Summary
Reconstituting funktionellen Membranproteinen in riesige Liposomen definierter Zusammensetzung ist ein leistungsfähiges Konzept, wenn es mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie kombiniert. Dagegen dürfen herkömmliche Riese Liposomen Produktion unvereinbar mit Proteinstabilität. Wir beschreiben Protokolle zur Herstellung Riese Liposomen aus reinem Lipide oder kleine Liposomen, die Ionenkanäle.
Abstract
Die Rekonstitution von Ionenkanälen in chemisch definierten Lipidmembranen für elektrophysiologische Aufzeichnung wurde eine leistungsfähige Technik zu identifizieren und erkunden Sie die Funktion dieser wichtigen Proteinen. Jedoch begrenzen klassischen Zubereitungen, wie planare Doppelschichten, die Manipulationen und Experimente, die auf dem rekonstituierten Kanal und seine Membran Umgebung ausgeführt werden können. Je mehr Zellen Struktur von Riesenliposomen ermöglicht traditionelle Patch-Clamp-Experimente ohne Steuerung des Lipidumgebung.
Elektroformation ist ein effizientes Mittel zur Erzeugung Riesenliposomen> 10 um im Durchmesser, die auf der Anwendung von Wechselspannung in eine dünne, geordnete Lipid Film, der auf einer Elektrodenoberfläche beruht. Da jedoch die klassische Protokoll fordert der Lipide aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht werden, ist es nicht mit weniger robust Membranproteine wie Ionenkanäle und modifiziert werden muss. Kürzlich protocols wurden entwickelt, um Riesenliposomen von partiell dehydratisierten kleinen Liposomen, die wir Protein-haltigen Liposomen in unserem Labor angepasst haben Elektroform.
Wir stellen Ihnen hier den Hintergrund, Ausrüstung, Techniken und Fallstricke Elektroformation riesiger Liposomen aus kleinen Liposomendispersionen. Wir beginnen mit dem klassischen Protokoll, das erste sollte, bevor die größere Herausforderung Protokolle, die gemeistert werden folgen. Wir zeigen den Prozess der kontrollierten teilweisen Wasserentzug aus kleinen Liposomen mit Dampf-Gleichgewicht mit gesättigten Salzlösungen. Schließlich zeigen wir den Prozess der Elektroformation sich. Wir beschreiben einfache, kostengünstige Geräte, die in-house gemacht werden können, um qualitativ hochwertige Liposomen zu produzieren, und beschreiben Sichtprüfung der Vorbereitung auf jeder Stufe, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
Introduction
Riesen-Liposomen (oft als Riese einschichtigen Vesikeln oder GUVs) wurden in erster Linie verwendet, um die Physik und der physikalischen Chemie von Lipid-Doppelschichten, einschließlich Studien der Doppelschicht Verformung, seitliche Phase Koexistenz ("Rafts"), Membran-Fusion, etc 1-4 studieren. Sie haben einen grob Zell-Struktur: Kugelschale Membran umgibt einen wässrigen Innenraum, die leicht gemacht werden, anders als die umgebenden wässrigen Puffer werden. Sie sind per definitionem ≈ 1-100 &mgr; m im Durchmesser, so dass sie abgebildet mit einer Vielzahl von Lichtmikroskopie Ansätze werden. Sie können gestrafft durch osmotischen Gradienten oder mechanisch angelegte Spannung ist, so daß, während in der Regel weich, deren Eigenschaften für die einfache Handhabung kann manipuliert werden. Insbesondere die Steuerung der "Steifigkeit" der Liposomen macht es einfach, "Liposomen-attached" oder ausgeschnitten Patches für die Elektrophysiologie zu bilden. In der Vergangenheit wurde Ionenkanal Rekonstitution weitgehend planaren Lipid b durchgeführtilayers. Jetzt macht die Fähigkeit, Patches von riesigen Liposomen zu bilden und nutzen die erheblichen Köcher von Werkzeugen für herkömmliche Elektrophysiologie entwickelt (Fluoreszenzmikroskopie Mikropipette Aspiration, schnelle Perfusion und Temperaturregelung, etc.) Riesenliposomen immer attraktiver für die Rekonstitution Studien 5,6.
Riesen-Liposomen wurden von vielen Strategien vorgenommen. In der Tat bilden Riesenliposomen spontan durch eine Schwellung Prozess, wenn eine getrocknete Lipid-Film 4,7,8 rehydriert wird. Der Wunsch, schneller vorzubereiten größeren führte gleichmäßigere Liposomen Forscher zu anderen Ansätzen, Leiter unter ihnen Elektroformation 1,9. Elektroformation stützt sich auch bei der Hydratisierung eines getrockneten Lipidfilm, sondern beschleunigt das Verfahren durch die Anwendung eines oszillierenden elektrischen Feldes an die Lipid-Film. Das Feld wird durch zwei Elektroden, entweder Platindrähte oder Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glasträger aufgebracht, getrennt durch Wasser oderPuffer und auf die die Lipide werden abgeschieden. Durch die Beschleunigung der Schwellung von Liposomen erreicht man eine höhere Ausbeute an größeren Liposomen. So hat Elektroformation werden die Standardmethode zur Erzeugung Riesenliposomen 4.
Der Mechanismus der Elektroformation ist nicht vollständig geklärt, und die meisten Protokolle werden empirisch (zB 10,11) entwickelt. Dennoch können wir lernen, ein wenig über das, was unter Berücksichtigung der Theorie und einige empirische Ergebnisse zu erwarten. Es wird allgemein angenommen, dass Elektroformation indem elektro-osmotischen Fluss des Puffers zwischen einzelnen Lipid-Doppelschichten in der abgeschiedenen Lipidfilm 10,11 gestapelt auftritt. Elektrostatische Kupplung Wärmewechselbeständigkeit der Lipid-Doppelschichten ist wahrscheinlich auch beteiligt 12. Diese Hypothesen qualitativ vorherzusagen Obergrenzen für das elektrische Feld der Häufigkeit und Stärke, die 10,12 verwendet werden kann. Insbesondere ist es, dass eine hohe Leitfähigkeit Lösungen vorhergesagt (
Allerdings sind Membranproteine wahrscheinlich mit dem üblichen Verfahren zum Abscheiden Lipide auf Elektroden für die Electroswelling Verfahren, nämlich in organischen Lösungsmitteln, die anschließend an einen dünnen Lipidfilm zu hinterlassen eingedampft unvereinbar. Es gibt zwei grundsätzliche Wege um diese Schwierigkeit: an Proteine nach giant Liposombildung enthalten oder anzupassen, wie die Lipide abgeschieden werden. Unser Ansatz baut auf andere 5,11 die Lipide und Rekonstitution hinterlegentuierten Membranprotein zusammen aus einer Suspension von kleinen oder großen "Proteoliposomen". Wir beschreiben die langwierige und schwieriger Prozess der Herstellung von Proteoliposomen gereinigtes Protein und Lipiden an anderer Stelle (Collins und Gordon, in review). Hier beschreiben wir das Protokoll in Ermangelung einer Protein, aber es ist das gleiche, wenn Protein eingebaut wird, wir zählen die Ergebnisse zeigen, dass Proteoliposomen mit dem Ionenkanal TRPV1 in GUVs umgewandelt werden kann und für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie. In jedem Elektroformation Ansatz, ist die visuelle Inspektion der Lipid-Probe während der Lipidablagerung Prozess entscheidend für den Erfolg.
Unser Ansatz relevant sein können über die spezielle Anwendung zu Ionenkanal Rekonstitution. In der Zeit, da wir zuerst dieses Protokoll entwickelt und jetzt, es hat sich auch gezeigt, wie die Art und Weise, in der Lipide auf Elektroden für Elektroformation abgelagert werden die kompositorische Heterogenität der resultierenden GUVs betrifft. Baykal-Caglar et al. zeigten, dass 14 GUVs aus sorgfältig entwässert gebildeten Liposomen eine 2,5 mal kleiner Variation hatte in der Mischungslücke Sprungtemperatur von GUVs aus Mischungen verschiedener Phospholipide und Cholesterin gebildet. Die Arbeit zeigt, dass Lipide und insbesondere Cholesterin, ausfallen kann aus dem Lipidgemisch wenn aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht, was zu großen räumlichen Abweichung in der Zusammensetzung der abgeschiedenen Lipidfilm. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung der Lipid-Membran Phasenverhalten, kann aber auch kritisch für quantitative Experimente Ionenkanalfunktion. Baykal-Caglar et al. 'S Protokoll ist ähnlich, aber nicht identisch mit unserer eigenen, und die Leser werden ermutigt, es so gut zu studieren.
Dieses Protokoll (siehe Übersicht, Abbildung 1) ist eine von vielen, die genutzt werden könnten. Im Prinzip Elektroformation Erfolg hängt von der Lipid-Mischung, Flüssigkeitszufuhr, Temperatur, andere gelöste Stoffe (vor allem Ionen), und derNatürlich ist die Spannung und Frequenz in Bildung eingesetzt. Wie Elektroformation wird besser verstanden, erwarten wir unser Protokoll mehr zu suchen.
Schließlich gibt es oft eine steile Lernkurve in Galvanotechnik Riese Liposomen. Wir schlagen vor, die Beherrschung der herkömmlichen Protokoll (§ § 1 und 4, und, falls erforderlich, Abschnitt 5) vor dem Lernen zu Lipiden aus liposomalen Suspensionen (§ § 2-5) zu hinterlegen.
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Protocol
1. Ablagerung von Lipiden aus organischen Lösungsmitteln: Klassische Protocol
- Entfernen von Lipiden aus der Lagerung bei -20 ° C oder -80 ° C, auf RT erwärmt. Achtung: Lipide sind extrem hygroskopisch, und viele sind empfindlich gegenüber Sauerstoff. Titelbild Lipide in trockenem Argon oder Stickstoff und in allen Schritten Minimierung der Exposition gegenüber Luft.
- Wenn erforderlich, zur Aussetzung der Lipide in Chloroform oder Cyclohexan bei 1-10 mg / ml; beachten Sie, dass vom Hersteller angegebenen Konzentrationen in der Regel sind nur nominal ACHTUNG: Tragen Sie geeignete Handschuhe und andere persönliche Schutzausrüstung bei der Verwendung von organischen Lösungsmitteln.. Entfernen Sie die PPE schnell, wenn Lösungsmittel auf sie verschüttet wird, da die meisten Materialien noch durchlässig für diesen Lösungsmitteln und sie nur vorübergehenden Schutz.
- Reinigen Sie beide Seiten von zwei 25 x 37,5 mm ITO beschichteten Glasplatten mit Ethanol
- Mischen Sie die Lipide, um die gewünschten molaren Verhältnisse zu erreichen. Für jede 1 cm 2 der Fläche der ITO gleitet, um mit der Lippe beschichtet werdenid, mix ~ 15-20 ug Lipiden. Zum Beispiel, wenn beide 25 x 37,5 mm-Dias waren sein komplett beschichtet, würden wir verwenden in der Regel 30 ul 10 mg / ml Lipid-Mischung. Hinweis: mit 0,1 mol% Texas Red-Fluoreszenz-Bildgebung für DPPE, und siehe unten warnt vor Fluoreszenzfarbstoffe.
- Überprüfen Sie, dass die ITO-beschichtete Seite der Glasscheiben nach oben durch die Messung der Oberfläche Widerstand mit einem Ohmmeter oder Multimeter.
- Saugen Sie die Lipide in einem Lösungsmittel-resistent Spritze. Vorsicht: Keine Leime oder Kunststoff versehen, andere als PTFE, wenden sich bitte an das organische Lösungsmittel.
- Mit der Spritze Nadel nicht ganz berühren die ITO-Oberfläche, langsam gelten die Lipid-Bewegen der Nadel hin und her über die Folie. Bedecken Sie die Oberfläche so gleichmäßig, auf der Suche nach einem "Regenbogen Glanz" auf der Glasoberfläche.
- Legen Sie die Folien schnell unter <1 Torr (1 mmHg) Vakuum für 0,5-1 Stunden zu entfernen jede Spur Lösungsmittel. Lassen Vakuum mit Edelgas.
- Tragen Sie eine Silikon-Dichtung, mit einemdünne Schicht aus Silikon Vakuumfett auf beiden Seiten. Lassen Sie mindestens 5 mm von ungedeckten Rutsche an einem Ende des Schlittens ausgesetzt.
- Fahren Sie direkt mit Abschnitt 4.
2. Kleine Liposomen-Herstellung für Controlled Dehydration
- Bereiten Sie die Lipid-Mischung wie in den Schritten 1.1 bis 1.4.
- Trocknen Sie die Lipide mit einem Strom von Argon oder Stickstoff in einem 10-15 mm Durchmesser Kultur Rohr. Für kleine Mengen Lipide, ≤ 0,5 mg, kann die resultierende Folie unmittelbar, nachdem man sie unter Vakuum für 0,5-1 Stunden, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen hydratisiert ist, weiter mit Schritt 2.5. Größere Mengen an Lipid neigen dazu, organische Lösungsmittel in einer dicken Gel abzufangen, auch unter Vakuum und sind besser durch Gefriertrocknung hergestellt; siehe Schritte 2.3-4.
- Hängen Sie das getrocknete Lipid-Film in Cyclohexan, Deckel mit Argon und Dichtung mit einem Anschlag, den Schlauch in einem kalten Block und frieren bei -80 ° C für 1 Stunde Minimum.
- Setzen Sie den kalten Block-und Lipid-Probe in einem Vakuumsystemder Lage zu erreichen 100mTorr. Gib Vakuum, es wird "Stall" bei etwa 1 Torr sublimiert als Lösungsmittel aus. Sobald Lösungsmittel wird vollständig entfernt (ca. 1 Stunde) Vakuum wird unter dieses Niveau fallen. Lösen Vakuum mit Inertgas und das Rohr abzudichten oder Hydrat sofort.
- Während die Lipide unter Vakuum sind, mit Degas Flüssigkeitszufuhr Puffer Vakuum und Begasung 15-17.
- Hydrate die Lipide mit entgastem Puffer bei Endkonzentration 1-10 mg / ml. Erlauben die Lipide zu Hydrat langsam. Nach 30 min-1 Std., Vortex aufzubrechen verbleibenden Klumpen. Warten Sie eine zusätzliche 0,5-1 h bis zur vollständigen Hydratation ermöglichen. Verwenden eines osmoticant, wie Sorbit oder Saccharose bis zu 200 mM, die vollständige Austrocknung in Schritten zu verhindern.
- Bereiten 100-200 nm Durchmesser Liposomen durch Extrusion. Siehe Herstellerangaben Extrusion Protokoll für Details. Beachten Sie, dass der Puffer muss weniger als ~ 25 mM Ionenstärke oder spezielle Elektroformation Spannung Protokolle in Abschnitt 4 benötigt werden.
3.Ablagerung von Lipiden durch geregelte Dehydratisierung von Kleine Liposomen
- Achtung: Unser Protokoll erfordert Lipide in Dampf-Gleichgewicht mit gesättigten Salzlösungen für viele Stunden abgegeben werden. Wir empfehlen dringend, die Durchführung des Protokolls in einer Inertgas-Atmosphäre, mit einem Handschuhfach oder ähnliche Gehäuse.
- Achtung: Bei der Herstellung von Proben, die Proteine, die vollständige Austrocknung zu vermeiden. Hydrate die Atmosphäre in einem geschlossenen Raum mit einem Becher mit warmem Wasser oder ein Ultraschallgerät basierte Luftbefeuchter. Verwenden Sie ein Hygrometer, um sicherzustellen, dass es mindestens 30% relativer Luftfeuchtigkeit. Verwenden Sorbit oder Saccharose in dem kleinen Liposomen-Puffer als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um insgesamt Austrocknung zu verhindern.
- Bereiten Sie eine gesättigte Salzlösung geeigneter relativer Luftfeuchtigkeit. Soll-Luftfeuchtigkeit abhängig von der Osmolarität der Vesikelherstellung. Für Zubereitungen, die mit physiologischen Osmolarität, verwenden 30-45% RH, während niedrige Osmolarität Vesikelpräparationen kann ausreichend entwässertGleichgewicht mit 75-90% RH (siehe auch Tabelle 1).
- Legen Sie die gesättigte Salzlösung und überschüssige Salz in einem dicht verschließbaren Behälter mit einer inneren Regal. Gewerbe Lebensmittel Behälter für Joghurt und Müsli Arbeit sehr gut. Ersetzen Sie das Regal nach dem Befüllen, und stellen Sie sicher Fluid 5-10 mm unter dem Regal.
- Saubere ITO beschichtete Objektträger, wie in Abschnitt 1. Verwenden Sie das Multimeter, um zu bestimmen, welche Seite leitend ist, und beschriften Sie die nicht-leitenden Seite mit dem Sample-Namen.
- Fetten Sie beide Seiten des Silikons (USP Klasse VI) Dichtung (en) mit einem oder mehreren Löchern.
- Legen Sie die Folien leitfähigen Seite nach oben auf der Bank, und wenden Sie die Silikon-Dichtung (en) zu jeder Folie, auf die Lipid angewendet werden, um sicherzustellen, gibt es mindestens 5 mm der Schieber an einem Ende mit dem Gerät verbinden Elektroformation. Glätten Sie die Dichtung, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.
- Verdünnen Sie die Vesikelherstellung in eine salzarme isosmotischen Puffer auf ~ 1-2 mg / ml. Wir finden, dass eine höhere konzentrtionen zu schlechten Ergebnissen.
- Bewerben Lipid mit dem Schlitten in 1-10 ul Tropfen. Kleinere Tropfen erzeugen im Allgemeinen bessere Ergebnisse.
- Legen Sie die Folie auf der Innenseite Regal über der gesättigten Salzlösung und verschließen Sie den Behälter fest. Lassen Sie bei RT für 3 h auf O / N. Der Behälter kann bei 4 ° C gebracht werden, aber beachten Sie, dass für einige Salze, die RH hängt stark von der Temperatur und dem kalten wird Gleichgewichtszeit erhöhen.
- Der resultierende Film kann eine leichte Regenbogen Glanz, aber in jedem Fall sollte erscheinen fast ausgetrocknet. Sehr osmotischen Eduktlösungen kann unmöglich vollständig trocknen zu einer Lipid-Film, das keinen nachteiligen Einfluss auf die Ergebnisse.
4. Elektroformation von Riesenliposomen
- Lipidfilme, insbesondere solche aus dehydratisierten Liposomen gebildet werden, lösen sich leicht. Vorsichtig Hydrat jeder Vertiefung, indem eine 27 G Nadel Spritze am Rand der Dichtung und langsam Aufbringen Puffer. Puffer könnensind Wasser, ≤ 200 mM Saccharose, ≤ 1 M Sorbit und ≤ 5 mM HEPES. Mehr als 10 mM Salzlösung kann verlangen alternate Elektroformation Spannung Protokolle. Überfüllsicherung jede Dichtung gut ~ 10%.
- Hinweis: Sobald die Lipide sind hydratisiert, gehen schnell durch die verbleibenden Schritte, da Lipidfilmen sofort ablösen beginnen. Ertrag und Größe werden maximiert, wenn Elektroformation beginnt umgehend.
- In einer fließenden Bewegung, anwenden eine zweite ITO Rutsche, leitende Gesicht, an die Spitze der Dichtung. Achten Sie darauf, mindestens 5 mm Überhang außerhalb der Dichtung an und gegenüber dem ersten Überhang haben. Drücken Sie vorsichtig, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.
- Reinigen Sie die zwei Überhänge mit Ethanol und sicherstellen, dass die Dichtung zugewandten Seiten mit Ihrem leitenden Multimeter sind.
- Die Kammer kann weiter mit Parafilm oder Licht Zugfeder Clips gesichert werden, falls gewünscht.
- Schließen Sie das Elektroformation Kammer mit einer Spannungsquelle durch die Sicherung Aluminium oder Kupfer Bars, "EMI gasket Schaum "oder leitenden Klebeband an den leitenden Oberflächen der beiden Rutschen. Wir verwenden EMI-Dichtung Schaum. Pläne für eine Spannvorrichtung und Klemme sind in Abbildung 5 dargestellt.
- Stellen Sie sicher, dass es keinen elektrischen Kurzschluss zwischen den Kontakten, und dass die Kontakte verbinden richtig auf die ITO Oberflächen, mit dem Multimeter.
- Erhitzen der Kammer 10 ° C oberhalb der höchsten Schmelztemperatur des einen der Lipide, z. B. für DPPC, Wärme auf 52 ° C mindestens 10 ° C über der Kette Schmelztemperatur von 42 ° C.
- Für salzarme Puffer, gelten eine 10 Hz Sinus, ~ 0,7 V rms für jeden Millimeter Abstand zwischen den beiden ITO beschichteten Oberflächen, für 60-90 min. Für Hochsalzpuffern sollten andere Spannung Protokolle verwendet (siehe Referenzen) werden.
5. Imaging und Fehlerbehebung
- Bild der Liposomen mit einem inversen Mikroskop mit einem Filter Cube für Rhodamin oder Texas Red Farbstoffe ausgestattet. Das Liposom muss kugelförmig,überwiegend unilamellar von Auge und frei von Defekten wie "strings" hängen von der Liposomen.
- Wenn die Liposomen zu klein sind, verbrauchen weniger Lipid.
- Wenn es viele Mängel oder einige Liposomen sind, kann dies darauf zurückzuführen sein, Gelphase Lipiden. Betrachten wir die Erhöhung der Temperatur Elektroformation.
- Wenn wenige oder keine riesigen Liposomen überhaupt aus dehydriert kleine Liposomen, reduzieren den osmotischen Stärke der Liposomen-Puffer, oder erhöhen Sie die Stärke des osmotischen Elektroformation Puffer. Ein Einbruch von Puffer in die konzentrierte interstitielle Pufferlösung kann Ablösung des abgeschiedenen Lipid-Film.
- Wenn Vesikel Ertrag, Qualität oder Größe ist schlecht, und Sie enthalten Salze oder pH-Puffer in den Elektroformation oder Liposomen Puffer, sollten alternative Elektroformation Spannung Protokolle. Zum Beispiel, Pott, et al. 11, empfehlen eine dreistufige Protokoll mit einem 500 Hz Sinus, die Erhöhung der Spannung von 50-1,300 Vpp / m in 30 min, halten für 90 min, dien Verringerung der Frequenz 50 Hz über 30-60 min. Platin oder Titan-Elektroden kann in diesem Fall nicht benötigt werden, aber dies wird nicht wesentlich verändert das Protokoll.
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Representative Results
In unseren Beispielen bereiten wir Liposomen aus einem Gemisch von etwa 55 Mol-% POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin), 15 mol% erscheint (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-Phosphoserin , 30 mol% Cholesterin und 0,1 mol% Texas Red-markierten 1,2-dipalmitoyl-sn-Phosphoethanolamin (TxR-DPPE). Diese Zusammensetzung wie etwa Vertreter der Spinalganglien Lipide 18 gewählt wurde. Wir bemerken, dass 15 mol% geladen Lipid (hier POPS) ist in der Nähe der Grenze dessen, was in Elektroformation verwendet werden (zB Walde et al. 4).
Lipid Abbau durch Hydrolyse und Peroxidation ist ein besonders wichtiges Thema für viele Lipidmischungen und viele empfindliche Experimente (siehe Diskussion). Aus Gründen der Klarheit allein, wir verwenden keine Inertgasatmosphären in der Video-Präsentation. Wie aus den nachfolgenden Figuren bedeutet dies nicht merklich beeinflussen die Qualität der Liposomen, aber für empfindliche Studien oderbei der Verwendung von mehrfach ungesättigten Lipiden, ist es wichtig zu Lipid Zusammenbruch zu verhindern.
Da die große Hürde in Elektroformation ist, um eine gute Lipid-Film auf der Indium-Zinn-Oxid (ITO)-Substrat zu bilden, zu wissen, was die Lipid-Film aussehen sollte, wenn getrocknet ist entscheidend. Allerdings, wenn Elektroformation fehlschlägt, tut dies oft vollständig, was zu keiner nennenswerten Riese Liposomen Produktion. Häufig wird erhebliche Detritus beobachtet werden, was in der Regel bedeutet, dass zu viel Lipid verwendet wurde. Unsere Zahlen zeigen, was man auf Erfolg zu sehen erwartet.
Abbildung 2 zeigt zwei verschiedene Patches von Liposomen aus Lipiden abgeschieden von Chloroform elektrogeformt. Im linken Fensterbereich genauer untersuchen die Patches durch Pfeile 2 und 3 angegeben. Während Pfeil 2 zeigt ein Patch mit schlecht unterscheidbar Liposomen können keine Liposomen in den Fokus in dem durch Pfeil 3 gebracht werden. Zusammen zeigen diese Ergebnisse einen allgemein schlechtenVorbereitung, wahrscheinlich aufgrund wobei es zu viel Lipid abgeschieden in diesem Bereich. Im rechten Fensterbereich sind solche "fuzzy" Regionen weniger verbreitet, was eine allgemein bessere Vorbereitung. Wir finden, dass es selten ist, vollständig zu eliminieren solche Unvollkommenheiten.
Abbildung 3 zeigt Liposomen erfolgreich aus Lipiden elektrogeformt abgeschieden durch Dehydratisierung von kleinen Liposomen, an zwei Vergrößerungen, aufgenommen mit Texas Red Epifluoreszenz. Liposomen sind spärlich, aber es gibt mehrere gute Exemplare. Weil Größe variiert, sind mehrere unscharf. Die Pfeile zeigen drei gute Qualität Liposomen im Größenbereich von ~ 5-20 um, von denen zwei in der 40fache Vergrößerung Bild erscheinen. Beachten Sie die klare "ring" am Rande: dies deutet auf eine einschichtige oder fast unilamellar Liposomen. Während einige Spots von Lipid zu eingestürzt oder noch nie ausgebildet Lipid erscheinen, ist dies eine gute Qualität Ergebnis.
Schließlich unser Ziel in der Entwicklung und Veröffentlichung dieses Protokollist GUVs mit intakten, funktionale Säugetieren Ionenkanäle, die für herkömmliche Patch-Clamp-Elektrophysiologie vorzubereiten. In Abbildung 4 zeigen wir Capsaicin-activated TRPV1 Ionenströme in Lipidmembran Patches von GUVs gebildet mit diesem Protokoll aufgezeichnet herausgeschnitten. Der Strom kann durch Ruthenium Red blockiert werden, und nicht durch das Capsaicin Fahrzeug (0,1% Ethanol, 138 mM NaCl, 3 mM HEPES pH 7,4) allein aktiviert. Die Herstellung der Proteoliposomen für die Elektrophysiologie Experimente ist weit über den Rahmen des vorliegenden Protokolls, ist aber Gegenstand eines eingereichten Artikels.
| Salz | Molalität bei 20 ° C und Sättigung | % RH bei 10 ° C | % RH bei 20 ° C | % RH bei 30 ° C |
| Magnesiumchlorid Hexahydrat | 5.8 | 33 | 33 32 | |
| Kaliumcarbonat Dihydrate | 8.0 | 47 | 44 | 42 |
| Natriumbromid | 4.6 | 58 | 57 | 57 |
| Kupferchlorid | 5.6 | 68 | 68 | 67 |
| Natriumchlorid | 6.13 | 75 | 75 | 75 |
| Kaliumchlorid | 4,61 | 87 | 86 | 84 |
Tabelle 1. Relative Luftfeuchtigkeit (% RH) von mehreren gemeinsamen Salze Relative Luftfeuchte Daten von Greenspan 19 und Rockland 20;. Sättigung Daten aus den International Critical Tables 21.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der riesigen Liposomen Elektroformation von kleinen Liposomen. (Oben links) Kleine Liposomen werden in einer Reihe von kleinen Tröpfchen abgeschieden, <5 ul. (Oben Mitte) Die Liposomen sind dehydriert unter kontrollierten relative Luftfeuchtigkeit, indem sie in einem verschlossenen Behälter über einer gesättigten Salzlösung. Ein Hygrometer ist optional. (Oben rechts) Sobald dehydriert zu einem klebrigen Film von Lipid-und (möglicherweise) osmoticant wie Sorbit, die Lipide in einer hyperosmotische Puffer rehydriert (siehe Protokoll Abschnitt 5). (Unten links) die Elektroformation Kammer mit einer zweiten ITO Folie auf der Oberseite abgedichtet. (Unten rechts) Schließlich wird der Raum oberhalb des Lipidkette Schmelztemperatur erhitzt, und mit einer Signal-Quelle, die ein oszillierendes elektrisches Feld über den beiden ITO-Folien.
Abbildung 3. Electroformed Riese Liposomen vor Austrocknung abgeschieden Lipiden. (Links) bei 10-facher Vergrößerung gebildet sind mehrere Liposomen sichtbar. Drei Liposomen bezeichnet. (Rechts) Die gleiche Ansicht wie auf der linken Seite, bei 40-facher Vergrößerung, mit der gleichenLiposomen (2 und 3) bezeichnet. Die Anzahl dieser Liposomen ist in der Regel viel kleiner als bei Galvanoformung von Lösungsmittel abgeschieden Lipid, aber völlig ausreichend ist für viele Zwecke. Abgebildet mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop mit einem Chroma 41004 Texas Red Filter Würfel und Stanford Photonics XR/MEGA-10 S30 intensivierten CCD-Kamera ausgestattet. 
Abbildung 4. Capsaicin aktiviert TRPV1 Strom in einer Membran aus einem Patch GUV herausgeschnitten aufgezeichnet unter Verwendung dieses Protokoll. A. Der Leckstrom angegeben a 500 MOhm Widerstand versiegeln, bevor Capsaicin aufgenommen. B. Saturating Capsaicin (> 20 um, in 0,1% Ethanol) aktiviert ein TRPV1 großen Strom;. wird der Strom durch Ruthenium Rot gesperrt, und wird nicht durch Fahrzeugs aktiviert (0,1% Ethanol in Puffer) allein (Daten nicht gezeigt) C. Die aktuellen Renditenzur Grundlinie nahe wie Capsaicin aus dem Patch gewaschen. 
Abbildung 5. Pläne für Elektroformation Kammer. Inbegriffen ist eine Übersicht, die die komplette Montage und dimensioniert Schaltpläne für den oberen und unteren Stücke aus Kunststoff. Verwenden Acryl-oder andere leicht bearbeiteten durchsichtigen Kunststoff. Die dünne Kapton Folienheizvorrichtung sollte der Temperaturregler (siehe Tabelle Reagenzien und Ausrüstung) verbunden werden, und die EMI-Dichtung Schaum sollte dem Funktionsgenerator verbunden ist, so dass das Sinussignal an den beiden ITO-beschichtete Objektträger aufgebracht wird. Ein Loch wird für einen Temperaturfühler vorgesehen ist. Flachkopf 10-32 Schrauben sind in den Senkbohrungen in dem Unterteil angeordnet ist, und durch den oberen Teil. 10-32 Muttern verwendet, um die Anordnung zu sichern. Wenn es vollständig alszusammengebaut, sollte die obere und untere Stück aus Kunststoff bündig mit einander auf beiden Seiten (die Seiten parallel zur EMI-Dichtung.) Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Elektroformation riesiger Liposomen wurde in eine flexible Technik kompatibel mit verschiedenen Lipiden, Zubereitungen und Puffer entwickelt. Eine sorgfältige Steuerung der Lipidablagerung-Verfahren ist sehr entscheidend für den Erfolg. Wir haben einfache Werkzeuge vorgestellt, um eine kontrollierte Abscheidung von Lipiden aus kleinen Liposomenzubereitungen ein einfacher Prozess zu machen. Die relative Feuchtigkeit ist für die einwandfreie Entwässerung der ersten Liposomen, und der optimale Wert wird mit der anfänglichen Konzentration von gelösten Stoffen in der Liposomensuspension variieren. Niedrigere relative Luftfeuchtigkeit ist erforderlich, um mehr konzentrierten Proben auf ein angemessenes Niveau zu entwässern.
Die genaue Flüssigkeitszufuhr Protokoll und elektrisches Feld zum Elektroformation verwendet wird, bleibt ein Punkt der Diskussion 1,4,7,10,11,22. Die einfachsten Protokolle sollten zuerst bevor Liposomen Elektroformation in Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen, geladenen Lipiden oder sehr hohe Konzentrationen von qualitativ Schmelze gemeistert werdenING Temperatur Lipiden. Sobald diese Fähigkeiten beherrscht werden, erweiterte Protokolle der Regel teilen die Elektroformation Prozess in drei Teile: anfänglichen Schwellung, Wachstum und Ablösung. Anfänglicher Quellung scheint durch langsames Erhöhen des angelegten elektrischen Feldes 11 begünstigt werden. Eine zweite, optional Bühne feste Feldstärke kann helfen, die endgültige Größe der Liposomen. Schließlich kann die Verringerung der Frequenz des oszillierenden Feldes beitragen, Liposomen aus der ITO-Oberfläche zu lösen. Höhere Frequenzen sind notwendig, um Liposomen in physiologischen Salzkonzentrationen 11 Electroform, aber Liposomen können über einen extrem breiten Bereich von Frequenzen und Amplituden Bereich 10 ausgebildet werden.
Die Beobachtung, dass Riesen-Liposomen wird spontan auf Rehydratation dehydriert Liposomen mit einer hypo-osmotische Puffer 7 gibt mehrere Schlüssel zum Erfolg. Zunächst beginnt die Liposomen Quellvorgang sofort, so dass für Elektroformation, einigeGruppen haben sogar festgestellt, es sinnvoll, die AC elektrischen Feldes vor Rehydratisieren der Lipid-Film 10 gelten. Zweitens ist es wahrscheinlich, dass die Strömung die liposomale Quellung antreibt, und dass Elektroformation erfolgt zumindest teilweise durch elektro-osmotisch angetriebene Strömung. Dies setzt für die nützlich Frequenz und Amplituden, die in Elektroformation 10 verwendet werden kann.
Ein wesentlicher Punkt der Diskussion in den letzten Jahren hat das Potenzial für die Lipid-Hydrolyse und Peroxidation 23,24. Die erste Verteidigungslinie gegen Lipid Abbau jeglicher Art ist, um Sauerstoff aus allen Materialien in der Herstellung verwendet GUV entfernen: Seit Peroxidation hängt von molekularem Sauerstoff 23, dies sollte den Prozess erheblich verlangsamen. Eine Kombination von Vakuum und Spülen mit Inertgas zu verwenden, um so viel Sauerstoff wie möglich 15-17 entfernen. Beschallung und Licht Vakuum sind unwirksam. Wir verwenden ein Sauerstoff-Test-Kit (Chemetrics K7501) bis verify dass wir Sauerstoff entfernt gründlich wie möglich. Die Hydrolyse ist mehr schädlich, sondern wird durch die Aufrechterhaltung neutralen pH 25, und durch eine Verringerung der Spannung in Elektroformation 24 verwendet wird, reduziert. Einige Autoren befürworten die Verwendung von Titan-Elektroden anstelle der ITO gleitet 23,24,26,27. Wir bevorzugen es, die Möglichkeit einer Verunreinigung unserer Proben mit Titan (oder Metall) zu vermeiden, da es in der Vergangenheit bekannt, mit Liposomen Experimenten 28,29 stören kann, aber es könnte helfen, einige Peroxidation oder Hydrolyse Wirkungen zu verhindern. Es ist selbstverständlich, dass bei längerer Exposition gegenüber hohen Temperaturen Lipid Aufschlüsselung 30 beschleunigt. Schließlich gibt es Dünnschichtchromatographie 24,31, kolorimetrische Assays 23, und andere Methoden 31 bis Fettabbau quantifizieren.
Ein ähnliches Problem betrifft die fluoreszierenden Lipids Farbstoffe verwendet, um Bild GUVs, vor allem für die Untersuchung der lateralen Phasentrennung 30,32 30,33 gewählt und verwendet werden, bei minimalen Konzentration.
Wir sind nicht bekannt, dass Konsens darüber, ob die ITO-Elektrode Dias kann wiederverwendet werden. Viele Gruppen tun wiederverwenden ihre ITO Rutschen, während einige dies nicht tun. Neuere Arbeiten zeigen, dass die Folien mit der Zeit abgebaut zu tun, kann aber geglüht, um hohe Leistung 34 wiederzuerlangen; dieser Abbau nur eine geringe Wirkung für die Lipid-Gemische einschließlich zwitterionischen oder anionischen Lipiden, war aber entscheidend für Mischungen, die kationische Lipide. Wir wiederverwenden unsere Folien ohne Glühen.
Zwar gibt es eine große Variabilität in den verwendeten Protokollen bis hin zu riesigen Liposomen, das theoretische Verständnis und praktische Erfahrung mit der Technik Electroform wird ständig verbessert. Bereits Liposomen mit großen Mengen geladene Lipide oder in Hochsalzpuffern gebildet werden. Der Schlüssel bleibt effiziente Abscheidung der Lipide an der Elektrodenoberfläche, which ist der Kern unseres Protokolls.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Bryan Venema und Eric Martinson für den Bau des Elektroformation Gerät. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of General Medical Sciences der National Institutes of Health (R01GM100718 zu SEG) und der National Eye Institute der National Institutes of Health (R01EY017564 zu SEG) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
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