400 nm) için karşı Açığa. PHOTOMASKS AutoCAD tasarlanmış ve yüksek çözünürlüklü baskı ile bir şeffaflık üzerine basılabilir.
  7. T rampa, 10 dakika için 1 dakika ve 95 ° C 65 ° C sıcak bir plaka üzerinde gofret Post-fırındadaha önce olduğu gibi o sıcaklığı.
  8. 10-15 dakika SU-8 geliştirici çözüm gofret bırakın. Izopropanol ile durulayarak geliştirme tamamlanması için kontrol edin. Beyaz bir çökelti görünürse, geliştirmeye devam. Ana kalıp Şekil 2A'da gösterilmiştir.

2. Mikrokanal İmalat için yumuşak Litografi

  1. 3.5 ml PDMS sertleştirici ile 35 ml polidimetilsiloksan (PDMS) elastomer temel karıştırın.
  2. Alüminyum folyo ile kaplı Petri kapları içine fabrikasyon ana kalıp (kalıp yukarı bakacak şekilde) ve boş bir silikon yonga yerleştirin.
  3. İkinci çanak içine ana kalıp çanak ve 15 ml içine 20 ml PDMS prepolimer dökün. Hafifçe bir tek tahta aplikatör ile onlara basarak gofret altında hava cepleri ortadan kaldırın.
  4. Hem yemekler Kapak ve tedavi için bir gün için kenara koyun. Alternatif 2 için, daha hızlı kür için, bir vakum degazör kullanarak PDMS içindeki hava kabarcıklarını çıkarın ve daha sonra 80 sıcak bir plaka üzerinde yemekleri bırakın ° Csa.
  5. Gofret folyo ve PDMS soyma çıkarın.
  6. Kanalın her iki ucunda akışkan erişim noktaları yumruk Harris Uni-Çekirdek (2,5 mm) kullanın. Benzer büyüklükteki şeritler halinde kanal ve boş PDMS kesin.
  7. Bir plazma oksitleyici içine kanalı, boş PDMS şerit ve bir cam slayt (75 × 25 mm 2) Yük, muhtemelen bir temiz oda bulunmaktadır. 40 W gücünde 40 saniye oksijen plazma maruz.
  8. Boş şeridin zıt kenarlarına kanal parçası ve cam slayt sopa. Bağ tamamlamak için 2 saat için kenara koyun.
  9. 120 sıcak bir plaka üzerine montaj yerleştirin ° C PDMS prepolimer kullanarak delikli rezervuarlar için, her uzun inç en az 6, (iç çapı 1/32 ", dış çapı 3/32") plastik boru takın. Bir veya iki tüplere yapıştırmayın bir akışkan plastik konektör şırınga eki izin veya ticari bağlantı parçaları kullanmak.
  10. PDMS tedavi için tüp güvence izin ver. EAC içine 22 ayar yalıtılmış bakır tel 3 "uzunlukları takıngiriş borusu ve kanal ve PDMS prepolimer ile güvenli arasında saat rezervuar,. Bitmiş ürün, Şekil 2B'de gösterilmiştir.

3. Electrotaxis Deney

  1. Bir monitör (Şekil 1) bağlı bir monte kamera ile mikroskop aşamasında (tercihen XY-hareketli) üzerine Mikrokanallı yerleştirin.
  2. En Mikrokanallı elektrotlar için güç kaynağı veya amplifikatörün çıkış kablolarını bağlayın. Yalnızca DC sinyali istendiği takdirde basit bir DC güç kaynağı yeterli olan, ancak bir fonksiyon jeneratörü bağlı bir yükseltici hem darbeli DC ve AC sinyali uygulama sağlar.
  3. Tek kullanımlık enjektöre en Mikrokanallı çıkış tüpü takın. Batmak M9 fizyolojik tampon giriş borusunun ağız ve yavaşça şırınga içinde bir negatif basınç (el ile veya bir şırınga pompası kullanılarak) uygulayarak kanal içine sıvı talip. Giriş ve çıkış boruları M9 ile doldurulur de, şırınga F ayırınrom tüpü. Hidrostatik tahrik akışını önlemek için aynı yüksekliğe hem tüpler Seviye.
  4. Kanala bir DC gerilim uygulayın ve (R = V / I) (uzun bir 50 mm 0.3 mm genişliğinde ve ~ 0.1 mm derinliğinde Mikrokanallı) MQ 0.6 civarında olduğu direnci sağlamak.
  5. Kanal bütünlüğünü memnun ise, kanal içine seyreltilmiş süspansiyon solucanlar yüklemek için yukarıdaki adımları izleyin.
  6. Şırınga çıkarın ve hidrostatik tüpler 'göreceli yüksekliğini ayarlayarak akışını manipüle. Kanalın merkezinde bir solucan yerleştirin ve daha sonra aynı yükseklikte iki tüp düz koymak için bu yöntemi kullanın.
  7. L3 sahne hayvanlar için 4-12 V / cm, L4S için 4-10 V / cm, ve 2-4 V / genç yetişkinler için cm: uygun voltaja güç kaynağı ayarlayın. Elektrik sinyali etkinleştirin ve alana iklime alıştırmak için solucan için önceden maruz kalma 1 dakika izin verir. Solucan katot doğru hareket başlamalıdır. Dakika geçtikten sonra, kayıt başlamak için fotoğraf makinesi kullanın.
  8. AC ve darbe için7, 8, istenildiği gibi D DC deneylerde, en fazla duyarlı elektrik alan, sinyalin yukarıda ve frekans ve görev döngüsü kabul edilebilir modüle edilebilir.
  9. Deney bittiğinde, kanal tüm sıvı (ve solucanlar) çıkarın, dH 2 0 ile durulayın ve ° C kuru 125 sıcak bir plaka cihazı bırakın.
  10. Elle NIH ImageJ (kullanarak kaydedilen videoları ettirici veri ayıklamak http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) veya özel MATLAB tabanlı solucan izleme yazılımı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Solucan izleme yazılımı, vahşi tip en genç yetişkin nematod electrotaxis ve pozisyon ve hız çıkış temsili bir video Yardımcı video 1 ve Şekil 3 'de gösterilmiştir. Hareket analiz yazılımı kendi alanında kutup yönünü ve kutup değiştirme sırasında tanımıyor, bunun yerine, bu bilgileri kaynak video alınmalıdır. Bu video bir ses veya görsel işaret kullanarak ya da deneysel koşullar ve manipülasyon yazmak yapılabilir.

