Summary
Лазерная микродиссекции является метод, который позволяет восстановление выделенных ячеек незначительное количество паренхимы. Здесь мы опишем протокол для приобретения человеческих панкреатических островков из операционного материала, который будет использоваться для транскриптомных исследований. Наш протокол улучшает внутреннее аутофлюоресценции человека бета-клетки, способствуя тем самым их коллекции.
Protocol
1. Замораживание человеческих тканей поджелудочной железы
- Удалить жировой ткани, кровеносные сосуды, нервы и не паренхиматозной ткани с помощью скальпеля и пинцета, и сократить ткани поджелудочной железы на куски (~ 0.5-1 кубов см).
- Поместите один кусок ткани поджелудочной железы в центре Cryomold, и покроют его полностью с холодным Tissue-Tek соединение октября Положить Cryomold в банку, дно которой покрыто предварительно охлажденный 2-метилбутан и оснастки замораживание в жидком азоте. Хранить замороженные образцы при -80 ° C.
2. Подготовка замороженных срезов
- Надевайте перчатки во все меры, чтобы избежать денатурации РНК.
- Очистите криостата нож, держатель образца и кисть с холодными 100% этанола и РНКазы в гостях. Поместите замороженные ткани внутри криостата.
- Подождите, пока ткань, нож и щеточка достигают -20 ° C. Этикетка SuperFrost Plus слайдов и предварительно охладить их внутри криостата камере в ожиданиидля тканей достичь -20 ° C.
- Применить Tissue-Tek октября Соединение на держатель образца и поместить замороженной ткани на вершине.
- После того, Tissue-Tek октября Соединение заморожен обрезать cryoblock и удалите излишки Tissue-Tek соединение октября с лезвием бритвы.
- Вырезать в общей сложности 40 последовательных 10 мкм кусочки от блока ткани поджелудочной железы. Кроме того, мы рекомендуем резки начального и среднего среза должны быть сохранены для обзора рисунков поджелудочной железы раздел, который может способствовать выявлению островки в пределах ломтики во время микродиссекции процесса.
- Передача секций от лезвия ножа в центре SuperFrost Plus слайдов, нажав на обратной стороне слайда пальцем (покрытые перчатки), чтобы разогреться только региона, к которому разделе будем придерживаться.
- Высушите разделах 1-2 мин внутри криостата при температуре -20 ° C, после чего положить их в коробку слайдов размещены на сухом льду. Хранить разделахпри -80 ° C.
- Если необходимо, протрите лезвие ножа с бумажными полотенцами и холодным 100% этанола.
3. Обезвоживание замороженных срезов
- Подготовка реагентов: налить 30 мл свежеприготовленного 70% этанола, 30 мл DEPC обработанной воды, 2x30 мл 100% этанола и 30 мл ксилола в 50 мл пробирки Cellstar (Соколов); холод и держать все реагенты (за исключением ксилола) на льду.
- Очистите рабочее пространство под капотом со 100% этанола и RNaseZAP.
- Процесс две cryosections следующим образом: закрепить в ледяной 70% этанола в течение 30 сек, промыть 5-6 быстрых провалов в ледяную DEPC обработанной воды, обезвоживают в два раза в течение 1 мин в ледяной 100% этанола, инкубировать в течение 4 мин в ксилоле при комнатной температуре (25 ° C), и сухой воздух в течение 3-5 мин. Повторите этот шаг с другой парой cryosections.
- Вставьте две сушеные cryosections спина к спине в 50 мл Cellstar трубка обернута алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света и влаги.
- Очистите микроскоп с RNaseZAP и смонтировать клей Cap в RoboMover.
- Установить следующие параметры: набор фильтров 09 (возбуждение: 450-490 нм, эмиссия> 515 нм), AutoLPC режиме, 50% лазерной энергии, 65% лазерного фокуса, 100% лазерная скорости, 5 мкм, расстояние между AutoLPC выстрелов, 6 мкм расстоянии к линии, рабочая высота: -10100.
- Вставьте один слайд на сцене.
- Найдите аутофлуоресцентной бета-клетки под микроскопом визуализации (5x или 10x объектив).
- Переключитесь на 40x объектив, выберите бета-клеток с "Freehand" Выбор инструмента и microdissect их с помощью лазера.
- Захват ткани из четырех обезвоженной cryosections в одном AdhesiveCap.
Комментарий 1: время, чтобы рассекать бета-клеток одного обезвоженной cryosection не должна быть больше, чем 10-20 минут, чтобы избежать регидратации срезов тканей, которое может привести вДеградации РНК.
Комментарий 2: проверить успешность процесса микродиссекции путем визуального осмотра после переезда на сцену, чтобы контрольно-пропускной пункт.
5. Лизис микродиссекции Beta Ткань сотовый Обогащенный
- Снимите AdhesiveCap от RoboMover.
- Внесите 10 мкл буфера для экстракции (ВБ, PicoPure выделения РНК Kit, Arcturus) в крышку AdhesiveCap и инкубировать ее вверх дном при 42 ° С в течение 30 мин.
- Спином вниз на 10000 XG и поставить лизат на сухом льду. Хранить при температуре -80 ° C до выделения РНК выполняют.
- Повторите шаги 3.) До 5.) Со всеми другими разделами.
6. Экстракция РНК
- Смешайте все десять 10 мкл лизатов
- Приступить к изоляции РНК, работая при комнатной температуре в соответствии с протоколом PicoPure выделения РНК Kit, Арктур, используя Добыча соотношении 1:1 Buffer (ВБ) до 70% этанола (в том числе лечение ДНКазой).
7. Анализ РНК
- Используйте 1 мкл РНК для анализа качества и количества использованием Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). Количественная оценка делается по отношению к стандартным РНК загружается параллельно на чипе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 1, модифицированный протокол обезвоживания привели к улучшению бета автофлуоресценции клеток по сравнению с предыдущим опубликован протокол 6. Применение описанного протокола, каждый из 39 хирургических образцах поджелудочной железы был использован для создания 40 последовательных cryosections в среднем 31'544'704 мкм 3 ткани / поджелудочной железы образца (диапазон: 8'742'390 - 81'522'153 мкм 3) Как показано в таблице 1. Это представляет собой объем около 18 панкреатических островков 150 мкм в диаметре, или в 35000 β-клеток. Ткани возник в среднем от 38 различных островках / поджелудочной железы образца (диапазон: 19 - 80 островков), каждый из которых обычно наблюдается в двух или более последовательных секций. Большая изменчивость урожайности островки среди различных образцов отражает неоднородность ткани источника, либо головки поджелудочной железы или хвоста, а также постепенное улучшение операторов в обнаруживатьионный островков в течение 10 мин времени, затрачиваемого на проверку каждого раздела.
Всего РНК из каждого микродиссекции и лизису ткани очищают с Арктура PicoPure Frozen РНК изоляции Комплект Applied Biosystems и элюировали в 11 мкл, в соответствии с протоколом производителя. Впоследствии 1 мкл РНК каждого образца анализировали с помощью Agilent 2100 Bioanalyser. Мы получили в среднем 42 нг РНК / образца (диапазон: 5 - 229 нг / образца) со средним целостность РНК номер (РИН) от 5,8 (диапазон: 3,4 - 7,2). Рисунке 2 показан пример анализа РНК. Какой бы значения RIN всех проанализированных образцов РНК были успешно использованы для транскриптомных исследований. Мы не нашли прямой связи между количеством микродиссекции тканей и выход РНК. Различия в промежуток времени между уборке хирургов и замораживание поджелудочной железы образцов после его рассмотрения и освобождение от патологоанатом может составить в р Искусство для переменного количества и качества восстановленных РНК. Другие ключевые факторы, чтобы рассмотреть лазерная энергия применяется для микродиссекции, с меньшей энергией получая высшее РНК целостности, а также лазерный фокус и расстояние LPC пунктов. В центре внимания идеально расположен, когда небольшое "воздействие" лазера на поверхности стекла слайд, образуя маленькую черную точку, можно увидеть. В наших руках лучшие результаты достигаются при использовании лазерной энергии на 50%, лазерный фокус на 65%, хотя и адаптированы для компенсации разницы в толщине секций, а расстояние LPC пункта 5 мкм. Кроме того, количество РНК может быть оптимизирована за счет поддержания рабочей высоты RoboMover, т. е. расстояние между клеем крышку и раздела, как можно ниже, чтобы избежать потери микродиссекции ткани во время процесса захвата. В нашем создана рабочая высота при -10 100 условных единиц PALM.
Количество островков / образца | Объем собранной ткани / образца [мкм 3] | RIN | Концентрация [нг / мкл] | общей РНК [нг] | |
DP002 | 34 | 24'947'696 | 5,2 | 1,149 | 10,34 |
DP003 | 30 | 41'141'488 | 5,5 | 1,677 | 15,09 |
DP005 | 23 | 27'024'264 | 3,5 | 8,259 | 66,07 |
DP006 | 25 | 45'900'848 | 3,4 | 7,399 | 59,19 |
DP007 | <TD> 3023'936'048 | 6,5 | 0,595 | 4,76 | |
DP008 | 22 | 68'248'432 | 6,2 | 1,559 | 14,03 |
DP010 | 34 | 33'156'752 | 5,6 | 1,750 | 19,25 |
DP011 | 29 | 31'339'152 | 6,0 | 1,365 | 15,02 |
DP012 | 34 | 57'594'360 | 6,3 | 3,025 | 33,28 |
DP017 | 35 | 28'212'256 | 6,0 | 1,292 | 14,21 |
DP030 | 35 | 48'007'530 | 5,6 | 2,180 | 23,98 |
DP013 | 36 | 34'371'045 | 6,9 | 1,350 | 14,85 |
DP014 | 35 | 21'360'060 | 7,2 | 1,270 | 13,97 |
DP015 | 33 | 20'923'488 | 4,1 | 4,000 | 44,00 |
DP019 | 40 | 35'431'704 | 7,0 | 1,670 | 18,37 |
DP025 | 19 | 15'329'844 | 6,6 | 0,496 | 5,46 |
DP034 | 19 | 81'522'153 | 6,4 | 4,260 | 46,86 |
DP039 | 32 | 19'074'410 | 6,5 | 1,270 | 13,97 |
DP040 | 44 | 31'565'630 | 5,4 | 2,300 | 25,30 |
DP042 | 52 | 40'333'840 | 7,0 | 2,510 | 27,61|
DP021 | 65 | 33'996'260 | 6,3 | 2,830 | 31,13 |
DP023 | 19 | 19'513'310 | 5,6 | 8,250 | 90,75 |
DP024 | 32 | 24'125'140 | 6,3 | 20,780 | 228,58 |
DP038 | 23 | 18'306'040 | 6,6 | 11,700 | 128,70 |
DP045 | 35 | 36'345'620 | 6,3 | 1,100 | 12,10 |
DP033 | 42 | 26'078'550 | 6,5 | 15,380 | 169,18 |
DP022 | 49 | 33'535'460 | 6,8 | 7,590 | 83,49 |
DP041 | 56 | 34'899'830 | 5,7 | 3,350 | 36,85 |
DP049 | 38 | 18'521'230 | 6,8 | 1,020 | 11,22 |
DP028 | 32 | 16'410'670 | 5,6 | 1,720 | 18,92 |
DP056 | 36 | 19'737'580 | 5,7 | 1,130 | 12,43 |
DP059 | 52 | 23'376'180 | 3,6 | 7,880 | 86,68 |
DP047 | 41 | 20'658'370 | 6,4 | 1,040 | 11,44 |
DP036 | 23 | 8'742'390 | 3,5 | 0,950 | 10,45 |
DP027 | 42 | 29'150'480 | 5,1 | 3,410 | 37,51 |
DP046 | 54 | 16'800'070 | 5,3 | 8,210 | 90,31 |
DP055 | 57 | 32'340'270 | 6,2 | 1,280 | 14,08 |
DP064 | 74 | 41'896'460 | 6,5 | 2,440 | 26,84 |
DP067 | 80 | 46'388'540 | 6,3 | 5,200 | 57,20 |
средний | 38 | 31'544'704 | 5,8 | 3,965 | 42,14 |
Количество островков / образца | Объем собранной ткани / образца [мкм 3] | RIN | общей РНК [нг] | ||
диапазон | 19 - 80 | 8'742'390 - 81'522'153 | 3,4 - 7,2 | 4,76 - 228,58 | |
средний | 38 | 31'544'704 | 5,8 | 42,14 |
Таблица 1. Обзор количество микродиссекции ткани и качество и количество добываемой РНК. Образцов перечислены в хронологическом порядке. Собранные ткани объем рассчитывается следующим образом: толщина cryosection (10 мкм) х микродиссекции области [мкм 2]. 1 мкл РНК каждый образец был проанализирован на Agilent 2100 Bioanalyser PicoChip.
Рисунок 1. Внутренняя аутофлюоресценции человека бета-клетки аутофлуоресцентной бета-клеток после обезвоживания поджелудочной железы cryosections с реагентами, которые были либо храниться при комнатной температуре (A), или ледяного (B) (возбуждение 450 - 490 нм, эмиссия> 515 нм;. 400 х увеличение). Бета клетки появляются желтые, в то время как протоках поджелудочной железы, сосуды и коллаген отображения зеленый цвет. Шкала бар: 75 мкм.
Рисунок 2. Качество и количество добываемого островок РНК. Профиль человека островок РНК образца, полученного с этим LMD протокола (B) по сравнению со стандартным образцом РНК (A). 1 мкл РНК каждого образца наносят на PicoChip и анализировали на quantitу и качества с Agilent 2100 Bioanalyser. (A): RIN (РНК целостность числа) 7,7 [рРНК Ratio (28S/18S): 1,3)]; (B): RIN 7.2 [рРНК Ratio (28S/18S): 1,1)]. Концентрация островок РНК составляет 1,3 нг / мл, на общую сумму в 10,3 нг от 21'360'060 мкм 3 ткани поджелудочной железы. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем надежный подход для лазерных микродиссекции (LMD) человеческих островков от хирургического образца поджелудочной железы. При условии, что LMD микроскопа доступно, эта процедура может быть реализована в любой научно-исследовательского учреждения выполнения частичного pancreatectomies, тем самым увеличивая доступ к человеческому материалу островок из обоих, не страдающих диабетом и сахарным диабетом 2 типа субъектов. Это особенно актуально, учитывая недостаток pancreata предлагаемых для островок изоляции. Благоприятные аспекты LMD по сравнению с островком изоляции коллагеназы пищеварения являются сокращение времени между эксплантации тканей и обработки островки для выделения РНК 7, обогащение бета-клеток 7, а также во избежание жесткой механической и ферментативной манипуляций 8, 9,10, которая может изменить профиль экспрессии генов. В случае частичного pancreatectomized пациентов более клинических и метаболических информации, как правило, доступны, чем в случае органдонорами. С другой стороны, изоляция из островков от LMD дает меньше РНК с более низкими значениями RIN по сравнению с теми наблюдается после коллагеназы пищеварению и не дает жизни островки для функциональных исследований. Кроме того, заболевания поджелудочной железы, ведущие к операции может повлиять на островке профиль экспрессии. Сбалансированная оценка этих плюсов и минусов будет достижимо с помощью сравнительного исследования большого количества островков изоляции осуществляется коллагеназы пищеварения и LMD либо из доноров органов или частично pancreatectomized пациентов, таких как текущие в многоцентровых Инновационные инициативы медицины для Диабет (IMIDIA) с целью «улучшения бета-клеток и определение диагностических биомаркеров для контроля лечения при сахарном диабете" ( http://www.imidia.org ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить всех наших коллег, которые предоставили помощь, советы и критические входа на различных этапах этого проекта. Производство этого видео статьи была поддержана за счет средств IMIDIA ( http://www.imidia.org ), немецкого министерства образования и научных исследований (BMBF) к немецким центром исследований диабета (DZD, http://www.dzd -ev.de ) и Университетской больницы Карл Густав Карус в Технологическом университете Дрездена. Работы, ведущей к данной публикации получило поддержку со стороны Инновационные инициативы лекарственных средств совместного проекта по гранту соглашения N ° 155005 (IMIDIA), ресурсы которого состоят из финансового вклада Седьмой рамочной Европейского Союза, Программы (FP7/2007-2013) и EFPIA компаний в натуральном выражении.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
Dry ice | |||
Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
Liquid nitrogen | |||
Paint brush | |||
PALM MicroBeam | ZEISS | ||
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22x22 mm, depth 21 mm |
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
Plastic clamp | |||
Razor | |||
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
Tweezers | BRAUN | BD168R | |
Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).