Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Verticale T-doolhof Keuze Test voor geleedpotigen Reactie op odoranten

doi: 10.3791/50229 Published: February 14, 2013

Summary

Een verticale, T-doolhof olfactometer beschreven voor het testen van de gedragsreactie van geleedpotigen. De olfactometer kan de experimentator om keuzes te maken die door proefpersonen te meten wanneer het wordt blootgesteld aan twee potentiële geur velden. Zowel aantrekking tot en afstoting van geurstoffen kan worden gemeten met dit apparaat.

Abstract

Gezien het economisch belang van insecten en spinachtigen als plagen van landbouwgewassen, stedelijke omgevingen of als vectoren van planten-en menselijke ziekten, worden verschillende technologieën worden ontwikkeld als controle-instrumenten. Een subgroep van deze instrumenten is gericht op het wijzigen van het gedrag van geleedpotigen door aantrekking of afstoting. Daarom geleedpotigen vaak de focus van gedrag onderzoeken. Diverse instrumenten zijn ontwikkeld om geleedpotigen gedrag, met inbegrip van windtunnels, vlucht molens, servospheres, en verschillende soorten olfactometers te meten. Het doel van deze tools is het meten van insecten of spinachtigen reactie op visuele of vaker olfactorische signalen. De verticale T-doolhof oflactometer hier beschreven meet keuzes die door insecten in reactie op lokstoffen of insectenwerende middelen. Het is een high-throughput assay apparaat dat gebruik maakt van de positieve phototaxis (aantrekking tot licht) en negatieve geotaxis (neiging tot lopen of vliegen boven) tentoongesteld door vele geleedpotigen. De olfactometer bestaat uit een 30 cm glazen buis die in half verdeeld met een Teflon strip die een T-labyrint. Elke helft dient als een arm van de olfactometer waardoor de proefpersonen een keuze tussen twee mogelijke geur velden in testen met lokstoffen te maken. In assays die middelen, kan een gebrek aan normale reactie op bekende lokstoffen ook gemeten worden als een derde variabele.

Introduction

Geleedpotigen (waaronder insecten en spinachtigen) worden vaak omschreven als plagen, omdat ze ofwel met de menselijke consumptie concurreren landbouw-of stedelijke omgevingen of te verzenden oorzakelijke pathogenen van de ziekte 1. Een groot deel van de investeringen wordt gemaakt in de ontwikkeling van controle-instrumenten voor dergelijke plagen. Deze tools kunnen sterk variëren en aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij de ontwikkeling biorational tools die ofwel te wijzigen of te exploiteren het natuurlijke gedrag van plagen met het gebruik van gedrags-lok-en insectenwerende middelen 2,3.

Geleedpotigen plagen vaak afhankelijk van olfactorische signalen of signalen voor partner en / of gastland 4. Daarom ontdekking van effectieve lokstoffen of insectenwerende middelen voor ongedierte kan vaak leiden tot de ontwikkeling van controle-instrumenten. Dit proces van ontdekking omvat verschillende stappen. Eerst moet het natuurlijke gedrag van de proefpersoon worden begrepen. Bijvoorbeeld, moet men nagaan of een geslacht van een bepaalde soort de andere trektseks voor mate plaats. Dan moet men bepalen of deze attractie wordt gemedieerd door een chemische en waarbij die chemische geproduceerd. Verdere stappen omvatten het bepalen wanneer de chemische stof wordt geproduceerd en de uiteindelijke identificatie. In deze procedure moet de proefpersoon (insect of mijt) gedragsmatige reactie op geurstoffen worden getest. Aanvankelijk zal het gedrag van de proefpersoon worden getest om het natuurlijke materiaal. Bijvoorbeeld kan een mannelijke mot reactie getest met die van het extract van de vrouwelijke soortgenoten het feromoon klier. Als alternatief kan een herbivore reactie van de natuurlijke geuren van de waardplant getest. Hoewel deze onderzoeken vaak een praktische focus op de ontwikkeling van management tools 5,6, kunnen ze ook worden toegepast op onderzoek dat meer fundamentele vragen, zoals soortvorming 7 behandelt. Volgende stappen omvatten het testen van de geleedpotigen de reactie van synthetische versies van de geïdentificeerde natuurlijke producten.

Understanding hoe geleedpotigen reageren op chemicaliën vereist de ontwikkeling van geschikte instrumenten voor het meten van hun gedrag. De gegevens die zijn gegenereerd door dergelijke middelen zal afhangen van hoe goed de onderzoeker in staat is om natuurlijk gedrag in een gecontroleerde omgeving te meten. Meer dan zes decennia geleden, werden ononderbroken kunnen vliegen olfactometers en tunnels ontwikkeld om insecten reactie op geurstoffen 8,9 te meten. Olfactometers verschillen aanzienlijk in ontwerp en worden vaak afgestemd op de specifieke insecten of probleem wordt onderzocht. Het doel van dit artikel is het beschrijven het ontwerp en gebruik van een verticaal, T-doolhof olfactometer voor het meten insect reactie op geurstoffen (figuur 1). De olfactometer De verticale oriëntatie maakt gebruik van de negatieve geotaxis (neiging om omhoog) vertoond door vele insecten. Een lichtbron direct boven de olfactometer maakt gebruik van de positieve phototaxis (neiging om te bewegen naar lichtbron) vertoond door vele insecten. De olfactometer is vooral nuttig voor hemipteran insecten die vaak niet gemakkelijk vertonen beweging horizontaal gerichte olfactometers en dat sterk wordt beïnvloed door lichtintensiteit met betrekking tot oriëntatie. Echter, dit apparaat gebruikt worden voor een breed scala van vliegende en kruipende insecten, spinachtigen en. De olfactometer kan worden gebruikt om zowel lokstoffen en insectenwerende evalueren. Bij lokstoffen, wordt het vertakte geur veld (figuur 1) is met de vermoede lokstof model enerzijds versus schone lucht model aan de andere kant. Een keuze wordt geregistreerd wanneer de insect model aan de basis van de olfactometer kiest een van de twee velden geur. Bij insectenwerende een derde gedrag mogelijk. Naast opwaartse beweging in een van de twee velden geur, geen opwaartse beweging kunnen worden geregistreerd wijst op een niet-responsieve stimulus of afstoting stimulus van beide velden geur.

Protocol

  1. Samenstel van een speciaal ontworpen, twee poorten gedeeld T-olfactometer eerder beschreven in Mann et al.. 10 getoond in figuur 1. De olfactometer bestaat uit een 30 cm glazen buis die is gesplitst in twee afzonderlijke poorten met een Teflon strip die een T-labyrint. Elke helft is analoog aan een arm van een 2-keuze stijl olfactometer waardoor de proefpersoon te kiezen tussen twee potentiële geur velden.
    1. Vergadering en de daaropvolgende testen moet plaatsvinden in een temperatuur-gecontroleerde ruimte of klimaatkamer.
    2. Mount glas T-doolhof olfactometer verticaal zoals weergegeven in figuur 1 en plaats hem onder een tl-900 lux lamp.
    3. Voor een optimale lichtspreiding, moet de montage worden gemonteerd in een 1,0 x 0,6 x 0,6 m ondoorzichtig container op een uniforme lichtspreiding te maximaliseren.
    4. Sluit de olfactometer armen om de geur bronnen die zullen worden gehuisvest in vaste-fase micro-extractie bedrijf / geurbron chamber (SPMEC) (ARS, Inc, Gainesville, FL) door Teflon, glas buisverbindingen. Elke SPMEC bestaat uit een rechte glazen buis (17.5 cm lang x 3,5 cm breed) ondersteund met een inlaat en uitlaatklep voor inkomende en uitgaande luchtstromen (figuur 1).
    5. Sluit de luchttoevoer systeem om een ​​externe bron van bevochtigde en koolstof-gezuiverde lucht die onder constante druk (de lucht levering systeem heeft zowel een interne koolfilter voor luchtzuivering en een luchtpompje voor bevochtiging als externe bronnen zijn niet beschikbaar).
    6. Los gewenste chemische monsters binnen passende verdunningsmiddel (oplosmiddel) en pipet op een langzame afgifte substraat, zoals een katoenen lont (Petty John Packaging, Inc, Concord, NC). De controle behandeling dient te bestaan ​​uit een katoenen lont geïmpregneerd met oplosmiddel alleen.
    7. Om betekenisvolle verontreiniging van het glaswerk te voorkomen, omhullen de behandelde en de controlegroepen katoen wieken in het laboratorium van weefsel (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) en plaats in de twee SPMEC armen (ARS, Inc, Gainesville, FL). Bij levende planten samples, een guillotine vluchtige opvangkamer wordt aan de olfactometer bevattende behandelingen in plaats van de SPMEC (figuur 1).
    8. Leveren gezuiverd en bevochtigde lucht door de SPMEC (of guillotine vluchtige kamer) via twee pompen aangesloten op een luchttoevoersysteem (figuur 1). Handhaaf luchtstroom snelheid 0,1 l / min door beide armen van de olfactometer.
  2. Gebruikmakend olfactometer om arthropod reactie op vermeende repellents testen. In de onderhavige beschrijving is een hemipteran insect, Aziatische citrus psyllid, Diaphorina citri, gebruikt als test geleedpotige. Respons werd getest citrus vluchtige alleen of in combinatie met een middel (dimethyl disulfide) en schone lucht geurbronnen.
    1. Voeren alle experimenten bij een gestandaardiseerd temperatuur en relatieve vochtigheid.
    2. Voorafgaand aan alle tests, bloot test onderwerpen lucht versus schone lucht of oplosmiddel versus schone lucht in de T-doolhof olfactometer reinigen de afwezigheid van positionele afwijking of een effect van oplosmiddel om het gedrag van de proefpersoon te verifiëren.
    3. Wijs een geurbron willekeurig aan een van de armen van de olfactometer aan het begin van elke bioassay. Omdraaien positie na elke 10 proefpersonen getest ten minste in potentiële positionele afwijking te elimineren.
    4. Test de reactie van minimaal 30 (en tot 120) proefpersonen per behandeling combinatie.
    5. Laat proefpersonen 1-300 sec tot een gedrags-respons op basis van vooraf vastgestelde respons (latency) interval vertonen.
    6. Record als het onderwerp komt in de behandeling arm, controle-arm of blijft in de release-poort of onder de T-doolhof divisie.
    7. Score een behandeling of controle-arm keuze wanneer een proefpersoon kruist de divisie in de T-doolhof en beweegt in een van beide olfactometer arm.
    8. Score een vergrendelingsmechanisme keuze wanneer een test snverminderd blijft de vrijgave haven of onder de T-doolhof divisie.
    9. Reinig de olfactometer en verbindingsleidingen met 2% zeepoplossing bak de glascomponenten bij 200 ° F tussen het gebruik van verschillende geur behandelingen.
    10. Voor assays waarin vermeende afstotende behandelingen worden in de T-doolhof olfactometer met of zonder chemische behandeling versus schone lucht, vergelijk het aantal proefpersonen liggen dus op lossingsplaats en het niet olfactometer tussen de behandelingen door een variantieanalyse ( ANOVA) gevolgd door HSD-test Tukey's (α <0,05). In gevallen waarin de proefpersonen verlaat de ontgrendelarm Vergelijk het aantal keuze van de bedieningsarm versus de behandeling arm met Chi square (χ 2) analyse op α <0,05.

Representative Results

Attractie van Aziatische citrusvruchten psyllid (Diaphorina citri) volwassenen aan de geuren van hun geboorte waardplant vluchtige stoffen (citrus) is weergegeven in figuur 2A. Significant (α <0,05) meer volwassenen koos de arm van de T-doolhof olfactometer die geuren van citrus levende planten vergeleken met een blanco (schone lucht) controle.

Een voorbeeld van afstoting in figuur 2B. In dit geval werden de insecten blootgesteld aan een arm van de T-doolhof ontvangen citrus vluchtige, terwijl de tweede arm ontvangen vluchtige stoffen uit citrusvrucht die werd behandeld met de bekende middel, dimethyl disulfide 11. In dit geval werden drie soorten gedrag waargenomen. Het aantal psyllids gearresteerd bij de ontgrendelarm en reageert niet statistisch verschillen van het aantal invoeren van de arm die de geur van citrus planten alleen (Figuur 2B). Echter geen psyllids ging de arm met thij waardplant vluchtige wanneer het samen aangeboden met de afstotende (Figuur 2B).

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van verticaal georiënteerde T-doolhof olfactometer verbonden luchttoevoersysteem en geurbehandeling ontgrendelmechanismen. Het diagram is een aanpassing van figuur 1 in Mann et al.. 10. Een proefpersoon individueel geplaatst in de afgifte van de kamer 2-port verdeeld T-olfactometer. Het beweegt in de richting van de geuren door middel van een schuifafsluiter die bestuurd opwaartse beweging maakt in de olfactometer en voorkomt dat de insecten uit kruipen terug in de lossingsplaats gebied. De buis splitst 10 cm na de poort waarde. Een positieve reactie op een geur wordt opgenomen zodra het insect beweegt 0,5 cm in een specifieke kant van de divisie. De guillotine vluchtige verzamelkamer kan worden gebruikt in plaats van een vaste-PHAse micro-extractie bedrijf / geur bronkamer (SPMEC) als een geur bron.

Figuur 2
Figuur 2. Reactie van Aziatische citrusvruchten psyllid (Diaphorina citri) volwassenen om vluchtige stoffen uit citrusvruchten waardplanten versus schone lucht controle (A) of citrus vluchtige stoffen ten opzichte van citrus vluchtige stoffen samen uitgebracht met een afweermiddel (dimethyl disulfide) (B) in een verticaal georiënteerd T -maze olfactometer Figuur 2A:. One-way analyse van variantie (ANOVA) gevolgd door HSD-test Tukey's (α <0,05) werd uitgevoerd om het aantal psyllid een keuze tussen een arm (2 behandelingen, n = 120) geselecteerd. Kolommen aangeduid met verschillende letters zijn significant verschillend van elkaar (α <0,05) Figuur 2B:. Enkele analysis van variantie (ANOVA) gevolgd door HSD-test Tukey's (α <0,05) werd uitgevoerd om het aantal psyllid maken van een keuze tussen arm en blijven in de afgifte punt (3 behandelingen, n = 120) geselecteerd. Kolommen aangeduid met verschillende letters zijn significant verschillend van elkaar (α <0,05).

Discussion

Hierin worden een test-apparaat en het protocol beschreven voor het meten van de respons van de kleine geleedpotigen (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) om geurstoffen. De werkwijze omvat een keuze test, waardoor het insect een keuze te maken tussen twee geurende velden bij assays evalueren van een vermeende lokmiddel. Bovendien kan de proefpersoon geeft drie soorten gedragingen door uit de ontgrendelarm en invoeren een van twee mogelijke geur velden of nog in de ontgrendelarm, bij afstoting assays. De olfactometer maakt high throughput gegevensverzameling omdat het gebruik van de negatieve geotactic (neiging om opwaarts te gaan) en positieve phototactic (neiging te bewegen naar licht) natuurlijke gedragsrespons vele geleedpotigen. Hoewel deze demonstratie gebruikt een psyllid insect testvoorbeeld, kan de test gemakkelijk worden aangepast voor geleedpotigen breed, zowel die vlucht gebruiken of lopen als voornaamste vervoermiddelen.

12. De specifieke ontwerpen van dergelijke olfactometers variëren sterk, maar variaties op het algemene thema van twee keuze assay beschreven, alsook, vergelijkbaar Y-tube assays zijn vaak gebruikt voor geleedpotigen reactie op chemische stoffen meten. Grotere vlucht tunnels die ononderbroken kunnen vliegen van insecten 09 mei veroorzaken hebben ook geleid tot verzameling van baanbrekende gegevens ophelderen van de fundamentele mechanismen van insecten vlucht en oriëntatie op feromonen, evenals de gegevens te informeren praktische gebruik van ongediertebestrijding tools.

Het is vaak nodig om een ​​maat ontwerpen olfactometer en bijbehorende instrumentatie voor de biologie van de specifieke geleedpotige proefpersoon. Die olfactometers die kunnen worden gebruikt bij een algemene groep van insecten zijn nuttiger dan die specific aan een kleine groep, maar soms is de economische betekenis van een kleine groep van insecten dicteert de noodzaak voor de ontwikkeling van een zeer specifieke olfactometer en assay techniek. De op dat moment beschreven ontwerp bouwt voort op eerder bekende geleedpotigen technieken. Het zorgt voor een standaard twee-keuze assay dan Y-tube bioassays in het experimentele arena of choice test in de vorm van een Y-vormige glazen inrichting 7. Typisch zal een arm van een dergelijke Y-buis een behandeling geurstof, terwijl de andere worden leeg gelaten 13. Variaties in dergelijke olfactometers kan toevoeging van meerdere stralen armen 14 en zelfs toevoeging van een bodem medium voor het bepalen van het gedrag van organismen die zich door de bodem 15. In de ontwikkeling van deze olfactometers en bijbehorende assays is het belangrijk na te gaan hoe nauw natuurlijke omstandigheden worden gerepliceerd en dus de relevantie van de ware gedragsreacties beoordeeld in termen van de proefpersonen biologie. Om een ​​large graad, zal de verzamelde gegevens slechts zo nuttig als de relevantie van de gedrags-bioassay met betrekking tot gedragsproblemen van het organisme ecologie 16.

De op dat moment beschreven olfactometer en gedragsproblemen bioassay is speciaal ontworpen voor een hemipteran insect dat heeft de neiging om de vlucht te starten zo kort "springt" 16. De verticale oriëntatie van de olfactometer en de lichtbron arrangement vergemakkelijken inleiding van insecten beweging en dus vervolgens chemisch gemedieerde oriëntatiegedrag worden getest efficiënt en met hoge doorvoer. Deze gedrags-test opstelling kan waarschijnlijk worden gebruikt voor een breed scala van vliegen of lopen geleedpotigen taxa of kan gemakkelijk worden aangepast aan de behoefte van niet-geleedpotigen organismen passen.

Disclosures

De auteur ontving financiering die is verstrekt door de Citrus Research and Development Foundation.

Acknowledgments

De Citrus Research en Development Foundation is erkend voor het verstrekken van financiering. Met dank aan Angel Hoyte en Michael Flores voor het uitvoeren van bioassays.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two port divided T-olfactometer Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL None(Custom made) If unavailable from ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) also currently builds and distributes such equipment.
Solid-phase micro-extraction holding/odor source chamber with Teflon;-glass tube connectors. Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL RV-R3 See above comment
Air delivery system Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL HADS-2AFM2C.4 See above comment
Guillotine chamber Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL L3GP3 See above comment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Resh, R. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. Academic Press, Elsevier Science. USA. (2003).
  2. Biorational tree-fruit pest management. Aluja, M., Lesky, T. C., Vincent, C. CABI. USA. (2009).
  3. Rodriquez-Saona, C., Stelinski, L. L. Behavior-modifying strategies in IPM: Theory and Practice. Integrated Pest Management: Innovation - Development Process. Peshin, R., Dhawan, A. K. Springer. NY. 261-311 (2009).
  4. Cardé, R. T., Millar, J. G. Advances in insect chemical ecology. Cambridge University Press. UK. (2004).
  5. Knight, A. L., Stelinski, L. L., Hebert, V., Gut, L., Light, D., Brunner, J. Novel dispensers simultaneously releasing pear ester and sex pheromone for disruption of codling moth (Lepidoptera: Tortricidae). Journal of Applied Entomology. 136, (1-2), 79-86 (2012).
  6. Mann, R. S., Tiwari, S., Smoot, J. M., Rouseff, R. L., Stelinski, L. L. Repellency and toxicity of plant-based essential oils and their constituents against Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Journal of Applied Entomology. 136, (1-2), 87-96 (2012).
  7. Forbes, A. A., Powell, H. Q., Stelinski, L. L., Smith, J. J., Feder, J. L. Sequential sympatric speciation across trophic levels. Science. 323, (5915), 776-779 (2009).
  8. Kennedy, J. S. The visual responses of flying mosquitos. Proceedings of the Zoological Society of London A. 109, (4), 221-242 (1940).
  9. Miller, J. R., Roelofs, W. L. Sustained-flight tunnel for measuring insect responses to wind-borne sex pheromones. Journal of Chemical Ecology. 4, (2), 187-198 (1978).
  10. Mann, R. S., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Castle, W. S., Stelinski, L. L. Sulfur volatiles from Allium spp. affect Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), response to citrus volatiles. Bulletin of Entomological Research. 101, (1), 89-97 (2011).
  11. Onagbola, E. O., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Stelinski, L. L. Guava leaf volatiles and dimethyl disulfide inhibit response of Diaphorina citri Kuwayama to host plant volatiles. Journal of Applied Entomology. 135, (6), 404-414 (2011).
  12. Baker, T. C., Linn, C. E. Wind tunnels in pheromone research. Techniques in Pheromone Research. Hummel, H., Miller, T. A. Springer-Verlag. New York. 75-110 (1984).
  13. Stelinski, L. L., Rodriguez-Saona, C., Meyer, W. L. Recognition of foreign oviposition marking pheromone in a multitrophic context. Naturwissenschaften. 96, (5), 585-592 (2009).
  14. Gökçe, A., Stelinski, L. L., Whalon, M. E. Behavioral and electrophysiological responses of leafroller moths to selected plant extracts. Environmental Entomology. 34, (6), 1426-1432 (2005).
  15. Ali, J. G., Alborn, H. T., et al. herbivore-induced plant volatile increases biological control activity of multiple beneficial nematode species in distinct habitats. PLoS ONE. 7, (6), e38146 (2012).
  16. Mann, R. S., Ali, J. G., et al. Induced release of a plant defense volatile 'deceptively' attracts insect vectors to plants infected with a bacterial pathogen. PLoS Pathogens. 8, (3), e1002610 (2012).
Verticale T-doolhof Keuze Test voor geleedpotigen Reactie op odoranten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).More

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter