Summary
Hier presenteren we een elektrofysiologische methode gebaseerd op vaste drager membranen met de nadruk op de toepassing daarvan voor de karakterisering van elektrogene membraan transporters.
Abstract
De elektrofysiologische methode presenteren we is gebaseerd op een vaste drager membraan (SSM) bestaande uit een laag octadecanethiol gechemisorbeerd op een gouden gecoate sensor chip en een fosfatidylcholine monolaag geplaatst. Dit samenstel wordt gemonteerd in een cuvet systeem met de referentie-elektrode, een gechloreerde zilverdraad.
Na adsorptie van membraan-fragmenten of proteoliposomen met het membraan eiwit van belang, is een snelle oplossing uitwisseling gebruikt om de vervoersactiviteiten van het membraan eiwit induceren. In de enkele oplossing uitwisselingsprotocol twee oplossingen, een niet-activerende en een activerende oplossing, nodig zijn. Het debiet wordt geregeld door perslucht en een ventiel en buissysteem binnen een Faraday kooi.
De kinetiek van de elektrogene transport activiteit wordt verkregen via de capacitieve koppeling tussen de SSM en de proteoliposomen of membraan fragmenten. Werkwijze Daarom levert alleen transient stromingen. De piekstroom vertegenwoordigt de stationaire vervoersactiviteiten. De tijdsafhankelijke transporter stromingen kan worden gereconstrueerd door schakeling analyse.
Deze methode is vooral geschikt voor prokaryotische of eukaryotische transporters transporters van intracellulaire membranen, die niet kan worden onderzocht door de patch clamp of voltage clamp methodes.
Introduction
Hier laten we zien een nieuwe elektrofysiologische benadering gebaseerd op een solide ondersteunde membraan (SSM) voor de karakterisering van elektrogene membraaneiwitten.
De vaste drager bestaat uit een dunne goudlaag op een glasplaatje, de sensor chip. De hydrofiele goud oppervlak wordt gebruikt om de thiolgroep van een alcanethiol reagens binden. Daarna selfassembly van een fosfatidylcholine monolyer de vorming van de SSM voltooid.
Om electrogene reacties van membraaneiwitten te meten worden proteoliposomen of membraan fragmenten geadsorbeerd aan het SSM (figuur 1). Het eiwit bevattende membraan en de SSM vormen dan een capacitief gekoppeld membraansysteem. Daarom kan lading translocatie in het eiwit bevattende membraan worden gedetecteerd door capacitieve koppeling via de SSM. Deze methode levert alleen overgangsstromen. De piekstroom vertegenwoordigt de stationaire vervoersactiviteiten. De tijdsafhankelijke transporter currents kan worden gereconstrueerd door schakeling analyse.
De sensor chip is gemonteerd in een cuvette (zie figuur 2). De cuvette heeft een cilindrisch volume van de meetcel van 17 pl (netto volume met O-ring gemonteerd). Een veer contactpin creëert de contactpersoon naar de versterker. Een uitlaat connector is vastgeschroefd aan de bovenkant van het hoofddeel en draagt de referentie-elektrode, een gechloreerde zilverdraad.
De cuvette wordt gemonteerd in een kooi van Faraday. Het is verbonden met een fluïdumdoorgang, die wordt gebruikt om de transportactiviteit van het membraaneiwit induceren in reactie op een snelle oplossing uitwisseling (figuur 3). In de enkele oplossing uitwisselingsprotocol twee oplossingen, een niet-activerende en een activerende oplossing, zijn vereist. Het debiet wordt geregeld door perslucht via een klepbediening software op een computer of handschakelaar op een interface box.
Protocol
1. Het opzetten van een Inrichting voor SSM-based Electrofysiologie
Details zijn te vinden in twee van onze technische publicaties, die bevatten ook schematische tekeningen en foto's van onze cuvetten en het opzetten van 1, 2. Andere oplossing uitwisseling configuraties en doorstroming protocollen worden ook besproken in onze methode van papier 2.
In de volgende voegen we enkele recente verbeteringen en technische details die van rechtstreeks belang zijn voor de videopresentatie.
Klepbediening en data-acquisitie
De interface box bevat een commerciële USB digitale uitgang / analoge input interface (NI USB-6009 National Instruments) en de klep chauffeurs. Het controleert de oplossing vloeien en is verantwoordelijk voor data-acquisitie. Kleppen worden normaal aangestuurd met 12 V. Echter, voor het snel schakelen van de kleppen kan worden aangestuurd met een spanning tot 18 V. In de video gebruiken we een 12 V voeding. </ P>
De klep driver printplaat kan werken vier kleppen. Het werd vervaardigd door het atelier van het Max Planck Instituut voor Biofysica. Kleppen kunnen worden gecontroleerd door computer of handmatig via schakelaars op het voorpaneel. Dat laatste is handig voor het spoelen-en schoonmaak-procedures. Tijdens de meting, de interface is computergestuurd met behulp van een afsluiter controle en data-acquisitie software (Surfe 2R software, IonGate Biosciences).
2. Voorbereidingen
In dit hoofdstuk worden de verschillende protocollen voor de voorbereiding van een SSM-based elektrofysiologie experiment worden genoemd.
2.1 Het maken van de lipide oplossing voor de vorming van de SSM
- Meng 25 pl octadecylamine (5 mg / ml in chloroform) en 375 gl Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml in chloroform) in een glas flacon.
- Met een rotatieverdamper en continue stikstofgas, verdampen de chloroformongeveer 30 minuten.
- Verwijder het lipide van de wanden van de glazen flacon door schudden met 500 gl n-decaan. De uiteindelijke lipide concentratie 15 mg / ml met 1:60 (w / w) octadecylamine.
- Breng de oplossing voor de opslag van glas flacon. Bewaar de lipide-oplossing bij -20 ° C.
2.2 Chlorering van de referentie-elektrode
De referentie-elektroden moet gechloreerde met regelmatige tussenpozen door slijtage.
- Verwijder de rest van de oude zilverchloride laag met behulp van fijn schuurpapier voor de chlorering proces.
- Plaats de zilverdraad met een platina elektrode in een 1 M zoutzuuroplossing en chloreren gedurende 15 min bij 0,5 mA. Na het voltooien van chlorering, de zilveren draad verandert de kleur naar een homogene donkergrijs.
2.3 Bereiding van de polyacrylamide gel brug
- Bereid een oplossing die 100 mM KPi bij pH = 7, 100 mM KCl en 6% Acrylamide.
- Voeg 0,3% APS (10% Voorraad) en 0,6% TEMED en binnenkort de oplossing te mengen met een pipet.
- Direct na het mengen van de oplossing, pipetteer 30 ul van het mengsel te injecteren in de lege gel brug container. Het is belangrijk om luchtbellen tijdens de injectie te vermijden.
- Tijdens een incubatietijd van 20 minuten polymeriseren van de gel.
- Na polymerisatie van de gel brug wordt opgeslagen in oplossing (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCl). Om de levensduur van de gel brug verlengen oplossing wordt bewaard bij 4 ° C.
2.4 Voorbereiding van de meting van oplossingen
Door de sterke wisselwerking van de opgeloste stoffen met SSM worden elektrische artefacten gegenereerd wanneer oplossingen van een andere samenstelling worden uitgewisseld. Daarom is de bereiding van de oplossingen is een kritische stap. Neem de volgende voorzorgsmaatregelen tijdens het bereidingsproces oplossing om de oplossing te wisselen artefacten te minimaliseren.
- Maak niet-activeren en het activeren van oplossingen van de ene partij, de pH en ionische sterkte.
- Hoge zout achtergrond helpt om oplossing uitwisseling artefacten te verminderen.
- Verdeel de batch oplossing in twee volumes.
- Voeg de activerende verbinding aan het activerende oplossing. Gebruik compenserende verbinding in de niet-activerende oplossing voor de osmolariteit en ionische sterkte van beide oplossingen zo gelijk mogelijk te houden.
- Indien de oplossingen worden bewaard bij 4 ° C, of alle oplossingen op kamertemperatuur voordat de meting, omdat zelfs kleine temperatuurverschillen artefacten produceren.
3. Een SSM-based Electrofysiologie Experiment
Hier presenteren we een typisch protocol voor een SSM-based elektrofysiologische experiment.
3.1 Voorbereiden van de SSM Setup
Terwijl de SSM Setup is niet in gebruik de buizen worden gevuld met een ethanol 30%/ Wateroplossing om bacteriegroei te voorkomen.
- Spoel het systeem met zuiver water om de ethanol uit de buis te verwijderen voordat het monteren van de cuvette. Vervang de ethanol containers met water containers. Met behulp van hoge druk (0,6-1,0 bar) reinigen van het systeem met 20-30 ml water.
- Herhaal de reinigingsprocedure met een 100 mM KPi buffer bij pH 7,6 of niet-activerende oplossing.
- Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de vloeistof systeem.
3.2 Montage van de cuvet
- Bevestig een o-ring aan de referentie-elektrode
- Neem de gel brug van de opslag-oplossing en sluit de referentie-elektrode.
- Prefill de uitlaatconnector met niet-activerende buffer plaatst een o-ring en sluit de gel brug naar de referentie-elektrode samenstel te voltooien. Pas goed op dat er geen luchtbellen zijn op de kruising van de gel brug en de uitlaat oplossing stromingsroute.
- Assembleert het grootste deel van de cuvette door toevoeging van de veer contactpen (verbinding met de versterker), de inlaatbuis (verbinding naar de terminal klep), de O-ring (afdichting voor de SSM) en schroeven.
- Met behulp van een pincet, neem de sensor chip uit de opslag-oplossing (10 mM octadecanethiol in ethanol).
- Met behulp van een pipet, wassen de resterende oplossing met ca. 5 ml zuiver ethanol.
- Droog de elektrode onder stikstofgas.
- Plaats de sensor chip nauwkeurig op het basisdeel van de cuvet bij de inlaat boring van het grootste deel van de cuvet wordt naar de cirkelvormige actieve gebied van de sensor.
- Voeg 1 ul van de lipide oplossing van het actieve gebied van de sensor chip. Zorg ervoor, dat de goudlaag volledig wordt gedekt door de lipide.
- Onmiddellijk na het toevoegen van de lipide-oplossing, sluit de cuvette door toevoeging van de voorgemonteerde hoofdgedeelte.
- Voor de montage van de cuvet in de kooi van Faraday, er zeker van zijn dat alle oppervlakken volledig droog zijn.
- Connect de versterker naar de lente contact pin en de inlaatbuis naar de terminal klep. Bevestig vervolgens de cuvet met de schroeven in de kooi van Faraday.
- Schroef de uitlaat connector naar de top van de cuvette. Tenslotte sluit de afvoerbuis naar de uitgang connector en het voltage generator om de referentie-elektrode.
- Onmiddellijk na het monteren van de cuvet wassen van het systeem met buffer bij 0,6 bar. Dit leidt tot spontane vorming SSM.
3.3 Het meten van membraan parameters
Om de kwaliteit van de SSM te controleren, zijn capaciteit en geleidbaarheid gemeten met behulp van de functie generator.
- Met behulp van de functie generator, gelden 100 mV gelijkspanning om de geleiding te meten.
- Bereken de geleiding: De huidige verval toont het opladen van het membraan condensator. Nadat de condensator volledig is opgeladen de gemeten huidige opbrengsten het membraan geleiding met behulp van de wet van Ohm. Voor de eenvoud gebruiken we de current 1 seconde nadat de spanning op de geleiding G = I / U. berekenen
- Breng een driehoekige AC spanning van 50 mV piek amplitude en een frequentie van 0,5 Hz tot de capaciteit te meten piek.
- Bereken de capaciteit: De amplitude van de resulterende blokgolf stroom vertegenwoordigt de laadstromen van de condensator. De kapaciteit C is gelijk aan de overgedragen lading Q = IΔt gedeeld door Au = 100 mV. (Au is tweemaal de aangelegde spanning van 50 mV, omdat ik het verschil huidige positieve minus negatieve helling van de driehoekige spanning.)
- Bewaken van de elektrische parameters van het membraan herhaaldelijk elke 10 min. gedurende ca.. 30 tot 40 min, totdat constante waarden worden bereikt. Wassen tussendoor met KPi buffer bij hoge druk in het traject van ongeveer 0,6 tot 1 bar.
- Schat de kwaliteit van de SSM: Optimale parameters in het traject van 0,1 tot 0,2 nS en 2 tot 3,5 nF. Een hoge geleidbaarheid boven 0,8 nS en lage capaciteit van minder dan 1 nF geeftdat de SSM niet correct gevormd. Een hoge capaciteit boven 4 nF kan betekenen dat de actieve zone niet volledig onder de SSM.
- Als de parameters niet in het optimale bereik moet het membraan worden weggegooid en andere SSM onder gebruik van een versbereide elektrode chip.
3.4 Controle voor oplossing uitwisseling artefacten
Nadat het membraan parameters zijn gecontroleerd, dient de meting buffers worden getest oplossing uitwisseling artefacten.
- Plaats de respectievelijke oplossing containers naar de vloeistof systeem.
- Verwijder luchtbellen uit de vloeistof-systeem, met behulp van de handmatige kleppen.
- Met behulp van de data-acquisitie software koos de stroom protocol dat u wilt gebruiken in uw experiment.
- Stel de druk tot 0,6 bar en start de meting.
- Afgezien van de mechanische klep switching artefacten, idealiter geen artefact stromen worden gemeten of ze moeten veel sma wordenller dan het verwachte eiwit transport signalen. Als oplossing uitwisseling artefacten worden waargenomen, proberen om de buffer composities en / of de voorbereidingsprocedure te optimaliseren voordat u verder het experiment.
3.5 Het toevoegen van het eiwit monster
Meestal proteoliposomen of membraan fragmenten worden opgeslagen bij -80 ° C. Voor een meting van een hoeveelheid van ongeveer 30 pl nodig.
- Spoel de SSM met niet-activerende oplossing.
- Ontdooi het eiwit monster op ijs.
- Drie 10-sec sonicatie cycli worden afgewisseld met 10-sec koeling intervallen op ijs. Proteoliposomen worden behandeld met geluidsgolven met een badsonicator. Voor membraanfragmenten een tip sonicator (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode diameter, intensiteit 20%, 0,5 cyclus) wordt gebruikt. Na de laatste sonificeren stap niet terug het monster op het ijs, maar injecteren onmiddellijk in de cuvet.
- Schroef de uitlaat connector samen met de referentie-elektrode assembly.
- Met behulp van een pipet, zuig 30 pi van het eiwit monster en monteer de pipet tip om de uitlaatboring.
- Open de handbediende klep in de niet-activerende pad naar de afvalcontainer en injecteer het proteoliposomen in de cuvet volume. Wees voorzichtig niet te lucht te injecteren in het volume van de meetcel van de sensor.
- Voor het verwijderen van de pipet tip, sluit de handmatige klep om verdere oplossing stromen te voorkomen.
- Laat de proteoliposomen te adsorberen aan de SSM een incubatietijd van 1-2 uur. Het is ook mogelijk om incubeer overnacht.
3.6 Algemene procedure van een SSM-based experiment
- Warm het meten van buffers in de tijd, indien bewaard bij 4 ° C. Alle buffers moeten meten bij kamertemperatuur voordat de meting artefacten te vermijden.
- Bij het wijzigen van oplossingen, verwijder eerst de buizen in de oplossing containers met een niet-fuzzing weefsel, plaats vervolgens de nieuwe flessen.
- Vóór het begin van de meting, gebruikt u de handmatige kleppen om luchtbellen, die zouden zijn ontstaan uit de veranderende procedure te verwijderen.
- Stel de druk net voor het starten van een meting. We routinematig gebruik van een druk van 0,6 bar, die bij onze specifieke afsluiter en buizenconfiguratie levert een debiet van ongeveer 1,0 ml / sec.
- De eerste meting kan worden uitgevoerd direct na elkaar en afwijzing tot de piekstroom constant blijft. Indien de oplossingen verschillen in pH een incubatietijd van ten minste 3 minuten nodig om het inwendige pH van de proteoliposomen passen voordat de meting wordt gestart.
- Nu is de set-up is klaar voor de meting. Om de ruis te verminderen minstens 3 metingen moeten worden gemaakt en gemiddeld.
3.7 Controle Metingen
Een signaal rundown tijdens een reeks metingen kan optreden als gevolg van afbraak van eiwitten of een verlies van adsorptie. Elke SSM experiment moet include een vervallen controle. Dit gebeurt door herhaalde metingen met identieke oplossingen. De minimale verlaging besturingsmiddelen een meting aan het begin en aan het eind van het experiment met dezelfde oplossing.
Wij raden aan om de vervallen controle doen onder omstandigheden waarbij je de hoogste piek amplitude in het experiment verwachten. Dit maakt het gemakkelijker om de verlaging van het signaal kwantificeren.
Het signaal vervallen kan worden gekwantificeerd door vergelijking van de piek amplitudes van de twee vervallen controles. Het verkregen percentage kan worden gebruikt om de gemeten signalen te corrigeren door uitgaande van een lineaire tijdsafhankelijkheid van het vervallen.
3.8 Artifact controles
Indien mogelijk proberen om uw resultaten te valideren door het remmen van het eiwit van belang na het experiment. Overblijvende signalen zijn waarschijnlijk oplossing uitwisseling artefacten. De signalen hebben dan de gemeten artefacten te corrigeren.
- Spoel het systeem met 20-30 ml zuiver water en 20-30 ml 30% ethanol / water. De ethanolische oplossing vermijdt bacteriegroei wanneer het systeem niet gebruikt.
- Na deze reiniging procedure, laat de druk uit het systeem en schakel alle instrumenten.
- Verwijder de cuvette uit de Faraday kooi en het demonteren. Alle onderdelen van de cuvette kan worden gereinigd met water en zuivere ethanol, indien nodig, met behulp van een badsonificeerinrichting.
- Plaats de sensor chip in een glas beker met zuivere ethanol. Sonificeer het bekerglas gedurende 1 tot 2 minuten met een badsonificeerinrichting.
- Droog de sensor chip onder stikstofgas.
- Bewaar de sensor chip uit de buurt van licht in een 10 mM Octadecanthiol oplossing in ethanol. Na een incubatietijd van ongeveer 30 minuten de sensor chip is klaar voor hergebruik.
Representative Results
Tot nu, SSM-based elektrofysiologie werd gebruikt om meer dan 20 vrachtwagens, meestal van prokaryotische oorsprong, bijv. MelB 3, 4 en NhaA PutP 5 (samengevat in 6) karakteriseren. Maar ook eukaryote vervoerders uit intracellulaire membranen, bijv. ClC7 7 evenals ionkanalen, zoals de nicotine acetylcholine receptor 8 zijn onderzocht.
Hier presenteren we als voorbeeld metingen van de suiker / H + cotransporter kanten van Escherichia coli met proteoliposomen met ten minste 85% goede kant gerichte kanten op een LPR van 5 9, 10. Wij richten ons op de belangrijkste stappen die leiden tot een minimale kinetisch model van dit transporteiwit.
1. Elektrofysiologische karakterisatie van wildtype Lacy
De eerste stap is een algemene karakterisering van de reactie door het meten electrogene verschillende pH-waarden (
De pH-afhankelijkheid van Lacy toont twee verschillende elektrogene reacties. Het capacitief gekoppeld huidige stijgingen tussen pH 5 en pH 8.5, maar ook van vorm verandert. Onder alkalische omstandigheden steady state transport wordt waargenomen, terwijl bij zure pH-waarden slechts een snelle elektrogene reactie blijft. Om de steady state signalen te onderscheiden van de snelle elektrogene reacties die we circuit analyse gebruikt om transporter stromen (Figuur 6) te reconstrueren.
Bij pH 7 de monofase-signaal bifasische. Dit geeft ook aan dat er twee verschillende electrogene reacties. Geschat uit de overgedragen lading (integraal van de signalen), de twee reacties hebben ongeveer 6% en 94% van de totale electrogenicity van de transportcyclus.
ove_step ". Toewijzing van de elektrogene reacties> 2De twee electrogene reacties op specifieke stappen in de reactiecyclus Lacy toewijzen werd E325A Lacy variant gemeten (Figuur 7). Deze variant toont alleen lactose uitwisseling, maar deficiënt voor actief transport modes, vanwege de remming van proton release. Het signaal van E325A Lacy staat voor een snel voorbijgaande aard en is constant voor alle gemeten pH-waarden. De vorm en amplitude van het signaal is gelijk aan het signaal van wildtype Lacy onder zure omstandigheden. Verder zien we een kleine negatieve fase na de dalende piekstroom, die kenmerkend is voor een snelle stootspanningen gemeten in capacitief gekoppelde systemen. Omdat lactose bindend en release is niet elektrogene, de snel voorbijgaande moeten correleren met een elektrogene conformationele overgang na lactose bindend.
Het is bekend dat het proton afgifte stap rate limiting voor Lacy omzet in de lactose concentratiegradiënt aangedreven vervoerswijze. In dit geval verwachten we een stijging van het transporttarief met alkalische pH, omdat proton vrijlating wordt begunstigd. Dit is het geval voor de steady state transport gecorreleerd signaal van wildtype Lacy. Bovendien kon worden aangetoond door pH-gradiënt meting die alleen het binnenste pH invloed op de steady state transport van Lacy (niet gepubliceerd). Daarom is de grote electrogene reactie kan worden toegewezen aan de proton afgifte stap.
3. Metingen voor kinetische analyse
Na identificatie van de elektrogene reacties aan en uit vrachtprijzen werden bepaald met behulp van een SSM-instelling met een hoge tijdsresolutie van ongeveer 4,5 msec. Dit is alleen mogelijk onder omstandigheden wanneer een reactie overheerst het signaal. In dit geval de snelheidsconstanten kunnen worden afgeleid uit de transiëntstromen inachtneming van de tijdresolutie van de signalen met behulp van een iteratieve kleinste kwadraten de convolutie algoritme (figuur 8). De bepaalde snelheidsconstanten en de voorgestelde minimale kinetische model (Figuur 9) tenslotte werden gebruikt voor de simulatie van de transporter kinetiek. De gesimuleerde curves reproduceren de SSM data die bovendien bewijst het kinetisch model.
Figuur 1. Adsorptie geometrie van proteoliposomen op de SSM. De SSM is gevormd op een sensor chip, een gestructureerde goud gecoate glasplaatje. Om electrogene reacties van membraaneiwitten te meten worden proteoliposomen of membraan fragmenten geadsorbeerd aan de SSM. De twee membranen een capacitief gekoppelde systeem. Daarom alleen overgangsstromen gedetecteerd.
tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg "/>
Figuur 2. De SSM cuvet voert de sensor chip en de referentie-elektrode. De sensor chip is ingeklemd tussen de kuvet basis en de cuvette hoofd. De referentie-elektrode is geïsoleerd van de stromingsroute door een polyacrylamidegel zoutbrug.
Figuur 3. Fluid Pathway en elektrische circuit van de SSM Setup. In de enkele oplossing uitwisselingsprotocol slechts een niet-activerende (NA) en een activerende (A)-oplossing nodig. Het debiet wordt geregeld door twee 2-weg kleppen (V1) en een terminal ventiel (V2). De terminal ventiel schakelt tussen niet-activerende en activerende oplossingen, regisseren een van de oplossingen voor de cuvette en de andere oplossing om een afvalcontainer (W). De sensor chip (SSM) is aangesloten op de versterker (I / U) terwijl de referentie-elektrode (AgCl) is verbonden met de functiegenerator (F) in de externe elektrische schakeling. Een computer (PC) en een interface box worden gebruikt voor de werking van de afsluiter en data-acquisitie.
Figuur 4. Stootspanningen gemeten met wildtype Lacy proteoliposomen na 100 mM lactose concentratie springt bij verschillende pH-waarden. Het niet-activerende oplossing bevatte 100 mM glucose, terwijl de activerende oplossing bevatte 100 mM lactose. Alle oplossingen werden bereid in 100 mM kaliumfosfaatbuffer bij de aangegeven pH met 1 mM DTT. Voor details van de meetcondities in deze en de volgende figuren wordt verwezen naar 9 en 10.
ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg "/>
Figuur 5. Gemiddelde genormaliseerde Peak stromen gemeten met wild-type Lacy proteoliposomen na lactoseconcentratie sprongen in verschillende concentraties en pH-waarden. De K M waarden worden verkregen van de hyperbolische past.
Figuur 6. Reconstructie van transporter stromingen. De voorbijgaande stromen (A) wordt gebruikt om de transporter stromingen (B) te reconstrueren werden gemeten met een wild-type Lacy proteoliposomen na 100 mM lactoseconcentratie springt bij pH 8.5 (blauw trace) en pH 5.2 (rood trace). Bij pH 8,5 rouleren voortdurend waargenomen terwijl bij pH 5,2 snel electrogene reactie optreedt. Dit wordt duidelijk waargenomen in de gereconstrueerde momentele (B).
files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg "alt =" Figuur 7 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg "/>
Figuur 7. Tijdelijke stroom gemeten met E325A Lacy proteoliposomen na een 100 mM lactoseconcentratie sprong bij pH 5,2. Dit Lacy variant wordt geremd in het proton vrijlating stap van het transport cyclus en dus transport-deficiënte. De kleine negatieve component waargenomen is kenmerkend voor een snelle transiënte stromen gemeten in capacitief gekoppelde systemen en wordt veroorzaakt door de lozing van het membraan capaciteit na een snelle elektrogene reactie. Zijn tijd constante π0 wordt bepaald door de capaciteiten en de geleidingen van het systeem (figuur 1).
Figuur 8. Overgangsstromen gemeten met wild-type Lacy proteoliposomen after verschillende lactoseconcentratie springt bij pH 5.2. Onder deze omstandigheden geen steady state transport wordt waargenomen, maar een elektrogene conformationele overgang op lactose bindend. De stippellijn geeft de overdrachts-functie die de tijdsresolutie van het systeem. De inzet toont de bepaling van de aan en uit snelheidsconstanten van de waargenomen snelheidsconstante k obs met een hyperbolische fit aan de gegevens. De waargenomen snelheidsconstante werd berekend uit de transiëntstromen een iteratieve kleinste-kwadraten deconvolutie-algoritme 10.
Figuur 9. Een kinetisch model voor de reactie cyclus van Lacy. Electrogene twee stappen kunnen worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd door SSM metingen. Een sterk elektrogene reactie neerkomt op ~ 94% van de totale lading verplaatsing in de reactiecyclus wordt alleen waargenomen bij neutrale en basische pH-waarden. Het kan worden toegewezen aan de proton afgifte stap (blauwe pijl). Een zwak elektrogene stap wordt waargenomen bij zure pH bij continue omzet van wild-type Lacy wordt geremd. We toegewezen deze reactie een elektrogene conformationele overgang op lactose binding, die 6% van de totale lading verplaatsing in de reactiecyclus vertegenwoordigt.
Discussion
1. Voordelen SSM-based elektrofysiologie vergelijking met conventionele methoden
SSM-based elektrofysiologie heeft zich bewezen als een waardevol instrument van de elektrofysiologische toolbox. Het is vooral nuttig in gevallen waarin conventie elektrofysiologie, namelijk patch clamp en voltage clamp methodes, niet kunnen worden toegepast: Afgezien van enkele zeldzame uitzonderingen na bacteriële vervoerders niet kan worden onderzocht met behulp van voltage clamp-of patch-clamp methodes vanwege de kleine omvang van bacteriën en omdat ze zijn moeilijk uit te drukken in zoogdiercellen of eicellen. Maar ook fysiologisch relevante zoogdieren vervoerders kan worden onderzocht. In dit geval SSM-based elektrofysiologie is aantrekkelijk voor vervoerders uit intracellulaire membranen en voor screening toepassingen in drug discovery vanwege zijn robuustheid en zijn potentieel voor automatisering.
SSM-basedUsing conventionele elektrofysiologie, tijdopgeloste karakterisering van transporters is uitdagend. Aangezien de omzet van vervoerders is laag een 'gigantische patch' of configuratie van een 'whole cell' is vereist, die een inherent lage tijdsresolutie in een oplossing ruil experiment hebben. De complicatie kan worden overwonnen met behulp van fotolytische substraat release. Slechts een beperkt aantal substraten zijn geschikt voor deze benadering. Hier de snelle uitwisseling oplossing bij de SSM biedt de unieke kans om elektrofysiologische studies uit te voeren met een hoge tijdsresolutie met willekeurige substraten.
2. Beperkingen en kritische stappen
In tegenstelling tot patch clamp en voltage clamp technieken kan SSM-based elektrofysiologie niet worden gebruikt om een mogelijke toepassing. Transporter karakterisering blijft daarom beperkt tot modes die niet afhankelijk zijn van een membraanpotentiaal vervoeren.
In het algemeen SSM-based elektrofysiologie geen beperkingen aan het type (electrogene) transporter. Maar spanning clkan amp of patch clamp methodes voordelen hebben, als intracellulaire componenten zoals bindende eiwitten zijn nodig voor eiwit functionaliteit.
Beperkingen kunnen ontstaan, als oplossing uitwisseling creëert grote artefact stromen. Dit gebeurt wanneer het substraat sterk interageert met de SSM dergelijke in het geval van lipofiele verbindingen. Artefact controles kunnen worden gebruikt om de gemeten signalen te corrigeren. Bovendien hoog zoutgehalte achtergrond meten in alle buffers kunnen worden gebruikt om artefacten te reduceren. Maar in gevallen, waarbij de grootte van het artefact is vergelijkbaar met het eiwit signaal, is het bijna onmogelijk om het eiwit gerelateerde signaal van het artefact te isoleren. Gelukkig hoge artefacten zijn ongebruikelijk in een geoptimaliseerde oplossing uitwisseling.
Er zijn een paar stappen die cruciaal zijn voor de succesvolle realisatie van een SSM-based elektrofysiologie experiment zijn. De bereiding van het eiwit monster is het belangrijkste onderdeel. Als proteoliposomen worden gebruikt, moet u de RECONSlige prostitutie proces levert een schone, reproduceerbaar monster van voldoende LPR en de transporteur is georiënteerd op de juiste wijze. De LPR kan worden gecontroleerd door bevriezing breuk elektronenmicroscopie en oriëntatie door een ELISA experiment als antilichamen beschikbaar.
Gebruik alleen een SSM die optimale parameters toont voor de incubatie van het eiwit monster. De injectie van het eiwit is een belangrijke stap. Sonicatie is essentieel en luchtbellen worden vermeden tijdens de injectie. Na het monster incubatie de metingen zelf zijn van cruciaal belang, omdat luchtbellen de geadsorbeerde eiwit monster van de sensor chip zal verwijderen. Daarom altijd luchtbellen te verwijderen na het veranderen van oplossingen. Toch een signaal vervallen kan optreden. Een mogelijke signaal vervallen corrigeren, is het essentieel om vervallen controles bereiken tijdens het experiment.
3. Gespecialiseerde Systems
De SSM-instelling kan worden aangepast aan de toepassing ervan. Bovendien thier zijn heel anders, zeer gespecialiseerde setups beschikbaar.
Er is de mogelijkheid om eiwitten signalen onder asymmetrische omstandigheden, bijvoorbeeld onder een pH-gradiënt te meten. Voor asymmetrische buffer samenstellingen binnen en buiten de proteoliposomen een derde te kunnen zetten, de rustende oplossing moet komen en dit vereist een configuratie dubbele uitwisseling. Hier extra driewegklep schakelen tussen niet-activerende en rust oplossingen vereist.
Om de tijdsresolutie van het systeem we een andere stromingsmeter weg zonder de terminal klep, maar een ander type van cuvette ontwikkeld verhogen. Hier de kruising van activatie en niet-activerende oplossing ligt binnen het cuvette, 3 mm voor de SSM. Deze opstelling is zeer geschikt voor kinetische analyse van snel transport processen. Het kan worden aangetoond dat een tijdsresolutie zo laag als 2 msec is mogelijk.
Commerciële fully geautomatiseerde systemen zijn beschikbaar die gericht zijn op een aanzienlijk hogere doorvoersnelheid voor drug discovery. Een beweegbare eenheid verzamelt oplossingen en injecteert deze op het sensoroppervlak in 96-well platen in een standaard microtiterplaat formaat.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken J. Garcia-Celma, ik Smirnova en R. Kaback voor bijdragen aan de Lacy metingen en E. Bamberg voor ondersteuning en behulpzaam discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
| Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
| 2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
| Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
| Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
| Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| 100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
| O-rings | Seal Science Inc. | ||
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
| Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
| Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
| Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Amplifier | Keithley | 427 | |
| Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
| USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
| Regeants | |||
| 1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
| Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
| n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
| Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
| Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
| α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 | |
References
- Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
- Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
- Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
- Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
- Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
- Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).
- Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).