Yabani tip (N2) ve transjenik hayvanların (NL5901) arasında bir dizi Electrotaxis hızlı veri Şekil 4 'de gösterildi. NL5901 hayvanlar unc-54 (miyozin ağır zincir geni) promotörün kontrolü altında insan α-sinüklein geni taşır. Vücutta α-sinüklein ifade duvarı kasları agrega 9 ve sonuçları bu elektrik anormallikleri neden olduğunu göstermektedirtrotactic yanıt. NL5901 solucanlar hızı vahşi tip çok daha yavaştır. Grafik çizmek için, bireysel solucanlar hızını hesaplanır ve Minitab istatistiksel yazılım (kullanarak bir kutu arsa sonuçları çizilen http://www.minitab.com ). Başka bir yerde tarif edildiği gibi ek olarak hız, örneğin torna yanıt (elektrik alanı kutup değiştirme tepki olarak ters tamamlamak için geçen süre) ve vücut bükme frekans (saniyede sinüs dalgası ortalama sayısı) hareketinin diğer parametreler de analiz edilebilir 5.

Electrotaxis protokolü bir ağartma çözeltisi (2:3 lük hacim oranında sodyum hipoklorit ve 4 N sodyum hidroksit) 10 ile işleme tabi tutarak elde edilebilir senkronize bir nüfusu ile iyi çalışır. Burada sunulan tüm veriler yaş ve sahne bağımlı değişimi ekarte etmek için senkronize nüfus elde edilmiştir. Biz genç yetişkinler (69 saat sonrası-L1 kullanmış olsa da200C), diğer aşamaları (L2 itibaren) da test edilebilir.

Şekil 1,
Şekil 1. Nematod electrotaxis tahlil için mikroakışkan tarama platformu şematik. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Ana kalıp (A) ve tam olarak monte PDMS Mikrokanallı cihazı (B).

Şekil 3,
Şekil 3,. Konumu vs zaman (A) ve anlık hız (B) özel solucan izleme programının çıkışı. Ekşice Video aşağıda Ek video 1'dir. Program konumunu-zaman eğrisi gelen hız eğrisi hesaplar ama ortalama hızı hesaplanırken ani göz ardı.

Şekil 4,
Şekil 4. Yabani tip kontrolü N2 ve transgenik NL5901 solucanlar Electrotaxis hızı. NL5901 solucanlar p> 0.0001 ile kontrolü çok daha yavaştır. Önemi parametrik olmayan Mann-Whitney testi ile belirlenir. N NL5901 N2 ve n = 23 = 10.

Ek Video 1. Mikroakışkan bir kanalda genç yetişkin nematod Electrotactic davranış. Video sağa katot ile başlar. Cam pipet Görünüm yaklaşan kutup ters gösterir; ters pipet sinyalleri an sonradan giderilmesi. görmek için buraya tıklayınfilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İlk Chuang ve arkadaşları 11,12 dielectrophoretic manipülasyon çalışmaları Gabel ve arkadaşları ve bina tarafından tanımlanan davranış fenomen yararlanarak, bizim mikroakışkan tabanlı electrotaxis tahlil hareket olarak kullanarak solucanlar nöronal aktivite soruşturma için, kolay sağlam ve duyarlı bir yöntem sağlar bir çıkış. Hareket parametrelerin analizi farklı genotipleri arasında kantitatif karşılaştırılması sağlar. Birlikte Mikrokanallı imalat ve elektrik alan uygulama hassas bir kontrol ortam ve hareket kontrolü için solucan ile iletişim kurmak için bir araç hem de sağlar. Farklı elektrik sinyali dalga şekilleri solucan farklı davranışsal yansımaları var ve hem de teşvik ve hareket engellemek için kullanılmaktadır.

Mevcut mikroakışkan cihazın tek kanallı tasarımı sadece tek bir solucan bir anda atılır gerektirir. Bunun için, solucan çözüm yeterince M9 ile seyreltilmelidirkanala solucanlar yüklemeye çalışmadan önce tampon. Bu kanal işlemleri hava kabarcıkları ve hidrostatik basınç etkileyen diğer düzensizlikler varlığı ile karmaşık olabilir işaret etmek önemlidir. Bu M9 ile kanal yıkama ve giriş ve çıkış tüplerin yükseklik manipüle ederek elimine edilebilir.

Burada açıklanan tahlil daha da geliştirilebilir. Bu tür solucan yükleme, konumlandırma ve izleme gibi diğer kontrol mekanizmalarının entegrasyonu gerektirir rağmen bir çok kanallı mikroakışkan çip, solucan tarama hızlandırabilir. Electrotaxis protokol daha fazla otomasyon, özellikle bilgisayar kontrollü akış yönetimi, verimlilik artacaktır. Bu geliştirmeler Laboratuvarımızda geliştirme aşamasındadır.

Electrotaxis videoları hareket veri çıkarımı aslında yavaş ve sıkıcı bir süreçtir ImageJ kullanılarak elle yapıldı. Verimliliği artırmak ve s ortadan kaldırmak içinUman hata, biz Teknoloji 13 California Institute of geliştirilen özgün bir MATLAB tabanlı paketinden uyarlanmış bir solucan izleme programı kullanmaya başladı. Yazılım şu anda tek solucan videoları işler. En son sürümünü kimyasal işlem görmüş solucan ve nöronal ve mutantlar da dahil olmak üzere kas deneyleri geniş bir aralığı için uygundur. Sınırlamaları biri belirli nöronal mutantlar (örneğin, osm-5) 5 gözlenen spontan ters, doğru yorumlanmaz olmasıdır. Bu solucanlar manuel analiz edilmelidir.

Sınırlamalar rağmen, mikroakışkan electrotaxis hareketi ile ilgili hastalıkların solucan modelleri ile ilaç keşfi deneyleri de dahil olmak üzere sayısız bağlamlarda uygulanabilir. Parallelization olan amenability göz önüne alındığında, electrotaxis özellikle yüksek verimli tarama uygulamaları için uygundur. Electrotactic davranış ve nöronal dejenerasyonu genetik ve yaşa bağlı analizi de bu konuda incelenebilirsistemi. Ayrıca, solucan yaş veya senkronize numune oluşturmak için veya ileri genetik ekranlar 6,14 için yeni mutantlar tanımlamak için fenotip göre sınıflandırılmaktadır olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Mikroakışkan electrotaxis testi teknoloji Amerika ve Kanada ABD'de patent için dava açılmıştır.

Acknowledgments

Yazarlar mali destek için kendi Erken Araştırmacılar Ödülü Programı aracılığıyla Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Kurumu, Kanada Araştırma Sandalyeler Programı, Sağlık Araştırma Kanada Enstitüleri ve Araştırma ve Yenilik Bakanlığı Ankara teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone CALEDON Labs 1200-1-30
Methanol CALEDON Labs 6700-1-30
Isopropanol CALEDON Labs 8600-1-40
SU-8 Microchem Corp. Y131273 SU-8 100
SU-8 Developer Microchem Corp. Y020100
92x16mm Petri Dish Sarstedt 82.1473.001
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Contains elastomer base and curing agent
Function generator Tektronix Inc. Model AFG3022B
Amplifier Trek Inc. Model 2210-CE
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4506 Model 11 ELITE
Hotplate Fisher Scientific 11675916Q Model HP131725Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
  2. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
  3. Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
  4. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
  5. Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
  6. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
  7. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
  8. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
  9. van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
  12. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
  13. Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
  14. Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).

Tags

Biyomühendislik Sayı 75 Davranış Moleküler Biyoloji Hücre Biyolojisi Nörobilim Nörobiyoloji Biyofizik Makine Mühendisliği Mikroakiskan, C. elegans Nörotoksisite Sendromlar İlaç Toksisitesi Nörotoksisite Sendromlar Biyolojik Ajanlar Yüksek Verimli Tarama Tahliller Toksisite Testleri Locomotion Sinir Sistemi Hastalıkları electrotaxis hareket yüzme hareket nörodejenerasyon nöronal sinyal dopamin nöronlar Hayvan modeli
On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tong, J., Rezai, P., Salam, S.,… More

Tong, J., Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion. J. Vis. Exp. (75), e50226, doi:10.3791/50226 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter