Summary
यहाँ हम electrogenic झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए उसके आवेदन पर ध्यान देने के साथ ठोस समर्थित झिल्ली पर आधारित एक electrophysiological तरीका मौजूद है.
Abstract
हम वर्तमान electrophysiological विधि एक सोने लेपित सेंसर चिप और शीर्ष पर एक phosphatidylcholine monolayer पर chemisorbed एक octadecanethiol परत से बना एक ठोस समर्थित झिल्ली (एसएसएम) पर आधारित है. इस विधानसभा संदर्भ इलेक्ट्रोड, एक क्लोरीनयुक्त चांदी तार युक्त क्युवेट प्रणाली में मुहिम शुरू की है.
झिल्ली टुकड़े या ब्याज की झिल्ली प्रोटीन युक्त proteoliposomes की सोखना के बाद, एक तेजी से समाधान विनिमय झिल्ली प्रोटीन के परिवहन गतिविधि को प्रेरित किया जाता है. एकल समाधान विनिमय प्रोटोकॉल दो समाधान में, एक गैर सक्रिय और एक सक्रिय समाधान की जरूरत है. प्रवाह एक फैराडे पिंजरे के भीतर दबाव हवा और एक वाल्व और ट्यूबिंग प्रणाली द्वारा नियंत्रित किया जाता है.
electrogenic परिवहन गतिविधि के कैनेटीक्स एसएसएम और proteoliposomes या झिल्ली टुकड़े के बीच capacitive युग्मन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है. विधि, इसलिए, केवल transien पैदावारटी धाराओं. मौजूदा शिखर स्थिर परिवहन गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है. समय निर्भर ट्रांसपोर्टर धाराओं सर्किट विश्लेषण से खंगाला जा सकता है.
इस पद्धति का विशेष रूप से पैच दबाना या वोल्टेज दबाना तरीकों से जांच नहीं की जा सकती जो intracellular झिल्ली, से प्रोकार्योटिक ट्रांसपोर्टरों या यूकेरियोटिक ट्रांसपोर्टरों के लिए अनुकूल है.
Introduction
यहाँ हम electrogenic झिल्ली प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए एक ठोस समर्थित झिल्ली (एसएसएम) पर आधारित एक नया electrophysiological दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है.
ठोस समर्थन का एक गिलास स्लाइड, सेंसर चिप पर एक सोने की पतली परत के होते हैं. हाइड्रोफिलिक सोने की सतह एक alcanethiol अभिकर्मक की thiol समूह बाध्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बाद में, selfassembly एक phosphatidylcholine monolyer की एसएसएम के गठन को पूरा करता है.
झिल्ली प्रोटीन की electrogenic प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, proteoliposomes या झिल्ली टुकड़े एसएसएम (चित्रा 1) के लिए adsorbed रहे हैं. झिल्ली और एसएसएम युक्त प्रोटीन तो एक capacitively युग्मित झिल्ली प्रणाली के रूप में. इसलिए, प्रोटीन युक्त झिल्ली पर आरोप स्थानान्तरण एसएसएम के माध्यम से capacitive युग्मन से पता लगाया जा सकता है. यह पद्धति केवल क्षणिक धाराओं पैदावार. मौजूदा शिखर स्थिर परिवहन गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है. समय निर्भर ट्रांसपोर्टर घनrrents सर्किट विश्लेषण से खंगाला जा सकता है.
सेंसर चिप एक क्युवेट प्रणाली (चित्रा 2) में मुहिम शुरू की है. क्युवेट 17 μl के एक बेलनाकार क्युवेट मात्रा है (O-अंगूठी के साथ शुद्ध मात्रा घुड़सवार). एक वसंत संपर्क पिन एम्पलीफायर से संपर्क बनाता है. एक दुकान योजक मुख्य भाग के शीर्ष करने के लिए दबाव डाला और संदर्भ इलेक्ट्रोड, एक क्लोरीनयुक्त चांदी के तार किया जाता है.
क्युवेट एक फैराडे पिंजरे में रखा है. यह एक तेजी से समाधान एक्सचेंज (चित्रा 3) के जवाब में झिल्ली प्रोटीन के परिवहन गतिविधि को प्रेरित किया जाता है जो एक तरल पदार्थ मार्ग से जुड़ा है. एकल समाधान विनिमय प्रोटोकॉल दो समाधान में, एक गैर सक्रिय और एक सक्रिय समाधान की आवश्यकता होती है. प्रवाह एक अंतरफलक बॉक्स पर एक कंप्यूटर या मैनुअल स्विच पर एक वाल्व नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दबाव हवा के द्वारा नियंत्रित किया जाता है.
Protocol
1. एसएसएम आधारित इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए एक तंत्र की स्थापना
विवरण भी योजनाबद्ध चित्र और हमारे cuvettes के फोटो होते हैं और 1, 2 की स्थापना की है, जो हमारे तकनीकी प्रकाशनों में से दो में दिया जाता है. विभिन्न समाधान विनिमय विन्यास और प्रवाह प्रोटोकॉल भी हमारे विधि पेपर 2 में चर्चा कर रहे हैं.
निम्नलिखित में हम कुछ हाल ही में सुधार और वीडियो प्रस्तुति के लिए प्रत्यक्ष प्रासंगिकता के हैं जो तकनीकी जानकारी जोड़ें.
वाल्व नियंत्रण और डाटा अधिग्रहण
इंटरफ़ेस बॉक्स एक वाणिज्यिक USB डिजिटल उत्पादन / एनालॉग इनपुट इंटरफेस (एनआई यूएसबी 6009 नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) और वाल्व ड्राइवरों में शामिल है. यह समाधान के प्रवाह को नियंत्रित करता है और डाटा अधिग्रहण के लिए जिम्मेदार है. वाल्व सामान्य रूप से तेजी से वाल्व 18 तक की वोल्टेज के साथ संचालित वी. वीडियो में हम एक 12 वी बिजली की आपूर्ति का उपयोग किया जा सकता है बदलने के लिए, लेकिन 12 के साथ संचालित वी. रहे हैं. </ P>
वाल्व ड्राइवर सर्किट बोर्ड चार वाल्व काम कर सकते हैं. यह बायोफिज़िक्स के मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट की कार्यशाला द्वारा निर्मित किया गया था. वाल्व सामने पैनल पर स्विच के माध्यम से कंप्यूटर या मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया जा सकता है. उत्तरार्द्ध सफाई प्रक्रियाओं और निस्तब्धता के लिए सुविधाजनक है. माप के दौरान, इंटरफ़ेस बॉक्स एक वाल्व नियंत्रण और डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (surfe 2 आर सॉफ्टवेयर, IonGate बायोसाइंसेज) का उपयोग कंप्यूटर नियंत्रित है.
2. तैयारी
इस खंड में एक एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग की तैयारी के लिए अलग अलग प्रोटोकॉल उल्लेख कर रहे हैं.
2.1 एसएसएम के गठन के लिए लिपिड समाधान बनाना
- 25 μl Octadecylamine (क्लोरोफॉर्म में 5 मिलीग्राम / एमएल) और एक glas शीशी में 375 μl Diphytanoylphosphatidylcholine (क्लोरोफॉर्म में 20 मिलीग्राम / एमएल) मिलाएं.
- एक रोटरी बाष्पीकरण और निरंतर नाइट्रोजन गैस प्रवाह का उपयोग करना, के लिए क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जानाके बारे में 30 मिनट.
- परमाणु decane के 500 μl के साथ झटकों से कांच की शीशी की दीवारों से लिपिड निकालें. अंतिम लिपिड एकाग्रता 1:60 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) octadecylamine साथ 15 मिग्रा / मिली है.
- कांच का भंडारण शीशी का हल स्थानांतरण. -20 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड समाधान स्टोर
संदर्भ इलेक्ट्रोड के 2.2 क्लोरीनीकरण
संदर्भ इलेक्ट्रोड घर्षण की वजह से नियमित अंतराल में क्लोरीनयुक्त किया जाना है.
- क्लोरीनीकरण प्रक्रिया से पहले ठीक sandpaper का उपयोग पुराने silverchloride परत के बाकी निकालें.
- एक 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड के घोल में एक प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के साथ चांदी के तार प्लेस और 0.5 मा से कम 15 मिनट के लिए क्लोरीन मिलाना. क्लोरीनीकरण पूरा करने के बाद, चांदी के तार एक समरूप गहरे भूरे रंग के लिए अपने रंग बदलता है.
Polyacrylamide जेल पुल के 2.3 तैयारी
- 100 मिमी पीएच पर KPI = 7, 100 मिमी KCl और 6 युक्त एक समाधान तैयार% Acrylamid.
- 0.3% ए पी एस (10% शेयर) जोड़ें और 0.6% TEMED और शीघ्र ही एक विंदुक के साथ समाधान मिश्रण.
- तुरंत समाधान मिश्रण के बाद, खाली जेल पुल कंटेनर में मिश्रण के 30 μl इंजेक्षन करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें. यह इंजेक्शन के दौरान हवाई बुलबुले से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
- 20 मिनट की एक ऊष्मायन समय के दौरान जेल polymerizes.
- Polymerization के बाद जेल पुल समाधान (100 मिमी KPI 7 पीएच, 100 मिमी KCl) में संग्रहीत किया जाता है. जेल पुल के जीवन को लम्बा खींच करने के लिए समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है
मापने के समाधान के 2.4 तैयारी
अलग संरचना का समाधान विमर्श कर रहे हैं जब एसएसएम साथ विलेय की मजबूत बातचीत के कारण, बिजली कलाकृतियों उत्पन्न कर रहे हैं. इसलिए, समाधान की तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. समाधान विनिमय कलाकृतियों को कम करने के लिए समाधान तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान निम्न सावधानियाँ बरतें.
- गैर सक्रिय करने और एक बैच से समाधान को सक्रिय करें, पीएच और ईओण ताकत को समायोजित.
- उच्च नमक पृष्ठभूमि समाधान विनिमय कलाकृतियों को कम करने में मदद करता है.
- दो खंडों में बैच समाधान फूट डालो.
- सक्रिय समाधान के लिए सक्रिय यौगिक जोड़ें. संभव के रूप में समान रूप परासारिता और दोनों के समाधान के ईओण ताकत रखने के लिए गैर सक्रिय समाधान में एक प्रतिपूरक यौगिक प्रयोग करें.
- समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है, तो तापमान में भी छोटे मतभेदों कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं क्योंकि सभी समाधान, एक माप शुरू करने से पहले कमरे के तापमान पर पहुंच गया है सुनिश्चित करें.
3. एक एसएसएम आधारित इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग
यहाँ हम एक एसएसएम आधारित electrophysiological प्रयोग के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल उपस्थित थे.
3.1 एसएसएम सेटअप की तैयारी
एसएसएम सेटअप उपयोग में नहीं है जबकि ट्यूब एक 30% इथेनॉल के साथ भर रहे हैं/ पानी के घोल बैक्टीरियल वृद्धि से बचने के लिए.
- क्युवेट बढ़ते पहले ट्यूबिंग से इथेनॉल दूर करने के लिए शुद्ध पानी के साथ सिस्टम को धो लें. पानी के कंटेनर के साथ इथेनॉल कंटेनर बदलें. उच्च दबाव (0.6-1.0 बार) पानी की 20-30 मिलीग्राम के साथ सिस्टम को साफ का उपयोग करना.
- पीएच 7.6 या गैर सक्रिय समाधान में एक 100 मिमी KPI बफर का उपयोग कर सफाई प्रक्रिया दोहराएँ.
- कोई हवाई बुलबुले द्रव प्रणाली में रहना सुनिश्चित करें.
3.2 क्युवेट बढ़ते
- संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए एक O-अंगूठी संलग्न
- भंडारण समाधान से जेल पुल लो और संदर्भ इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
- भरें गैर सक्रिय बफर के साथ दुकान योजक, एक O-अंगूठी डालने और संदर्भ इलेक्ट्रोड विधानसभा पूरा करने के लिए जेल पुल को जोड़ने. कोई हवाई बुलबुले जेल पुल और आउटलेट समाधान प्रवाह मार्ग के जंक्शन पर कर रहे हैं कि विशेष ध्यान रखना.
- Cuve का मुख्य हिस्सा Preassembleवसंत संपर्क पिन (एम्पलीफायर के लिए कनेक्शन), इनलेट ट्यूब (टर्मिनल वाल्व के लिए कनेक्शन), O-अंगूठी (एसएसएम के लिए सील) और शिकंजा जोड़कर टीटीई.
- एक चिमटी का प्रयोग, भंडारण समाधान (इथेनॉल में 10 मिमी octadecanethiol) का सेंसर चिप बाहर ले.
- एक विंदुक का प्रयोग, लगभग साथ शेष समाधान से धो लो. शुद्ध इथेनॉल के 5 मिलीलीटर.
- नाइट्रोजन गैस के तहत इलेक्ट्रोड सूखी.
- इनलेट क्युवेट के मुख्य भाग के बोर इतना है कि क्युवेट के आधार भाग पर सही सेंसर चिप जगह सेंसर के परिपत्र सक्रिय क्षेत्र को निर्देश दिया है.
- सेंसर चिप के क्षेत्र में सक्रिय करने के लिए लिपिड समाधान के 1 μl जोड़ें. सोने की परत पूरी तरह से लिपिड द्वारा कवर किया जाता है, यह सुनिश्चित करें.
- तुरंत लिपिड समाधान जोड़ने के बाद, preassembled मुख्य हिस्सा जोड़कर क्युवेट बंद करें.
- फैराडे पिंजरे में क्युवेट बढ़ते इससे पहले, सभी सतहों पूरी तरह से सूख रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
- कॉनटर्मिनल वाल्व वसंत संपर्क पिन और इनलेट ट्यूब एम्पलीफायर ect. फिर फैराडे पिंजरे के अंदर शिकंजा साथ क्युवेट तय कर लो.
- क्युवेट के शीर्ष करने के लिए दुकान योजक भाड़ में. अंत में आउटलेट कनेक्टर और संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए वोल्टेज जनरेटर में आउटलेट ट्यूब कनेक्ट.
- तुरंत बढ़ते के बाद क्युवेट 0.6 बार में बफर के साथ प्रणाली धोने. यह सहज एसएसएम गठन की ओर जाता है.
3.3 मापने झिल्ली मापदंडों
एसएसएम की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, समाई और प्रवाहकत्त्व समारोह जनरेटर का उपयोग कर मापा जाता है.
- समारोह जनरेटर का प्रयोग, प्रवाहकत्त्व को मापने के लिए 100 एम वी डीसी वोल्टेज लागू होते हैं.
- प्रवाहकत्त्व की गणना: वर्तमान क्षय झिल्ली संधारित्र के चार्ज से पता चलता है. संधारित्र के बाद पूरी तरह से मापा वर्तमान पैदावार ओम कानून का उपयोग कर झिल्ली प्रवाहकत्त्व आरोप लगाया है. सादगी के लिए हम घन उपयोगrrent 1 सेकंड वोल्टेज के बाद प्रवाहकत्त्व जी = मैं / यू गणना करने के लिए लागू किया जाता है
- आयाम और समाई मापने के लिए 0.5 हर्ट्ज की एक आवृत्ति को पीक 50 एम वी चोटी की एक त्रिकोणीय एसी वोल्टेज लागू करें.
- समाई की गणना: परिणामस्वरूप वर्ग तरंग वर्तमान के आयाम संधारित्र के चार्ज धाराओं का प्रतिनिधित्व करता है. समाई सी हस्तांतरित प्रभारी के बराबर है क्यू = ΔU = 100 एम वी द्वारा विभाजित IΔt. (मैं त्रिकोणीय वोल्टेज का अंतर मौजूदा सकारात्मक शून्य से नकारात्मक ढलान है क्योंकि ΔU दो बार 50 एमवी का वोल्टेज लागू है.)
- बार बार झिल्ली के लिए लगभग हर 10 मिनट के बिजली के मानकों की निगरानी करें. स्थिर मूल्यों पर पहुँच जाता है जब तक 30 से 40 मिनट,. 1-0.6 के बारे में पट्टी की सीमा में उच्च दबाव में KPI बफर के साथ बीच में धो लें.
- एसएसएम की गुणवत्ता का अनुमान: इष्टतम मापदंडों 0.1 से 0.2 एन एस और 2-3.5 nF की रेंज में हैं. 1 nF नीचे 0.8 एन एस और कम समाई ऊपर एक उच्च चालकता इंगित करता हैएसएसएम सही से नहीं बना रहा है. 4 nF ऊपर एक उच्च समाई सक्रिय क्षेत्र एसएसएम द्वारा पूरी तरह से शामिल नहीं है कि संकेत हो सकता है.
- मापदंडों इष्टतम रेंज में नहीं हैं, झिल्ली खारिज किया जाना चाहिए और एक अन्य एसएसएम एक नया तैयार इलेक्ट्रोड चिप का उपयोग कर, तैयार.
समाधान विनिमय कलाकृतियों के लिए 3.4 चेकिंग
झिल्ली मापदंडों जाँच किए जाने के बाद, मापने बफ़र्स समाधान विनिमय कलाकृतियों के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए.
- द्रव प्रणाली से संबंधित समाधान कंटेनर डालें.
- मैनुअल वाल्व का उपयोग कर, द्रव प्रणाली से हवाई बुलबुले निकालें.
- डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग आप अपने प्रयोग में उपयोग करना चाहते हैं प्रवाह प्रोटोकॉल चुना है.
- 0.6 पट्टी करने के लिए दबाव को समायोजित करें और माप शुरू.
- इसके अलावा यांत्रिक वाल्व स्विचिंग कलाकृतियों से, आदर्श कोई विरूपण साक्ष्य धाराओं मापा जाना चाहिए या वे बहुत SMA होना चाहिएउम्मीद प्रोटीन परिवहन संकेतों से ller. समाधान विनिमय कलाकृतियों को मनाया जाता है, प्रयोग जारी रखने से पहले बफर रचनाओं और / या तैयार करने की प्रक्रिया का अनुकूलन करने की कोशिश.
3.5 प्रोटीन नमूना जोड़ना
आमतौर पर proteoliposomes या झिल्ली टुकड़े -80 पर जमे हुए जमा हो जाती डिग्री सेल्सियस एक माप के लिए लगभग 30 μl के एक विभाज्य की जरूरत है.
- गैर सक्रिय समाधान के साथ एसएसएम कुल्ला.
- बर्फ पर प्रोटीन नमूना गला लें.
- तीन 10 सेकंड sonication के चक्र बर्फ पर 10 सेकंड ठंडा अंतराल के साथ alternated रहे हैं. Proteoliposomes एक स्नान sonicator का उपयोग कर sonicated रहे हैं. झिल्ली टुकड़े के लिए एक टिप sonicator (50W, 30 किलोहर्ट्ज़, 1 मिमी sonotrode व्यास, तीव्रता 20%, चक्र 0.5) का उपयोग किया जाता है. पिछले sonication के कदम के बाद बर्फ पर वापस नमूना मत डालो, लेकिन क्युवेट में तुरंत यह इंजेक्षन.
- खोल देना आउटलेट संदर्भ इलेक्ट्रोड asse के साथ मिलकर संबंधकmbly.
- एक विंदुक का प्रयोग, प्रोटीन के नमूने के 30 μl महाप्राण और बोर आउटलेट पिपेट टिप माउंट.
- अपशिष्ट कंटेनर को गैर सक्रिय मार्ग में मार्गदर्शन वाल्व खोलने और क्युवेट मात्रा में proteoliposomes इंजेक्षन. संवेदक के साथ क्युवेट मात्रा में हवा इंजेक्षन करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
- पिपेट टिप को हटाने से पहले, आगे समाधान के प्रवाह को रोकने के लिए मैनुअल वाल्व बंद करें.
- Proteoliposomes 1 से 2 घंटे की एक ऊष्मायन समय के लिए एसएसएम को सोखना करने की अनुमति दें. यह रातोंरात सेते भी संभव है.
एक एसएसएम आधारित प्रयोग के 3.6 सामान्य प्रक्रिया
- 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, समय में मापने बफ़र्स वार्म अप सभी मापने बफ़र्स कलाकृतियों से बचने के लिए माप शुरू करने से पहले कमरे के तापमान पर होना है.
- समाधान बदल रहा है, पहले एक गैर fuzzing ऊतक के साथ समाधान कंटेनर के अंदर ट्यूब साफ, फिर नई बोतल डालने.
- माप शुरू करने से पहले, बदलते प्रक्रिया से विकसित किया जा सकता था जो हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए मैन्युअल वाल्व का उपयोग करें.
- सिर्फ एक माप शुरू करने से पहले दबाव को समायोजित करें. हम नियमित रूप से हमारे विशिष्ट वाल्व और ट्यूब पर विन्यास लगभग 1.0 मिलीग्राम / सेकंड की एक प्रवाह दर जो पैदावार 0.6 पट्टी के दबाव का उपयोग करें.
- पहले कुछ माप एक के बाद एक सीधे बाहर किया जा सकता है और मौजूदा शिखर लगातार बना रहता है जब तक अस्वीकार कर दिया जाना चाहिए. समाधान पीएच में मतभेद है तो कम से कम 3 मिनट के एक ऊष्मायन समय मापन शुरू करने से पहले proteoliposomes के भीतर पीएच को समायोजित करने की जरूरत है.
- अब की स्थापना की माप के लिए तैयार है. शोर को कम करने के लिए कम से कम 3 मापन किया और औसतन किया जाना चाहिए.
3.7 नियंत्रण माप
मापन की एक श्रृंखला के दौरान एक संकेत ठहरनेवाला प्रोटीन गिरावट या सोखना का एक नुकसान के कारण हो सकता है. प्रत्येक एसएसएम प्रयोग मैं चाहिएएक ठहरनेवाला नियंत्रण nclude. इस समान समाधान के साथ दोहराया माप से किया जाता है. न्यूनतम ठहरनेवाला नियंत्रण एक ही समाधान का उपयोग कर, एक शुरुआत में माप और प्रयोग के अंत में एक का मतलब है.
हम आप प्रयोग की सबसे ऊंची चोटी आयाम की उम्मीद है, जहां परिस्थितियों में खड़ा होनेवाला नियंत्रण करने के लिए सलाह देते हैं. यह आसान संकेत के ठहरनेवाला यों के लिए बनाता है.
संकेत ठहरनेवाला दो ठहरनेवाला नियंत्रण के शिखर आयाम की तुलना द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. परिणामस्वरूप प्रतिशत मान ठहरनेवाला के एक रेखीय समय निर्भरता संभालने के द्वारा मापा संकेतों को सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
3.8 विरूपण साक्ष्य नियंत्रण
यदि संभव हो तो प्रयोग के बाद ब्याज की बाधा प्रोटीन द्वारा अपने परिणामों को मान्य करने के लिए प्रयास करें. शेष संकेतों शायद समाधान विनिमय कलाकृतियों हैं. संकेत तो मापा कलाकृतियों के लिए सही करने की है.
- शुद्ध पानी की 20-30 मिलीग्राम और 30% इथेनॉल / पानी के 20-30 मिलीलीटर के साथ सिस्टम को धो लें. प्रणाली इस्तेमाल में नहीं है जब ethanolic समाधान बैक्टीरियल वृद्धि से बचा जाता है.
- इस सफाई प्रक्रिया के बाद, सिस्टम से दबाव जारी है और सभी उपकरणों को बंद कर देते हैं.
- फैराडे पिंजरे से क्युवेट निकालें और यह उतरना. क्युवेट के सभी भागों एक स्नान sonicator का उपयोग करके, यदि आवश्यक हो तो, पानी और शुद्ध इथेनॉल के साथ साफ किया जा सकता.
- शुद्ध इथेनॉल के साथ एक GLAS बीकर में सेंसर चिप रखें. एक स्नान sonicator का उपयोग करते हुए 1 से 2 मिनट के लिए बीकर Sonicate.
- नाइट्रोजन गैस के तहत सेंसर चिप सूखी.
- एक 10 मिमी Octadecanthiol ethanolic समाधान में रोशनी से दूर सेंसर चिप की दुकान. के बारे में 30 मिनट की एक ऊष्मायन समय के बाद सेंसर चिप पुनः उपयोग के लिए तैयार है.
Representative Results
अब तक, एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी ज्यादातर प्रोकार्योटिक मूल के 20 से अधिक ट्रांसपोर्टरों, जैसे Melb 3, NhaA 4 और PutP 5 (6 में संक्षेप) चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. लेकिन यह भी intracellular झिल्ली से यूकेरियोटिक ट्रांसपोर्टरों, जैसे ClC7 7 के साथ ही आयन चैनल, निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर 8 जांच की गई है जैसे.
यहाँ हम 5 9 की एक LPR, 10 बजे लैस उन्मुख बाहर कम से कम 85% सही पक्ष के साथ proteoliposomes का उपयोग कर Escherichia कोलाई से लैस चीनी / एच + cotransporter का एक उदाहरण के माप के रूप में प्रस्तुत करते हैं. हम इस परिवहन प्रोटीन की एक न्यूनतम गतिज मॉडल के लिए अग्रणी मुख्य चरण पर ध्यान केंद्रित.
1. Wildtype लैस के electrophysiological लक्षण वर्णन
पहले कदम के लिए अलग पीएच मान को मापने के द्वारा electrogenic प्रतिक्रिया का एक सामान्य लक्षण वर्णन है (
लैस का पीएच निर्भरता दो अलग electrogenic प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. पीएच 5 और 8.5 पीएच, के बीच है लेकिन यह भी capacitively युग्मित वर्तमान बढ़ जाती है इसके आकार बदलता है. अम्लीय पीएच के लिए केवल एक तेजी electrogenic प्रतिक्रिया रहता मूल्यों जबकि क्षारीय शर्तों के तहत स्थिर राज्य परिवहन, मनाया जाता है. हम ट्रांसपोर्टर धाराओं (चित्रा 6) के पुनर्निर्माण के लिए सर्किट विश्लेषण इस्तेमाल किया उपवास electrogenic प्रतिक्रियाओं से स्थिर राज्य संकेत भेद करने के लिए.
पीएच 7 में monophasic संकेत biphasic हो जाता है. यह भी दो अलग electrogenic प्रतिक्रियाओं है कि वहाँ इंगित करता है. हस्तांतरित चार्ज (संकेतों का अभिन्न) से अनुमानित, दो प्रतिक्रियाओं के बारे में 6% और परिवहन चक्र की कुल electrogenicity का 94% है.
electrogenic प्रतिक्रियाओं का ove_step "> 2. असाइनमेंटलैस की प्रतिक्रिया चक्र में विशेष कदम के लिए दो electrogenic प्रतिक्रियाओं असाइन करने के लिए, E325A लैस संस्करण (चित्रा 7) मापा गया था. यह संस्करण केवल लैक्टोज विनिमय पता चलता है, लेकिन क्योंकि प्रोटॉन रिहाई के निषेध की, सभी सक्रिय परिवहन मोड के लिए की कमी है. लैस E325A के संकेत एक तेजी क्षणिक का प्रतिनिधित्व करता है और सभी मापा पीएच मान के लिए स्थिर है. संकेत के आकार और आयाम अम्लीय शर्तों के तहत लैस wildtype का संकेत करने के लिए इसी तरह की है. इसके अलावा हम capacitively युग्मित सिस्टम में मापा तेजी क्षणिक धाराओं के लिए विशेषता है जो गिरावट शिखर वर्तमान, के बाद एक छोटे से नकारात्मक चरण का पालन. लैक्टोज बाध्यकारी और रिहाई electrogenic नहीं है, क्योंकि तेजी क्षणिक लैक्टोज बंधन के बाद एक electrogenic गठनात्मक परिवर्तन के साथ सहसंबंधी चाहिए.
यह प्रोटॉन रिहाई कदम दर limiti है कि जाना जाता हैलैक्टोज एकाग्रता ढाल चालित परिवहन मोड में लैस कारोबार के लिए एनजी. प्रोटॉन रिहाई के पक्ष में है क्योंकि इस मामले में हम, क्षारीय पीएच के साथ परिवहन दर की वृद्धि की उम्मीद है. यह स्थिर राज्य परिवहन लैस wildtype का संकेत सहसंबद्ध के लिए मामला है. इसके अलावा यह केवल आंतरिक पीएच लैस के स्थिर राज्य परिवहन (अप्रकाशित) को प्रभावित करती है कि पीएच ढाल माप द्वारा दिखाया जा सकता है. इसलिए बड़े electrogenic प्रतिक्रिया प्रोटॉन रिहाई के कदम को सौंपा जा सकता है.
3. गतिज विश्लेषण के लिए माप
परिवहन दरों पर और बंद electrogenic प्रतिक्रियाओं की पहचान करने के बाद के बारे में 4.5 मिसे के एक उच्च समय संकल्प के साथ एक एसएसएम सेटअप का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. एक प्रतिक्रिया संकेत हावी जब यह परिस्थितियों में ही संभव है. इस मामले में दर स्थिरांक एक चलने का कम से कम वर्गों डी का उपयोग कर संकेतों के समय संकल्प के विचाराधीन क्षणिक धाराओं से प्राप्त किया जा सकता है कनवल्शनफ़िल्टर्स एल्गोरिथ्म (8 चित्रा). निर्धारित दर स्थिरांक के साथ ही प्रस्तावित न्यूनतम गतिज मॉडल (9 चित्रा) अंत में ट्रांसपोर्टर कैनेटीक्स के अनुकरण के लिए इस्तेमाल किया गया. नकली घटता अतिरिक्त गतिज मॉडल जो साबित करता है एसएसएम डेटा पुन: पेश.
चित्रा 1. एसएसएम पर proteoliposomes की सोखना ज्यामिति. एसएसएम एक सेंसर चिप, एक संरचित सोने लेपित गिलास स्लाइड पर बनाई है. झिल्ली प्रोटीन की electrogenic प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, proteoliposomes या झिल्ली टुकड़े एसएसएम करने adsorbed रहे हैं. दो झिल्ली एक capacitively युग्मित प्रणाली के रूप में. केवल क्षणिक धाराओं पता चला रहे हैं यही कारण है.
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चित्रा 2. एसएसएम क्युवेट सेंसर चिप और संदर्भ इलेक्ट्रोड किया जाता है. सेंसर चिप क्युवेट आधार और क्युवेट सिर के बीच sandwiched है. संदर्भ इलेक्ट्रोड एक polyacrylamide जेल नमक पुल से प्रवाह मार्ग से अलग है.
चित्रा 3. एसएसएम सेटअप के द्रव मार्ग और इलेक्ट्रिकल सर्किट. ही समाधान विनिमय प्रोटोकॉल में केवल एक गैर सक्रिय (एनए) और एक सक्रिय (ए) के समाधान के लिए आवश्यक हैं. प्रवाह दो 2 तरह वाल्व (v1) और एक टर्मिनल वाल्व (v2) द्वारा नियंत्रित किया जाता है. गैर सक्रिय और सक्रिय समाधान के बीच टर्मिनल वाल्व स्विच, क्युवेट और बर्बादी कंटेनर (डब्ल्यू) के लिए अन्य समाधान के समाधान के लिए एक निर्देशन. सेंसर चिप (एसएसएम), एम्पलीफायर (आई / यू) से जुड़ा है संदर्भ इलेक्ट्रोड (AgCl) बाहरी बिजली के सर्किट में समारोह जनरेटर (एफ) से जुड़ा है, जबकि. एक कंप्यूटर (पीसी) और एक अंतरफलक बॉक्स वाल्व आपरेशन और डाटा अधिग्रहण के लिए उपयोग किया जाता है.
4 चित्रा. सक्रिय समाधान 100 मिमी लैक्टोज निहित है, जबकि विभिन्न पीएच मान कम 100 मिमी लैक्टोज एकाग्रता कूदता के बाद जंगली प्रकार लैस proteoliposomes साथ मापा क्षणिक धाराओं. गैर सक्रिय समाधान 100 मिमी ग्लूकोज निहित. सभी समाधान 1 मिमी डीटीटी के साथ संकेत पीएच कम 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर में तैयार किए गए थे. इस में माप की स्थिति की जानकारी के लिए और निम्नलिखित आंकड़े 9 और 10 को देखें.
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चित्रा 5. औसतन सामान्यीकृत पीक धाराओं अलग सांद्रता और पीएच मान कम लैक्टोज एकाग्रता कूदता के बाद जंगली प्रकार लैस proteoliposomes से मापा. कश्मीर एम मूल्यों अतिशयोक्तिपूर्ण फिट बैठता है से प्राप्त कर रहे हैं.
6 चित्रा. ट्रांसपोर्टर धाराओं के पुनर्निर्माण. क्षणिक धाराओं (ए) ट्रांसपोर्टर धाराओं (बी) के फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल पीएच 8.5 (नीला ट्रेस) और पीएच 5.2 (लाल ट्रेस) में 100 मिमी लैक्टोज एकाग्रता कूदता के बाद जंगली प्रकार लैस proteoliposomes साथ मापा गया. पीएच 5.2 पर एक तेज electrogenic प्रतिक्रिया होती है, जबकि पीएच में 8.5 निरंतर कारोबार में मनाया जाता है. यह स्पष्ट रूप से खंगाला वर्तमान (बी) में मनाया जाता है.
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चित्रा 7. क्षणिक मौजूदा 5.2 पीएच में एक 100 मिमी लैक्टोज एकाग्रता कूदने के बाद E325A लैस proteoliposomes से मापा. इस लैस संस्करण परिवहन चक्र के प्रोटॉन रिहाई चरण में हिचकते हैं और इसलिए परिवहन की कमी है. मनाया छोटे नकारात्मक घटक capacitively युग्मित सिस्टम में मापा तेजी क्षणिक धाराओं के लिए विशेषता है और एक तेज electrogenic प्रतिक्रिया के बाद झिल्ली समाई के निर्वहन के कारण होता है. अपने समय के निरंतर π0 प्रणाली (चित्रा 1) के capacitances और conductances द्वारा निर्धारित किया जाता है.
चित्रा 8. जंगली प्रकार लैस proteoliposomes साथ मापा क्षणिक धाराओं afte5.2 पीएच पर आर अलग लैक्टोज एकाग्रता कूदता है. इन शर्तों के तहत कोई स्थिर राज्य परिवहन मनाया, लेकिन लैक्टोज पर एक electrogenic गठनात्मक संक्रमण बाध्यकारी है. धराशायी लाइन प्रणाली के समय संकल्प का प्रतिनिधित्व हस्तांतरण समारोह से पता चलता है. इनसेट डेटा को एक अतिशयोक्तिपूर्ण फिट के साथ मनाया दर लगातार kobs से दर स्थिरांक पर और बंद के दृढ़ संकल्प को दर्शाता है. मनाया दर लगातार एक चलने का कम से कम वर्गों deconvolution एल्गोरिथ्म 10 के साथ क्षणिक धाराओं से निर्धारित किया गया था.
9 चित्रा. लैस. दो electrogenic कदम की प्रतिक्रिया चक्र के लिए एक गतिज मॉडल की पहचान की और एसएसएम माप की विशेषता जा सकता है. प्रतिक्रिया में कुल शुल्क विस्थापन की ~ 94% का प्रतिनिधित्व एक जोरदार electrogenic प्रतिक्रियाचक्र केवल तटस्थ और बुनियादी पीएच मान में मनाया जाता है. यह प्रोटॉन रिहाई कदम (नीले तीर) को सौंपा जा सकता है. जंगली प्रकार लैस की निरंतर कारोबार हिचकते हैं जब एक कमजोर electrogenic कदम अम्लीय पीएच में मनाया जाता है. हम प्रतिक्रिया चक्र में कुल शुल्क विस्थापन का 6% का प्रतिनिधित्व करता है जो लैक्टोज बंधन, पर एक electrogenic गठनात्मक परिवर्तन करने के लिए इस प्रतिक्रिया सौंपा.
Discussion
1. एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लाभ पारंपरिक तरीकों की तुलना
एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी electrophysiological उपकरण बॉक्स के एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में खुद को साबित किया. यह सम्मेलन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, अर्थात् पैच दबाना और वोल्टेज दबाना तरीकों, लागू नहीं किया जा सकता है, जहां के मामलों में विशेष रूप से उपयोगी है: के अलावा कुछ दुर्लभ अपवाद से बैक्टीरियल ट्रांसपोर्टरों क्योंकि बैक्टीरिया के छोटे आकार के और क्योंकि वोल्टेज दबाना या पैच दबाना तरीकों का उपयोग कर जांच की जा नहीं सकते वे स्तनधारी कोशिकाओं या oocytes में व्यक्त करना मुश्किल है. लेकिन यह भी physiologically प्रासंगिक स्तनधारी ट्रांसपोर्टरों की जांच की जा सकती है. इस मामले में एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी intracellular झिल्ली से और क्योंकि इसकी मजबूती और स्वचालन के लिए अपनी क्षमता की दवाओं की खोज में स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए ट्रांसपोर्टरों के लिए आकर्षक है.
Transp का एसएसएम-basedUsing पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, समय हल लक्षण वर्णनorters में चुनौती दे रहा है. ट्रांसपोर्टरों का कारोबार कम है के बाद से एक 'विशाल पैच' या 'एक पूरे सेल' विन्यास की आवश्यकता है, एक समाधान विनिमय प्रयोग में एक स्वाभाविक कम समय संकल्प है जो. जटिलता photolytic सब्सट्रेट रिहाई का उपयोग कर दूर किया जा सकता है. हालांकि, substrates के केवल एक सीमित संख्या में इस दृष्टिकोण के लिए अनुकूल हैं. यहाँ एसएसएम में तेजी से समाधान विनिमय मनमाना substrates का उपयोग एक उच्च समय संकल्प के साथ electrophysiological अध्ययन के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है.
2. सीमाओं और महत्वपूर्ण कदम
पैच दबाना और वोल्टेज दबाना तकनीक के विपरीत, एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक संभावित लागू करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. ट्रांसपोर्टर लक्षण वर्णन इसलिए एक झिल्ली क्षमता पर भरोसा नहीं है जो मोड परिवहन के लिए प्रतिबंधित है.
सामान्य में, एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (electrogenic) ट्रांसपोर्टर के प्रकार के विषय में कोई सीमा नहीं है. लेकिन वोल्टेज सीएलबंधनकारी प्रोटीन की तरह intracellular घटकों प्रोटीन कार्यक्षमता के लिए आवश्यक हैं amp या पैच दबाना तरीकों, लाभ हो सकता है.
समाधान विनिमय बड़े विरूपण साक्ष्य धाराओं बनाता है तो सीमाएं, पैदा कर सकते हैं. सब्सट्रेट lipophilic यौगिकों के मामले में तरह एसएसएम के साथ मजबूती से सूचना का आदान प्रदान जब यह होता है. विरूपण साक्ष्य नियंत्रण मापा संकेतों को सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सभी मापने बफ़र्स में इसके अलावा उच्च नमक पृष्ठभूमि कलाकृतियों को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन मामले में, विरूपण साक्ष्य के आकार प्रोटीन संकेत के बराबर है, जहां यह विरूपण साक्ष्य से प्रोटीन संबंधित संकेत अलग करने के लिए लगभग असंभव है. सौभाग्य से, उच्च कलाकृतियों एक अनुकूलित समाधान विदेशी मुद्रा में असामान्य हैं.
एक एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग के सफल वसूली के लिए महत्वपूर्ण हैं जो कुछ कदम उठाए हैं. प्रोटीन के नमूने की तैयारी सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है. Proteoliposomes इस्तेमाल कर रहे हैं, तो सुनिश्चित हो reconstitution प्रक्रिया एक पर्याप्त LPR के एक स्वच्छ, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नमूना पैदावार और ट्रांसपोर्टर सही तरीके से उन्मुख है. एंटीबॉडी उपलब्ध हैं LPR एक एलिसा प्रयोग से फ्रीज फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और अभिविन्यास द्वारा जाँच की जा सकती.
केवल प्रोटीन नमूना incubating के लिए इष्टतम मापदंडों से पता चलता है जो एक एसएसएम का उपयोग करें. प्रोटीन के इंजेक्शन के एक और महत्वपूर्ण कदम है. Sonication आवश्यक है और हवा के बुलबुले इंजेक्शन के दौरान से बचा जाना चाहिए. हवाई बुलबुले सेंसर चिप से adsorbed के प्रोटीन के नमूने निकाल देंगे क्योंकि नमूना ऊष्मायन के बाद माप ही, महत्वपूर्ण हैं. इसलिए हमेशा समाधान बदलने के बाद हवाई बुलबुले को दूर. फिर भी एक संकेत ठहरनेवाला हो सकता है. एक संभव संकेत ठहरनेवाला ठीक करने के लिए इसे प्रयोग के दौरान ठहरनेवाला नियंत्रण हासिल करने के लिए आवश्यक है.
3. विशेष सिस्टम
एसएसएम-सेटअप अपने आवेदन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा टीयहां उपलब्ध पूरी तरह से अलग, अति विशिष्ट सेटअप के हैं.
एक पीएच ढाल के तहत जैसे विषम परिस्थितियों में प्रोटीन संकेतों को मापने के लिए संभावना नहीं है. एक तिहाई समाधान के अंदर और proteoliposomes बाहर विषम बफर रचनाओं की स्थापना करने के लिए, आराम समाधान, पेश किया जाना है और यह एक डबल विनिमय विन्यास की आवश्यकता है. यहाँ गैर सक्रिय और आराम समाधान के बीच स्विच एक अतिरिक्त तीन तरह वाल्व की आवश्यकता है.
हम टर्मिनल वाल्व की कमी है, लेकिन क्युवेट के एक अलग प्रकार का उपयोग करते हुए एक विकल्प के प्रवाह मार्ग विकसित प्रणाली के समय संकल्प को बढ़ाने के लिए. यहाँ सक्रिय और गैर सक्रिय समाधान के जंक्शन एसएसएम के सामने 3 मिमी, क्युवेट अंदर स्थित है. इस सेटअप में अच्छी तेजी परिवहन प्रक्रियाओं की गतिज विश्लेषण के लिए अनुकूल है. यह 2 मिसे के रूप में कम के रूप में एक समय संकल्प संभव है कि दिखाया जा सकता है.
वाणिज्यिक चully स्वचालित प्रणाली दवा स्क्रीनिंग के लिए एक काफी उच्च throughput पर निशाना उपलब्ध हैं. एक जंगम इकाई समाधान इकट्ठा और एक मानक microtiter प्लेट प्रारूप में 96 अच्छी तरह प्लेटें में संवेदक सतह पर उन्हें इंजेक्शन.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम समर्थन और उपयोगी विचार विमर्श के लिए लैस माप और ई. Bamberg के लिए योगदान के लिए जे गार्सिया-Celma, मैं Smirnova और आर Kaback धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
| Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
| 2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
| Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
| Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
| Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| 100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
| O-rings | Seal Science Inc. | ||
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
| Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
| Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
| Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Amplifier | Keithley | 427 | |
| Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
| USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
| Regeants | |||
| 1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
| Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
| n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
| Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
| Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
| α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 | |
References
- Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
- Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
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- Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
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- Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).
