Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب Published: May 2, 2013 doi: 10.3791/50226

Summary

وهناك طريقة الصغرى الكهربائية فلويديك شبه الآلي للحث تنقل على الطلب في

Abstract

في انواع معينة ايليجانس الخيطية هو النموذج الحي تنوعا للبحوث الطبية الحيوية بسبب صيانته من الجينات ذات الصلة بالمرض والممرات وكذلك سهولة زراعة. عدة C. وقد تم الإبلاغ عن نماذج مرض ايليجانس، بما في ذلك الاضطرابات العصبية مثل مرض باركنسون (PD)، والذي ينطوي على انحطاط الدوبامين (DA) الخلايا العصبية 1. وقد استخدمت كل من الجينات المحورة والمواد الكيميائية أعصاب للحث DA تنكس عصبي وعيوب حركة يترتب على ذلك في الديدان، والسماح لتحقيقات في أساس تنكس عصبي وشاشات للجينات الأعصاب ومركبات 2،3.

شاشات في أقل حقيقيات النوى مثل C. توفير ايليجانس وسيلة فعالة واقتصادية لتحديد المركبات والجينات التي تؤثر على إشارات العصبية. وعادة ما يتم تنفيذ الشاشات التقليدية يدويا وسجل عن طريق التفتيش البصري، وبالتالي، فهي المرة الجدد uming وعرضة للأخطاء البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم التركيز على تحليل المستوى الخلوي في حين تجاهل الحركة والتي هي معلمة أهمية خاصة بالنسبة للاضطرابات الحركة.

لقد قمنا بتطوير نظام الفرز ميكروفلويديك رواية (الشكل 1) الذي يتحكم والكمي C. تنقل ايليجانس 'باستخدام المحفزات الحقل الكهربائي داخل microchannels. لقد أظهرنا أن تيارا الميداني المباشر (DC) يمكن أن تحفز بقوة على الطلب تحرك نحو القطب السالب ("انجذاب كهربي") 4. عكس قطبية الحقل يسبب الدودة لعكس اتجاهه بسرعة كذلك. لقد أظهرنا أيضا أن العيوب في الخلايا العصبية الحسية الدوبامين وغيرها من تغيير استجابة سباحة 5. ولذلك، شذوذ في إشارة العصبية يمكن تحديدها باستخدام تنقل باعتبارها مقروءة إجراءات المغادرة. استجابة حركة يمكن أن يكون كميا بدقة باستخدام مجموعة من المعلمات مثل سرعة السباحة، هيئة تردد الانحناء والوقت الانعكاس.

ق = "jove_content"> كشفت عملنا أن الاستجابة electrotactic يختلف مع تقدم العمر. على وجه التحديد، والاستجابة الشباب إلى مجموعة أقل من الحقول الكهربائية والتحرك على نحو أسرع مقارنة اليرقات 4. أدت هذه النتائج لنا لتصميم جهاز ميكروفلويديك جديدة لفرز بسلبية الديدان حسب العمر والنمط الظاهري 6.

لقد اختبرنا أيضا استجابة من الديدان إلى العاصمة نابض والمتناوب (AC) الحقول الكهربائية الحالية. الحقول DC نابض من دورات العمل المختلفة بشكل فعال انجذاب كهربي ولدت في كلا C. ايليجانس ولها ابن عم C. briggsae 7. في تجربة أخرى، متناظرة حقول AC مع ترددات تتراوح ما بين 1 إلى 3 كيلوهرتز هرتز يجمد الديدان داخل القناة 8.

تنفيذ الحقل الكهربائي في بيئة ميكروفلويديك تمكن التنفيذ السريع والآلي للمقايسة انجذاب كهربي. وعود هذا النهج لتسهيل شاشات الوراثية والكيميائية عالية الإنتاجية لعواملالتي تؤثر على وظيفة الخلايا العصبية وقدرتها على البقاء.

Protocol

1. ضوئيه للماجستير تصنيع القالب

  1. يستحم لمدة 3 بوصة رقاقة السيليكون في الأسيتون لمدة 30 ثانية ثم الميثانول لمدة 30 ثانية. شطف مع DH 2 0 الماء لمدة 5 دقائق.
  2. يجف سطح الرقاقة في التعامل مع البندقية ضربة N2. تسخين رقاقة على طبق ساخن عند 140 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  3. البلازما أكسدة سطح رقاقة السيليكون (1 دقيقة، 50 W).
  4. تدور معطف سطح الرقاقة مع 3 مل SU-8 100 مقاوم الضوء (40 ثانية؛ 1،750 دورة في الدقيقة).
  5. قبل خبز الرقاقة المغلفة على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم المنحدر درجة حرارة تصل إلى 95 درجة مئوية أكثر من 2 دقيقة. الحفاظ على هذا الإعداد ل1 ساعة إضافية.
  6. محاذاة الضوئية التي تحتوي على تصميم القناة المطلوبة. فضح مقاومة إلى 550-600 ميغا جول / سم 2 من ضوء الأشعة فوق البنفسجية (350-400 نانومتر). ويمكن تصميم Photomasks في أوتوكاد وطباعتها على الشفافية مع طباعة عالية القرار.
  7. بعد خبز الرقاقة على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، التعلية رانه درجة الحرارة كما كان من قبل.
  8. تزج الرقاقة في SU-8 حل المطور لمدة 10-15 دقيقة. تحقق لاستكمال التطوير من قبل الشطف مع الأيزوبروبانول. إذا ظهر راسب أبيض، مواصلة تطوير. يظهر القالب الرئيسي في الشكل 2A.

2. الطباعة الحجرية الناعمة لتصنيع متناهية

  1. خلط 35 مل polydimethylsiloxane (PDMS) قاعدة المطاط الصناعي مع 3.5 مل PDMS كيل علاج.
  2. وضع القالب الرئيسي ملفقة (خطة مواجهة) ورقاقة السيليكون فارغ في أطباق بتري واصطف مع رقائق الألومنيوم.
  3. صب 20 مل PDMS سابق البلمرة في القالب طبق رئيسي و 15 مل في طبق الثاني. القضاء على جيوب الهواء تحت رقائق طريق الضغط بلطف عليهم مع قضيب خشبي القابل للتصرف.
  4. تشمل كلا من أطباق ويوضع جانبا لمدة يوم لعلاج. بدلا من ذلك، لسرعة المعالجة، وإزالة فقاعات الهواء من PDMS باستخدام degasifier فراغ ثم ترك الأطباق على طبق ساخن على 80 درجة مئوية لمدة 2الموارد البشرية.
  5. إزالة احباط وقشر PDMS من رقائق.
  6. استخدام هاريس أحادي النواة (2.5 مم) لكمة منافذ الوصول السائل في كلا طرفي القناة. قطع القناة وPDMS فارغة إلى شرائح ذات الحجم المماثل.
  7. تحميل قناة، الفراغ PDMS قطاع وشريحة زجاجية (75 × 25 مم 2) في مؤكسد البلازما، وتقع على الأرجح في غرف الأبحاث. فضح لالبلازما الأكسجين لمدة 40 ثانية في 40 W السلطة.
  8. الصاق قطعة قناة وشريحة زجاجية إلى طرفي نقيض في قطاع فارغة. يوضع جانبا لمدة 2 ساعة لاستكمال الربط.
  9. وضع الجمعية على طبق ساخن عند 120 درجة مئوية. إرفاق أنابيب بلاستيكية (القطر الداخلي 1/32 "، وقطره الخارجي 3/32")، كل لا يقل عن 6 بوصة طويلة، إلى خزانات لكمات باستخدام PDMS سابق البلمرة. يضعوا موصل البلاستيك فلويديك على أحد أو كلا أنابيب للسماح المرفقات حقنة، أو استخدام التجهيزات المتاحة تجاريا.
  10. السماح للPDMS تأمين أنابيب لعلاج. إدراج 3 "أطوال من 22 مقياس معزول الأسلاك النحاسية في مجموعة شرق افريقياح الخزان، بين أنبوب مدخل والقناة، وآمنة مع PDMS سابق البلمرة. يظهر المنتج النهائي في الشكل 2B.

3. انجذاب كهربي التجربة

  1. وضع متناهية على المسرح (ويفضل XY-المنقولة) من المجهر مع كاميرا محمولة متصلة إلى جهاز (الشكل 1).
  2. توصيل التيار الكهربائي أو الأسلاك الناتج مكبر للصوت لأقطاب متناهية ل. A بسيط العاصمة امدادات الطاقة غير كافية إذا كان المطلوب فقط إشارة DC، لكن مكبر للصوت متصلا وظيفة مولد يسمح تطبيق نابض العاصمة وإشارات AC كذلك.
  3. إرفاق متناهية في أنبوب الإخراج إلى الحقنة. يغرق مصب أنبوب مدخل في M9 العازلة الفسيولوجية وبلطف يطمح السائل في القناة عن طريق تطبيق الضغط السلبي داخل الحقنة (إما يدويا أو باستخدام مضخة محقنة). عندما يتم ملأ كل مدخل ومخرج أنابيب مع M9، افصل جمعة حقنةROM الأنبوب. المستويين أنابيب إلى نفس الارتفاع لمنع تدفق مدفوعة hydrostatically.
  4. تطبيق الجهد DC إلى القناة والتأكد من أن المقاومة (R = V / I) هو حوالي 0.6 MΩ (ل50 مم طويل، 0.3 ملم واسعة و~ 0.1 ملم متناهية العميقة).
  5. إذا كنت راضيا عن سلامة القناة، اتبع الخطوات المذكورة أعلاه لتحميل الديدان من تعليق المخفف في القناة.
  6. قطع المحقنة وhydrostatically التلاعب في تدفق من خلال تعديل ارتفاع نسبي الأنابيب '. استخدام هذا الأسلوب لوضع دودة في وسط القناة ثم وضع كل من أنابيب شقة في نفس الارتفاع.
  7. تعيين التيار الكهربائي إلى الجهد المناسب: 4-12 V / سم لL3 الحيوانات المرحلة، 4-10 V / سم لL4s، و2-4 V / سم للصغار البالغين. تفعيل إشارة كهربائية والسماح 1 دقيقة من قبل التعرض لدودة للتأقلم إلى الميدان. وينبغي أن تبدأ الدودة تتحرك نحو القطب السالب. عندما اجتاز دقيقة، استخدام الكاميرا لبدء التسجيل.
  8. لميلان ونبضد التجارب العاصمة، ويمكن اعتماد أقصى الحقل الكهربائي استجابة من دورة أعلاه وتردد واجب يمكن أن يكون إشارة التضمين كما تريد 7، 8.
  9. عندما يتم الانتهاء من التجربة، وإزالة جميع السائل (والديدان) من القناة، وشطفه مع DH 2 0، وترك الجهاز على طبق ساخن عند 125 درجة مئوية لتجف.
  10. استخراج البيانات الحركي من أشرطة فيديو مسجلة يدويا باستخدام يماغيج المعاهد الوطنية للصحة ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) أو العرف القائم على MATLAB تتبع البرمجيات دودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم عرض شريط فيديو ممثل انجذاب كهربي البرية من نوع الديدان الخيطية الشباب الكبار وموقفها والمخرجات سرعة من برنامج تتبع دودة في التكميلية فيديو (1) والشكل (3). برنامج تحليل الحركة نفسها لا تعترف اتجاه قطبية المجال والوقت من انعكاس القطبية، بل يجب الحصول على هذه المعلومات من مصدر الفيديو. ويمكن القيام بذلك باستخدام جديلة السمعية أو البصرية في الفيديو أو الكتابة أسفل الظروف التجريبية والتلاعب.

يتم عرض البيانات بسرعة انجذاب كهربي من مجموعة من البرية من نوع (N2) والمعدلة وراثيا الحيوانات (NL5901) في الشكل رقم 4. الحيوانات NL5901 تحمل الجينات البشرية α-synuclein تحت سيطرة UNC-54 (ميوسين الثقيلة سلسلة الجينات) المروج. وأعرب α-synuclein في الجسم عضلات جدار المجاميع 9 و نتائجنا تظهر أنه يسبب تشوهات في الكابلات الكهربائية المصريةاستجابة trotactic. سرعة NL5901 الديدان أبطأ بكثير من النوع البري. في رسم بياني، حسبنا سرعة الديدان الفردية وتآمر النتائج في مؤامرة مربع باستخدام برنامج Minitab البرامج الإحصائية ( http://www.minitab.com ). بالإضافة إلى السرعة، وغيرها من المعالم من الحركة، مثل تحول استجابة (الوقت المستغرق لإكمال انعكاس في استجابة لتغير قطبية الكهربائية الميدانية) وهيئة تردد الانحناء (متوسط ​​عدد من موجات جيبية في الثانية الواحدة)، كما يمكن تحليلها كما هو موضح في مكان آخر 5.

بروتوكول انجذاب كهربي يعمل بشكل أفضل مع السكان متزامنة، والتي يمكن الحصول عليها عن طريق العلاج مع محلول التبييض (هيبوكلوريت الصوديوم وهيدروكسيد الصوديوم 4 N في نسبة حجم 2:3) 10. تم الحصول على جميع البيانات المعروضة هنا من السكان متزامنة لاستبعاد السن والمرحلة التي تعتمد على الاختلاف. في حين أننا قد استخدمت صغار البالغين (69 ساعة بعد L1 في200C)، ويمكن أيضا أن تختبر المراحل الأخرى (L2 فصاعدا).

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي من منصة الفرز ميكروفلويديك لالديدان الخيطية مقايسة انجذاب كهربي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. القالب الرئيسي (A) وتجميعها بشكل كامل PDMS الجهاز متناهية (B).

الشكل (3)
الشكل (3). موقف مقابل الوقت (A) والسرعة اللحظية (B) نواتج مخصصة برنامج تتبع دودة. صورفيديو CE هو التكميلية فيديو 1 أدناه. البرنامج بحساب منحنى السرعة من منحنى ظيفة بدوام لكن يتجاهل والتموج عند حساب متوسط ​​السرعة.

الشكل 4
الشكل 4. انجذاب كهربي سرعة N2 التحكم من النوع البري والديدان NL5901 المعدلة وراثيا. NL5901 الديدان هي أبطأ بكثير من التحكم مع P> 0.0001. يتم تحديد أهمية استخدام اختبار مان ويتني غير حدودي. ن = 10 لN2 و n = 23 لNL5901.

تكميلية فيديو 1. السلوك Electrotactic من الشباب الديدان الخيطية الكبار في قناة ميكروفلويديك. يبدأ الفيديو مع القطب السالب إلى اليمين. مظهر من الزجاج ماصة يشير شيكة انعكاس قطبية؛ إزالة لاحقة من إشارات لحظة ماصة للانعكاس. انقر هنا لعرضالفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الاستفادة من هذه الظاهرة السلوكية وصف لأول مرة من قبل غابل والزملاء وبناء على أعمال التلاعب dielectrophoretic من تشوانغ وزملاؤه 11،12، يوفر لنا مقايسة انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك وسيلة سهلة وقوية وحساسة للتحقيق في نشاط الخلايا العصبية في الديدان باستخدام حركة كما يبلغ حجم انتاجها. تحليل حركة المعلمات يسمح مقارنة كمية بين الأنماط الجينية المختلفة. دقة متناهية تلفيق وتطبيق الحقل الكهربائي معا تقديم كل بيئة يمكن السيطرة عليها ووسيلة للتواصل مع دودة للسيطرة على الحركة. مختلفة الأشكال موجة إشارة كهربائية ستكون له انعكاسات سلوكية مختلفة في الدودة واستخدمت لكلا تحفيز وتمنع الحركة.

تصميم على قناة واحدة للجهاز ميكروفلويديك الحالي يتطلب أن يتم يسجل سوى دودة واحدة في وقت واحد. لهذا، حل دودة يجب أن تضعف بما فيه الكفاية مع M9المخزن المؤقت قبل محاولة تحميل الديدان في القناة. ومن المهم أن نشير إلى أن عمليات قناة يمكن أن تكون معقدة بسبب وجود فقاعات الهواء وغيرها من المخالفات التي تؤثر على الضغط الهيدروستاتيكي. يمكن القضاء على هذا من قبل بيغ القناة مع M9 والتلاعب في الارتفاع من مدخل ومخرج الأنابيب.

ويمكن تحسين مقايسة الموصوفة هنا أبعد من ذلك. A ميكروفلويديك رقاقة متعددة القنوات يمكن أن تسرع فحص دودة، على الرغم من أنها سوف تتطلب التكامل بين آليات الرقابة الأخرى مثل تحميل دودة، وتحديد المواقع والتتبع. سوف تزيد من البروتوكول انجذاب كهربي التشغيل الآلي، وخصوصا إدارة تدفق الكمبيوتر التي تسيطر عليها، وزيادة الكفاءة. هذه التحسينات هي حاليا قيد التطوير في المختبر لدينا.

تم إجراء استخراج البيانات تنقل من أشرطة الفيديو انجذاب كهربي في الأصل يدويا باستخدام يماغيج، وهي عملية بطيئة ومملة. لزيادة الكفاءة والقضاء على حأومان خطأ، ونحن قد بدأت في استخدام برنامج تتبع دودة مقتبس من حزمة المستندة إلى MATLAB الأصلي تطويرها في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا 13. يعالج البرنامج حاليا أشرطة الفيديو دودة واحدة. أحدث إصدار هو مناسبة لمجموعة واسعة من المقايسات بما في ذلك الديدان المعالجة كيميائيا والخلايا العصبية والعضلات المسوخ. واحدة من حدوده هو أن الانتكاسات عفوية، لوحظ في بعض المسوخ العصبية (على سبيل المثال، OSM-5) لا يتم تفسيرها بشكل صحيح. ويجب تحليل هذه الديدان يدويا.

على الرغم من القيود، ويمكن تطبيقها انجذاب كهربي ميكروفلويديك في سياقات لا تعد ولا تحصى، بما في ذلك فحوصات اكتشاف المخدرات مع نماذج دودة من الاضطرابات المتصلة حركة. النظر في قابليته لالموازاة، انجذاب كهربي مناسب تماما خاصة بالنسبة للتطبيقات الفرز الفائق الإنتاجية. ويمكن أيضا أن تدرس التحليل الجيني والتي تعتمد على سن السلوك electrotactic وتنكس الخلايا العصبية مع هذانظام. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم فرز الديدان حسب العمر أو النمط الظاهري لتشكيل العينات متزامنة أو لتحديد طفرات جديدة لشاشات الوراثية إلى الأمام 6،14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد قدم ميكروفلويديك انجذاب كهربي تكنولوجيا الفحص لبراءات الاختراع في الولايات المتحدة الأمريكية وكندا.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا، كندا برنامج كراسي البحث والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة، وزارة أونتاريو للبحوث والابتكار من خلال بهم الباحثون المبكر برنامج جائزة للحصول على الدعم المالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone CALEDON Labs 1200-1-30
Methanol CALEDON Labs 6700-1-30
Isopropanol CALEDON Labs 8600-1-40
SU-8 Microchem Corp. Y131273 SU-8 100
SU-8 Developer Microchem Corp. Y020100
92x16mm Petri Dish Sarstedt 82.1473.001
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Contains elastomer base and curing agent
Function generator Tektronix Inc. Model AFG3022B
Amplifier Trek Inc. Model 2210-CE
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4506 Model 11 ELITE
Hotplate Fisher Scientific 11675916Q Model HP131725Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
  2. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
  3. Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
  4. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
  5. Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
  6. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
  7. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
  8. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
  9. van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
  12. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
  13. Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
  14. Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 75، سلوك، علم الأحياء الجزيئي، الخلوي علم الأحياء، علم الأعصاب، علم الأعصاب، الفيزياء الحيوية، الهندسة الميكانيكية، الموائع الدقيقة،
انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; &#39;تنقل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tong, J., Rezai, P., Salam, S.,More

Tong, J., Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion. J. Vis. Exp. (75), e50226, doi:10.3791/50226 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter