Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية

Published: January 6, 2013 doi: 10.3791/50231
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1, 2, 1,2, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 2, 10, 3, 1
1Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, 2Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 3Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, 4Labs DC0522, Lilly Corporate Center, 5Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, 6Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 7Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, 8Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, 9Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 10R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

Summary

تسليخ مجهري بالليزر هو الاسلوب الذي يسمح للانتعاش الخلايا المحددة من كميات ضئيلة من حمة. نحن هنا وصف بروتوكول للحصول على الجزر البنكرياسية الإنسان من العينات الجراحية لاستخدامها في الدراسات transcriptomic. لدينا بروتوكول يحسن تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا الإنسان، مما يسهل تحصيلها.

Abstract

تسليخ مجهري ليزر (LMD) هو الاسلوب الذي يسمح للانتعاش الخلايا المحددة والأنسجة من كميات ضئيلة من 1،2 حمة. ويمكن استخدام الخلايا تشريح لمجموعة متنوعة من التحقيقات، مثل الدراسات transcriptomic أو البروتين، وتقييم أو تحليل الحمض النووي الصبغي 2،3. تطبيق الصعبة وخاصة من LMD هو التحليل transcriptome، والتي، نظرا لعطوبية من RNA 4، يمكن أن تكون بارزة بشكل خاص عندما يتم تشريح الخلايا من الأنسجة التي هي غنية من RNases، مثل البنكرياس. بروتوكول تسليخ مجهري التي تمكن تحديد سريع وجمع الخلايا المستهدفة من الضروري في هذا الإطار من أجل اختصار الوقت التعامل مع الأنسجة، وبالتالي، لضمان الحفاظ على RNA.

نحن هنا وصف بروتوكول للحصول على خلايا بيتا في البنكرياس الإنسان من العينات الجراحية لاستخدامها في الدراسات transcriptomic 5. قطع صغيرة من البنكرياس من حوالي 0،5-1 جوقطعت م 3 من هوامش صحية تظهر العينات البنكرياس مقطوعة، جزءا لا يتجزأ من نسيج تك في مجمع OCT، تجميد فورا في المبرد 2-Methylbutane، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تقطيع. وقطعت أربعين أقسام المسلسل من سمك ميكرومتر 10 على ناظم البرد تحت الإعداد -20 درجة مئوية، بشكل فردي لنقل الشرائح الزجاجية، والمجففة داخل ناظم البرد لمدة 1-2 دقيقة، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

مباشرة قبل الإجراء الليزر تسليخ مجهري، تم إصلاحها في أقسام الجليد الباردة، الطازجة الإيثانول 70٪ لمدة 30 ثانية، وغسلها من قبل 5-6 الانخفاضات في الماء المثلج DEPC المعالجة الباردة، والمجففة بواسطة حضانات دقيقة واحدة اثنين في الجليد٪ 100 الباردة ثم الإيثانول من الزيلين (والذي يستخدم لجفاف الأنسجة) لمدة 4 دقائق، ثم كانت المقاطع النسيجية الهواء المجفف بعد ذلك لمدة 3-5 دقيقة. الأهم من ذلك، جميع الخطوات، ما عدا الحضانة في الزيلين، وأجريت باستخدام الكواشف الجليد الباردة - على تعديل أكثر من بروتوكول موضح سابقا 6. التحريرأدى ilization من الكواشف الجليد الباردة في زيادة واضحة في تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا، وتسهيل الاعتراف بها. لتسليخ مجهري، وكانت أربعة أقسام المجففة في كل مرة: وضعت اثنين في أنبوب احباط الملفوفة 50 مل، لحماية الأنسجة من الرطوبة وتبييض، وتم على الفور microdissected المتبقيتين. تم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام أداة MicroBeam PALM (زايس) توظيف الضغط ليزر السيارات القذف (AutoLPC) واسطة. الانتهاء من خلايا بيتا / تشريح جزيرة من أربع cryosections لم تعد مطلوبة من 40-60 دقيقة. تم جمع الخلايا في واحدة AdhesiveCap و lysed مع 10 ميكرولتر العازلة تحلل. تم الحصول على عينة الحمض النووي الريبي كل واحد لتحليل عينات transcriptomic من خلال الجمع بين الخلية 10 microdissected، تليها استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام بيكو الصرفة RNA عزل كيت (السماك الرامح). إن هذا البروتوكول يعزز تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا الإنسان، مما يسهل الاعتراف بها سريعة ودقيقة وجollection. يمكن زيادة تحسين هذا الإجراء تمكين تشريح خلايا بيتا مختلفة ظاهريا، مع الآثار المحتملة لتحسين فهم التغيرات المرتبطة بمرض السكري من النوع 2.

Protocol

1. تجميد الأنسجة البشرية البنكرياس

  1. إزالة الأنسجة الدهنية، والأوعية الدموية والأعصاب والأنسجة غير متني مع مشرط وملاقط، وقطع الأنسجة البنكرياس إلى قطع (~ مكعبات الطول 0،5-1).
  2. ضع قطعة واحدة الأنسجة البنكرياس في وسط Cryomold، وتغطية ذلك تماما مع مجمع الباردة أكتوبر الأنسجة تيك. وضع Cryomold في وعاء أسفل التي تتناول ما قبل المبردة Methylbutane-2 والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل. تخزين العينة المجمدة في درجة مئوية -80

2. إعداد الأبواب المجمدة

  1. ارتداء القفازات في جميع الخطوات لتجنب تمسخ من الحمض النووي الريبي.
  2. تنظيف السكين ناظم البرد، حامل العينات والرسام من البرد الإيثانول بنسبة 100٪ وريبونوكلياز بعيدا. وضع الأنسجة المجمدة داخل ناظم البرد.
  3. انتظر حتى الأنسجة، وفرشاة سكين تصل -20 ° C. تسمية SuperFrost زائد الشرائح وقبل الباردة منهم داخل غرفة ناظم البرد أثناء انتظارلالأنسجة للوصول إلى -20 ° C.
  4. تطبيق الأنسجة تيك مجمع أكتوبر على حامل العينات والأنسجة المجمدة وضع على القمة.
  5. مرة واحدة يتم تجميد الأنسجة مجمع أكتوبر تيك تقليم cryoblock وإزالة أي فائض من الأنسجة تيك مجمع أكتوبر بشفرة حلاقة.
  6. خفض ما مجموعه 40 ميكرومتر شرائح متتالية 10 من البنكرياس كتلة الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك فإننا نوصي قطع شريحة الأولى والمتوسطة ليتم حفظها لمحة عامة عن الرسومات القسم البنكرياس التي يمكن أن تسهل تحديد الجزر داخل شرائح أثناء عملية تسليخ مجهري.
  7. نقل المقاطع من نصل السكين إلى مركز لSuperFrost زائد الشريحة عن طريق لمس المؤخر من الشريحة بإصبعك (مغطاة القفازات) في عملية الاحماء فقط المنطقة التي يجب الالتزام المقطع.
  8. تجفيف دقيقة داخل أقسام 1-2 ناظم البرد في -20 ° C، وبعد ذلك كنت وضعت لهم في صندوق الشرائح وضعت على الثلج الجاف. تخزين المقاطعفي -80 ° C.
  9. إذا لزم الأمر، وتنظيف شفرة سكين مع المناشف الورقية والباردة الإيثانول بنسبة 100٪.

3. جفاف الأقسام مجمدة

  1. إعداد الكواشف: صب 30 مل الطازجة الايثانول 70٪، 30 مل ماء DEPC المعاملة، 2x30 مل الإيثانول بنسبة 100٪ و 30 مل الزيلين إلى 50 مل أنابيب Cellstar (الصقور)؛ البرد والحفاظ على جميع الكواشف (باستثناء الزيلين) على الجليد.
  2. تنظيف مساحة العمل تحت غطاء محرك السيارة مع الإيثانول بنسبة 100٪ وRNaseZAP.
  3. عملية مزدوجة cryosections على النحو التالي: إصلاح في الجليد الباردة الإيثانول 70٪ لمدة 30 ثانية، وغسل الانخفاضات التي لديها 5-6 السريع في الماء المثلج DEPC المعالجة الباردة، يذوى مرتين لمدة 1 دقيقة في الايثانول الجليد الباردة 100٪، احتضان لمدة 4 دقائق في الزيلين في درجة حرارة الغرفة (25 ° C)، والهواء الجاف لمدة 3-5 دقيقة. كرر هذه الخطوة مع زوج آخر من cryosections.
  4. إدراج اثنين cryosections المجففة العودة إلى الوراء في أنبوب 50 مل Cellstar ملفوفة بورق الألومنيوم لحمايتها من الضوء والرطوبة.
<ف الطبقة = "jove_title"> 4. تسليخ مجهري ليزر من خلايا بيتا مع MicroBeam PALM، زايس

  1. تنظيف المجهر مع RNaseZAP وتركيب غطاء لاصق في RoboMover.
  2. تعيين الإعدادات التالية: مجموعة تصفية 09 (الإثارة: 450-490 نانومتر، والانبعاثات> 515 نانومتر)، وضع AutoLPC، 50٪ طاقة الليزر، ليزر التركيز 65٪، 100٪ سرعة الليزر، 5 ميكرومتر المسافة بين الطلقات AutoLPC، 6 عن بعد ميكرومتر إلى خط، والعمل الإرتفاع: -10100.
  3. إدراج شريحة واحدة في المرحلة.
  4. تحديد موقع الخلايا بيتا autofluorescent تحت التصور المجهرية (5X عدسة 10X أو).
  5. التبديل إلى العدسة 40X، حدد الخلايا بيتا باستخدام أداة "حر" واختيار microdissect لهم باستخدام الليزر.
  6. القبض على الأنسجة من أربعة إلى واحد cryosections المجففة AdhesiveCap.
    التعليق 1: الوقت لتشريح خلايا بيتا واحد cryosection المجففة يجب أن لا يكون أطول من 10-20 دقيقة لتجنب الجفاف من المقاطع الأنسجة التي من شأنها أن تؤدي إلىالحمض النووي الريبي التدهور.
    التعليق 2: تحقق من نجاح عملية تسليخ مجهري عن طريق التفتيش البصري بعد انتقاله إلى مرحلة الحاجز.

5. تحلل بيتا من Microdissected خلية الأنسجة اليورانيوم

  1. إزالة AdhesiveCap من RoboMover.
  2. الماصة 10 ميكرولتر العازلة استخراج (XB، PicoPure RNA عزل كيت، السماك الرامح) في غطاء AdhesiveCap واحتضان رأسا على عقب في 42 لمدة 30 دقيقة درجة مئوية.
  3. تدور باستمرار في 10،000 XG ووضع المحللة على الثلج الجاف. تخزينها في -80 ° C حتى يتم تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي.
  4. كرر الخطوات من 3) إلى 5.) مع جميع الأقسام الأخرى.

6. RNA استخراج

  1. الجمع بين جميع TEN 10 ميكرولتر لست]
  2. المضي قدما في عزل الحمض النووي الريبي من خلال العمل في درجة حرارة الغرفة وفقا للبروتوكول من مجموعة PicoPure عزل الحمض النووي الريبي، السماك الرامح، وذلك باستخدام نسبة 1:1 استخراج الاحتياطي (XB) إلى الإيثانول 70٪ (بما في ذلك الدناز العلاج).

7. تحليل الحمض النووي الريبي

  1. استخدم 1 ميكرولتر الحمض النووي الريبي لتحليل نوعية وكمية باستخدام 2100 اجيلنت Bioanalyser (PicoChip). ويتم التقييم الكمي في إشارة إلى معيار RNA تحميل بالتوازي على الرقاقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو مبين في الشكل 1، أدت بروتوكول تعديل التجفيف في تحسين تألق ذاتي خلايا بيتا مقارنة مع السابق بروتوكول نشر 6. تطبيق بروتوكول وصفها، وقد استخدم كل من 39 عينات البنكرياس جراحية لإنتاج 40 cryosections المسلسل لمدة متوسطها 31'544'704 عينة الأنسجة ميكرون / البنكرياس 3 (النطاق: 8'742'390 - 81'522'153 ميكرون 3) كما هو مبين في الجدول 1. هذا يمثل حجم البنكرياس الجزر حوالي 18 ميكرومتر قطرها 150، أو β-من 35،000 الخلايا. النسيج نشأت من متوسط ​​من 38 الجزر المختلفة / عينة البنكرياس (المدى: 19 حتي 80 الجزر)، لوحظ عادة كل منها في قسمين أو أكثر على التوالي. تباين كبير في محصول الجزر بين عينات مختلفة يعكس عدم تجانس الأنسجة مصدر، إما رئيس البنكرياس أو ذيل، فضلا عن التحسين التدريجي لالمشغلين في كشفايون من الجزر في غضون الوقت 10 دقيقة المخصصة لتفتيش كل قسم.

تمت تنقية الحمض النووي الريبي مجموع من كل الأنسجة microdissected و lysed مع مجموعة السماك الرامح مجمدة PicoPure عزل الحمض النووي الريبي من النظم البيولوجية التطبيقية ومزال في 11 ميكرولتر، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك تم تحليل الحمض النووي الريبي 1 ميكرولتر من كل عينة من 2100 Bioanalyser اجيلنت. حصلنا على متوسط ​​RNA نانوغرام / 42 عينة (المدى: 5 حتي 229 نانوغرام / عينة) مع عدد متوسط ​​سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) 5.8 (المدى: 3،4 حتي 7،2). ويبين الشكل 2 مثالا على تحليل الحمض النووي الريبي. أيهما قيمة RIN استخدمت بنجاح تحليل عينات الحمض النووي الريبي جميع الدراسات transcriptomic. لم نجد علاقة مباشرة بين كمية الأنسجة microdissected والعائد RNA. يمكن أن الاختلافات في الفاصل الزمني بين الحصاد من قبل الجراحين وتجميد العينات البنكرياس بعد دراستها من قبل وإطلاق الطبيب الشرعي الاعتبار في ع الفن لنوعية وكمية متغير RNA استردادها. العوامل الرئيسية الأخرى للنظر هي طاقة الليزر لتطبيق تسليخ مجهري، مع انخفاض الطاقة استسلام سلامة أعلى RNA، فضلا عن التركيز الليزر والمسافة من نقطة LPC. يتميز بموقع مثالي على التركيز عندما يمكن رؤية طفيف "الأثر" من الليزر على سطح الزجاج من الشريحة، وتشكيل نقطة صغيرة سوداء. في أيدينا وتحقيق أفضل النتائج مع طاقة الليزر من 50٪، والتركيز الليزر من 65٪، وإن كان تكييفها للتعويض عن الاختلافات في سمك أقسام، وعلى مسافة من نقطة LPC من 5 ميكرون. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون الأمثل كمية RNA عن طريق الحفاظ على ارتفاع RoboMover عمل، أي المسافة بين غطاء لاصق والقسم، وانخفاض وقت ممكن لتجنب فقدان الأنسجة microdissected أثناء عملية الالتقاط. في مجموعة لدينا ما يصل ذروة العمل هو في وحدات -10100 PALM التعسفي.

ليرة لبنانية "> عينة <TD> 30
عدد من الجزر / عينة جمعت حجم الأنسجة / عينة [ميكرومتر 3] RIN تركيز [نانوغرام / ميكرولتر] مجموع RNA [نغ]
DP002 34 24'947'696 5.2 1،149 10،34
DP003 30 41'141'488 5.5 1،677 15،09
DP005 23 27'024'264 3.5 8،259 66،07
DP006 25 45'900'848 3.4 7،399 59،19
DP007 23'936'048 6.5 0،595 4.76
DP008 22 68'248'432 6.2 1،559 14،03
DP010 34 33'156'752 5.6 1،750 19،25
DP011 29 31'339'152 ستة 1،365 15،02
DP012 34 57'594'360 6.3 3،025 33،28
DP017 35 28'212'256 ستة 1،292 14،21
DP030 35 48'007'530 5.6 2،180 23،98
DP013 36 34'371'045 6.9 1،350 14،85
DP014 35 21'360'060 7.2 1،270 13،97
DP015 33 20'923'488 4.1 4،000 44،00
DP019 40 35'431'704 7.0 1،670 18،37
DP025 19 15'329'844 6.6 0،496 5.46
DP034 19 81'522'153 6.4 4،260 46،86
DP039 32 19'074'410 6.5 1،270 13،97
DP040 44 31'565'630 5.4 2،300 25،30
DP042 52 40'333'840 7.0 2،510 27،61
DP021 65 33'996'260 6.3 2،830 31،13
DP023 19 19'513'310 5.6 8،250 90،75
DP024 32 24'125'140 6.3 20،780 228.58
DP038 23 18'306'040 6.6 11،700 128.70
DP045 35 36'345'620 6.3 1،100 12،10
DP033 42 26'078'550 6.5 15،380 169.18
DP022 49 33'535'460 6.8 7،590 83،49
DP041 56 34'899'830 5.7 3،350 36،85
DP049 38 18'521'230 6.8 1،020 11،22
DP028 32 16'410'670 5.6 1،720 18،92
DP056 36 19'737'580 5.7 1،130 12،43
DP059 52 23'376'180 3.6 7،880 86،68
DP047 41 20'658'370 6.4 1،040 11،44
DP036 23 8'742'390 3.5 0،950 10،45
DP027 42 29'150'480 5.1 3،410 37،51
DP046 54 16'800'070 5.3 8،210 90،31
DP055 57 32'340'270 6.2 1،280 14،08
DP064 74 41'896'460 6.5 2،440 26،84
DP067 80 46'388'540 6.3 5،200 57،20
متوسط 38 31'544'704 5.8 3،965 42،14
عدد من الجزر / عينة جمعت حجم الأنسجة / عينة [ميكرومتر 3] RIN مجموع RNA [نغ]
نطاق 19 حتي 80 8'742'390 - 81'522'153 3،4 حتي 7،2 4،76 حتي 228،58
متوسط 38 31'544'704 5.8 42،14

الجدول 1. وترد نظرة عامة على كمية الأنسجة microdissected ونوعية وكمية من الحمض النووي الريبي المستخرج. العينات زمنيا. يتم حساب حجم الأنسجة التي تم جمعها على النحو التالي: سمك cryosection (10 ميكرون) × المنطقة microdissected [ميكرومتر 2]. تم تحليل الحمض النووي الريبي 1 ميكرولتر من كل عينة على Bioanalyser اجيلنت PicoChip 2100.

"الشكل الشكل 1. تألق ذاتي جوهري من خلايا بيتا الإنسان تألق ذاتي من خلايا بيتا بعد جفاف cryosections البنكرياس مع الكواشف التي تم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة إما (A)، أو الجليد الباردة (B) (الإثارة 450 حتي 490 نانومتر، والانبعاثات> 515 نانومتر؛ 400 × التكبير). تظهر خلايا بيتا الأصفر، في حين القنوات البنكرياسية والسفن والكولاجين عرض اللون الأخضر. مقياس بار: 75 ميكرومتر.

الشكل 2
الشكل 2. نوعية وكمية المستخرج جزيرة الشخصي. RNA لعينة الإنسان RNA جزيرة التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول LMD (B) مقارنة على عينة الحمض النووي الريبي مستوى (A). تم تطبيق 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي كل عينة على PicoChip وتحليلها لالكميهذ والجودة مع Bioanalyser 2100 اجيلنت. (A): RIN (RNA عدد النزاهة) 7.7 [الرنا الريباسي نسبة (28S/18S): 1.3)]، (B): 7،2 RIN [الرنا الريباسي نسبة (28S/18S): 1.1)]. كان تركيز RNA جزيرة 1.3 نغ / ميكرولتر، بقيمة إجمالية قدرها 10.3 نانوغرام من 21'360'060 الأنسجة ميكرومتر البنكرياس 3. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفنا نهج يمكن الاعتماد عليها ليزر تسليخ مجهري (LMD) من عينة من الجزر البنكرياسية الإنسان الجراحية. شريطة أن يكون المجهر LMD متاح، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أي مؤسسة بحثية أداء pancreatectomies جزئية، وبالتالي زيادة فرص الحصول على المواد من كلا جزيرة البشرية مواضيع 2 غير السكري ونوع السكري. هذا هو ذات الصلة ولا سيما بالنظر إلى ندرة بنكرياسات المعروضة للجزيرة العزلة. LMD مقارنة الجوانب المواتية للجزيرة إلى العزلة من قبل الهضم كولاجيناز هي الوقت بين انخفاض explantation من النسيج وتجهيز الجزر لاستخراج الحمض النووي الريبي 7، في إثراء خلايا بيتا 7، وكذلك تجنب قاسية التلاعب الميكانيكية والأنزيمية 8، 9،10، والتي يمكن أن تغير التعبير الجيني الشخصي. في حالة مرضى مستأصل البنكرياس جزئيا مزيد من المعلومات السريرية والأيض يتوفر عادة من في حالة الجهازالجهات المانحة. من ناحية أخرى، عزل الجزر من غلة LMD أقل RNA مع قيم أقل RIN مقارنة تلك التي لوحظت بعد الهضم وكولاجيناز لا توفر المعيشة الجزر للدراسات الفنية. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي إلى مرض البنكرياس جراحة تؤثر على التعبير الشخصي جزيرة. وهناك تقييم متوازن لهذه إيجابيات وسلبيات يمكن تحقيقه من خلال دراسات مقارنة عن عدد كبير من العزلة التي تقوم بها جزيرة الهضم كولاجيناز ومختبر الأرصاد الجوية التحريكية سواء من المانحين أو الجهاز المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا، مثل تلك الجارية في الطب مبادرة مبتكرة لمراكز متعددة مرض السكري (IMIDIA) بهدف "وظيفة خلايا بيتا تحسين وتحديد المؤشرات الحيوية التشخيص لرصد العلاج في مرض السكري" ( http://www.imidia.org ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نريد ان نشكر جميع زملائنا الذين قدموا المساعدة والمشورة ومدخلا حاسما في الخطوات المختلفة لهذا المشروع. وأيد إنتاج هذه المادة مع الفيديو الأموال من IMIDIA ( http://www.imidia.org )، وزارة البيئة الألمانية للتعليم والبحث (BMBF) للمركز الألماني لأبحاث مرض السكري (DZD، http://www.dzd ev.de- ) ومستشفى جامعة كارل غوستاف كاروس في جامعة دريسدن التقنية. تلقت العمل مما يؤدي إلى هذا المنشور بدعم من مبادرة مبتكرة التعهد الأدوية المشتركة في إطار اتفاقية المنحة رقم 155005 (IMIDIA)، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) وEFPIA الشركات المساهمة في النوع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).

Tags

الطب، العدد 71، علم وظائف الأعضاء، علم التشريح، الكيمياء الحيوية، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، علم المناعة، الجراحة، داء السكري، من النوع 2، ليزر تسليخ مجهري، تشريح، وخلايا بيتا الإنسان، تألق ذاتي جوهري والبنكرياس واستئصال جزئي والسكري من النوع 2، والدراسات transcriptomic ، RNA التحليل، جزيرة
تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt,… More

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter