Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Published: January 6, 2013 doi: 10.3791/50231
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1, 2, 1,2, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 2, 10, 3, 1
1Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, 2Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 3Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, 4Labs DC0522, Lilly Corporate Center, 5Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, 6Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 7Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, 8Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, 9Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 10R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

Summary

microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.

Abstract

microdissection הליזר (LMD) הוא טכניקה המאפשרת ההתאוששות של תאים ורקמות שנבחרו מכמויות זעירות של parenchyma 1,2. התאים הגזורים יכולים לשמש למגוון רחב של חקירות, כגון מחקרי transcriptomic או proteomic, הערכה או ניתוח דנ"א הכרומוזומלי 2,3. יישום מאתגר במיוחד של LMD הוא ניתוח transcriptome, אשר, בשל הרפיפות של רנ"א 4, יכול להיות בולט במיוחד כאשר תאים גזורים מרקמות עשירות של RNases, כגון לבלב. פרוטוקול microdissection שמאפשר זיהוי ואיסוף מהיר של תאי היעד חיוני בהגדרה זו כדי לקצר את זמן הטיפול ברקמות וכתוצאה מכך, על מנת להבטיח שימור RNA.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת תאים בטאו בלבלב אנושי מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic 5. חתיכות קטנות של לבלב של ג כ 0.5-13 מ 'נחתכו מהשולים הבריאים המופיעים בדגימות לבלב resected, המשובצים ברקמות-Tek מתחם אוקטובר, הקפואים מייד ב2-Methylbutane מצונן, ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שחתך. ארבעים קטעים סידוריים של עובי מיקרומטר 10 נחתכו בcryostat תחת -20 ° C הגדרה, הועברו באופן פרטני לשקופיות זכוכית, התייבשו בתוך cryostat ל1-2 דקות, ומאוחסנים ב-80 ° C.

מייד לפני הליך microdissection הליזר, סעיפים תוקנו בקר כקרח, מוכן טרי אתנול 70% למשך 30 שניות, נשטפו על ידי 5-6 מטבלים במים קרים כקרח DEPC טופלו, ומיובש על ידי שתי incubations של דקה אחת ב100% קרים כקרח אתנול ואחריו קסילן (המשמש להתייבשות רקמות) עבור 4 דקות; חלקי רקמה היו אז אוויר יבשים לאחר מכן במשך 3-5 דקות. חשוב לציין, בכל הצעדים, למעט הדגירה בקסילן, בוצעו באמצעות ריאגנטים קרים כקרח - שינוי מעל 6 פרוטוקול שתואר לעיל. Utilization של ריאגנטים קרח קרים ביאה לעלייה בולטת של autofluorescence הפנימית של תאים בטאו, ואפשר זיהוי שלהם. לmicrodissection, ארבעה חלקים היו מיובשים בכל פעם: שתיים להציב לתוך צינור עטוף בנייר האלומיניום 50 מ"ל, כדי להגן על הרקמות מפני רטיבות והלבנה; 2 נותרי microdissected באופן מיידי. הליך זה בוצע באמצעות מכשיר PALM Microbeam (Zeiss) העסקת לחץ הליזר האוטומטי catapulting מצב (AutoLPC). ההשלמה של תאי הבטא / נתיחת איון מהארבעה cryosections נדרש לא יותר מ40-60 דקות. תאים נאספו לAdhesiveCap אחד וlysed עם חיץ תמוגה 10 μl. כל דגימת RNA בודדה עבור ניתוח transcriptomic הושגה על ידי שילוב של 10 דגימות תאים microdissected, ואחרי מיצוי RNA באמצעות פיקו הטהור רנ"א בידוד הקיט (ארקטורוס). פרוטוקול זה משפר autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל ההכרה וג המהיר והמדויקת שלהםollection. שיפור נוסף של הליך זה יכול לאפשר נתיחה של תאי הביתא phenotypically שונים, עם השלכות אפשריות להבנה טובה יותר של שינויים הקשורים בסוכרת מהסוג 2.

Protocol

1. הקפאת רקמת לבלב אנושית

  1. הסרת רקמת שומן, כלי דם, עצבים ורקמות שאינן parenchymal עם איזמל ופינצטה, ולחתוך את רקמת הלבלב לחתיכות (~ 0.5-1 קוביות סנטימטר).
  2. הנח חתיכת רקמת לבלב אחד במרכז Cryomold, ומכסה אותו לחלוטין עם מתחם קר רקמות-Tek אוקטובר שים Cryomold לתוך צנצנת שתחתיתו מכוסית ב2-Methylbutane מראש מקוררים ונצמדת הקפאה בחנקן נוזלי. אחסן מדגם הקפוא ב-80 ° C.

2. הכנת סעיפים קפואים

  1. תלבש כפפות לאורך כל הצעדים כדי למנוע denaturation של רנ"א.
  2. נקה את סכין cryostat, בעל דגימה ומכחול עם אתנול קר 100% וRNase Away. הנח את הרקמה קפואה בתוך cryostat.
  3. חכה עד הרקמות, הסכין והמברשת להגיע -20 ° C. תייג SuperFrost פלוס שקופיות ומראש להתקרר בתוך חדר cryostat בזמן ההמתנהלרקמה להגיע -20 ° C.
  4. החל מתחם רקמות-Tek אוקטובר על בעל הדגימה ולמקם את הרקמה קפואה על העליונה.
  5. ברגע שמתחם אוקטובר רקמות-Tek הקפוא לקצץ cryoblock ולהסיר כל עודף של רקמות Tek מתחם אוקטובר בסכין גילוח.
  6. חותך כולל של 40 10 פרוסות מיקרומטר רצופות מגוש רקמת הלבלב. בנוסף אנו ממליצים לחתוך פרוסה ראשונה ואמצע ונשמר לציורי סקירה של סעיף הלבלב שיכול להקל על זיהוי של איונים בתוך הפרוסות במהלך תהליך microdissection.
  7. העברת החלקים מלהב הסכין למרכז SuperFrost פלוס שקופית על ידי נגיעת הישבן של השקופית עם האצבע (מכוסה בכפפה) להתחמם רק באזור שאליו הסעיף, לדבוק.
  8. ייבש את סעיפי 1-2 דקות בתוך cryostat ב -20 ° C, אחרי שאתה מכניס אותם לשקופית תיבה מונחת על קרח יבש. אחסן את הסעיפיםב-80 ° C.
  9. אם יש צורך, מנקה את להב הסכין עם נייר סופג ו100% אתנול קר.

3. התייבשות של מדורים קפואים

  1. הכן את ריאגנטים: לשפוך 30 אתנול מוכן טרי 70%, מי 30 מ"ל DEPC טופל, 100% אתנול 2x30 מ"ל וקסילן 30 מ"ל לתוך צינורות 50 מ"ל Cellstar (פלקונס) מ"ל; צינה ולשמור את כל החומרים כימיים (מלבד קסילן) על קרח.
  2. נקה את מקום העבודה מתחת למכסת המנוע עם 100% אתנול וRNaseZAP.
  3. 2 cryosections התהליך כדלקמן: לתקן באתנול 70% קרים כקרח למשך 30 שניות, לשטוף עם 5-6 מטבלים מהירים במים קרים כקרח DEPC טופלו, מייבש פעמים לדקות 1 באתנול 100% הקרח קר, דגירה במשך 4 דקות בקסילן בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס), ואוויר יבש במשך 3-5 דקות. חזור על שלב זה עם עוד זוג cryosections.
  4. הוסף שתי cryosections מיובש גב אל גב לתוך צינור 50 מיליליטר Cellstar העטוף בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור ולחות.
<כיתת p = "jove_title"> 4. Microdissection ליזר של תאי ביתא עם PALM Microbeam, Zeiss

  1. נקה מיקרוסקופ עם RNaseZAP ולעלות יתר הדבק בRoboMover.
  2. הגדר את ההגדרות הבאות: הגדרת מסנן 09 (עירור: 450-490 ננומטר, הפליטה> 515 ננומטר), AutoLPC מצב, אנרגית ליזר 50%, מוקד ליזר 65%, מהירות ליזר 100%, מרחק 5 מיקרומטר בין יריות AutoLPC, מרחק 6 מיקרומטר לשורה, עובד גובה: -10100.
  3. הוסף שקף אחד לבמה.
  4. לאתר את תאי הבטא autofluorescent תחת הדמיה מיקרוסקופית (עדשת 5x או 10x).
  5. לעבור לעדשת 40X, בחר בתאים בטאו עם כלי הבחירה "Freehand" וmicrodissect באמצעות הליזר.
  6. צלם את הרקמה של ארבע cryosections המיובש לAdhesiveCap אחד.
    תגובה 1: את הזמן כדי לנתח את תאי הבטא של cryosection המיובש אחד לא צריך להיות יותר מ 10-20 דקות, כדי למנוע התייבשות של חלקי הרקמות אשר יגרום לכךRNA שפלה.
    תגובה 2: לוודא תהליך microdissection מוצלח על ידי בדיקה חזותית לאחר שעבר את השלב למחסום.

5. תמוגה של רקמות מועשרות תא בטא Microdissected

  1. הסר את AdhesiveCap מRoboMover.
  2. 10 חיץ Pipet μl חילוץ (XB, PicoPure רנ"א בידוד הקיט, ארקטורוס) לתוך המכסה של AdhesiveCap ודגירתו במהופך על 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. ספין למטה ב10000 XG ולשים lysate בקרח יבש. לאחסן אותו ב-80 ° C עד מיצוי RNA הוא מבוצע.
  4. חזור על שלבי 3.) עד 5.) עם כל חלקים אחרים.

6. RNA חילוץ

  1. מערבב את כל 10 10 lysates μl
  2. להמשיך בבידוד RNA על ידי העבודה בטמפרטורת חדר על פי הפרוטוקול של PicoPure רנ"א בידוד הקיט, ארקטורוס, באמצעות הצפת חילוץ יחס 1:1 (XB) לאתנול 70% (כולל טיפול DNase).

7. רנ"א ניתוח

  1. השתמש 1 RNA μl לניתוח של איכות וכמות באמצעות 2100 Bioanalyser Agilent (PicoChip). הערכה כמותית נעשתה בהתייחסות לרנ"א הסטנדרטי עמוס במקביל על השבב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שניתן לראות בתרשים 1, פרוטוקול dehydrating השונה הוביל לשיפור של תאי הבטא autofluorescence לעומת 6 הפרוטוקול שפורסם הקודם. יישום הפרוטוקול המתואר, כל אחד 39 דגימות לבלב ניתוחיות שמש ליצירת 40 cryosections סדרתי עבור ממוצע של דגימת רקמה / לבלב 31'544'704 מיקרומטר 3 (טווח: 8'742'390 - 81'522'153 מיקרומטר 3) כפי שמוצג בטבלה 1. זה מייצג את הנפח של כ 18 איי לבלב בקוטר 150 מיקרומטר, או של 35,000 β-תאים. הרקמה שמקורה בממוצע של 38 איים שונים / דגימת לבלב (טווח: 19-80 איים), כל אחד מהם נצפתה בדרך כלל בשניים או יותר מסעיפים ברציפות. השונות הגדולות בתשואה של איונים בין דגימות שונות משקפות את ההטרוגניות של רקמת המקור, או את הראש או זנב לבלב, כמו גם השיפור המתקדם למפעילים בזיהוייון של האיים בתוך זמן 10 דקות שהוקדש לבדיקה של כל מקטע.

רנ"א מוחלט מכל רקמת microdissected וlysed טוהר עם קיט ארקטורוס PicoPure הקפוא רנ"א הבידוד של יישומים ומערכות ביולוגיות eluted ב11 μl, על פי הפרוטוקול של היצרן. לאחר מכן 1 RNA μl של כל מדגם נותח על ידי 2100 Bioanalyser Agilent. השגנו בממוצע 42 ng-RNA / דגימה (טווח: 5-229 ng / דגימה) עם מספר ממוצע רנ"א יושרה (רין) של 5.8 (טווח: 3.4-7.2). תרשים 2 מציג דוגמה לניתוח רנ"א. משנה איזה ערך רין כל דגימות RNA נתחו שמשו בהצלחה ללימודי transcriptomic. לא מצאו קשר ישיר בין כמות רקמת microdissected ותשואת רנ"א. הבדלים במרווח הזמן בין הקצירה על ידי מנתחים ועל הקפאת דגימות הלבלב לאחר הבדיקה ושחרורו על ידי פתולוג יכולים להסביר בעמ אמנות לאיכות והכמות המשתנות של רנ"א התאושש. גורמים מרכזיים נוספים שיש לשקול הם אנרגית הליזר בקש microdissection, עם האנרגיה הנמוכה מניבה יושרת RNA הגבוהה יותר, כמו גם התמקדות בליזר ואת המרחק מנקודתי LPC. המוקד ממוקם באופן אידיאלי, כאשר "השפעה" קלה של הליזר על משטח הזכוכית של השקופית, ויוצרת נקודה שחורה קטנה, שניתן לראות. בידינו את התוצאות הטובות ביותר המושגות עם אנרגית ליזר של 50%, מוקד ליזר של 65%, אם כי הותאמה כדי לפצות על הבדלים בעובי של הסעיפים, ובמרחק של של 5 נקודתי LPC מיקרומטר. בנוסף, כמות הרנ"א יכולה להיות מותאמת על ידי שמירה על גובה העבודה של RoboMover, כלומר את המרחק בין מכסה הדבק והסעיף, הנמוך ככל האפשר, כדי למנוע אובדן של רקמת microdissected במהלך התהליך הלכיד. עד הגובה עובד בקבוצה שלנו הוא ב-10,100 יחידות PALM שרירותיות.

ll "> דגימה <td> 30
מספר האיונים / הדגימה נפח נאסף רקמה / דגימה [מיקרומטר 3] רין ריכוז [ng / μl] סך רנ"א [ng]
DP002 34 24'947'696 5.2 1.149 10.34
DP003 30 41'141'488 5.5 1.677 15.09
DP005 23 27'024'264 3.5 8.259 66.07
DP006 25 45'900'848 3.4 7.399 59.19
DP007 23'936'048 6.5 0.595 4.76
DP008 22 68'248'432 6.2 1.559 14.03
DP010 34 33'156'752 5.6 1.750 19.25
DP011 29 31'339'152 6.0 1.365 15.02
DP012 34 57'594'360 6.3 3.025 33.28
DP017 35 28'212'256 6.0 1.292 14.21
DP030 35 48'007'530 5.6 2.180 23.98
DP013 36 34'371'045 6.9 1.350 14.85
DP014 35 21'360'060 7.2 1.270 13.97
DP015 33 20'923'488 4.1 4.000 44.00
DP019 40 35'431'704 7.0 1.670 18.37
DP025 19 15'329'844 6.6 0.496 5.46
DP034 19 81'522'153 6.4 4.260 46.86
DP039 32 19'074'410 6.5 1.270 13.97
DP040 44 31'565'630 5.4 2.300 25.30
DP042 52 40'333'840 7.0 2.510 27.61
DP021 65 33'996'260 6.3 2.830 31.13
DP023 19 19'513'310 5.6 8.250 90.75
DP024 32 24'125'140 6.3 20.780 228.58
DP038 23 18'306'040 6.6 11.700 128.70
DP045 35 36'345'620 6.3 1.100 12.10
DP033 42 26'078'550 6.5 15.380 169.18
DP022 49 33'535'460 6.8 7.590 83.49
DP041 56 34'899'830 5.7 3.350 36.85
DP049 38 18'521'230 6.8 1.020 11.22
DP028 32 16'410'670 5.6 1.720 18.92
DP056 36 19'737'580 5.7 1.130 12.43
DP059 52 23'376'180 3.6 7.880 86.68
DP047 41 20'658'370 6.4 1.040 11.44
DP036 23 8'742'390 3.5 0.950 10.45
DP027 42 29'150'480 5.1 3.410 37.51
DP046 54 16'800'070 5.3 8.210 90.31
DP055 57 32'340'270 6.2 1.280 14.08
DP064 74 41'896'460 6.5 2.440 26.84
DP067 80 46'388'540 6.3 5.200 57.20
ממוצע 38 31'544'704 5.8 3.965 42.14
מספר האיונים / הדגימה נפח נאסף רקמה / דגימה [מיקרומטר 3] רין סך רנ"א [ng]
רכס 19-80 8'742'390 - 81'522'153 3.4-7.2 4.76-228.58
ממוצע 38 31'544'704 5.8 42.14

טבלת 1. סקירה כללית של כמות רקמת microdissected ואת האיכות והכמות של RNA חולץ. את הדגימות מוצגת בסדר כרונולוגית. נפח הרקמה שנאסף מחושב כדלקמן: עובי cryosection (10 מיקרומטר) x שטח microdissected [מיקרומטר 2]. 1 RNA μl של כל מדגם נותח על PicoChip Bioanalyser Agilent 2100.

"איור איור 1. autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם autofluorescence של תאים בטאו לאחר התייבשות של cryosections לבלב עם ריאגנטים שנשמרו גם בטמפרטורת חדר (), או קר כקרח (ב) (העירור 450-490 ננומטר, הפליטה> 515 ננומטר;. 400 x גדלה). תאי הביתא מופיעים צהובים, ואילו צינורות לבלב, כלי קולגן ולהציג צבע ירוק. סרגל קנה מידה: 75 מיקרומטר.

איור 2
איור 2. איכות וכמות של איון רנ"א. פרופיל חילוץ של מדגם RNA איון של אדם שנלקח עם LMD פרוטוקול זה (ב ') בהשוואה למדגם RNA סטנדרטי (). 1 RNA μl של כל דגימה יושם על PicoChip ונותח לquantity ואיכותי עם 2100 Bioanalyser Agilent. (): רין (מספר שלמות RNA) 7.7 [rRNA יחס (28S/18S): 1.3)]; (ב '): רין 7.2 [יחס rRNA (28S/18S): 1.1)]. הריכוז של האיון רנ"א היה 1.3 ng / μl, בסכום כולל של 10.3 ננוגרם מרקמת לבלב 21'360'060 מיקרומטר 3. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים גישה אמינה לmicrodissection הליזר (LMD) של איי לבלב אנושיים מדגימה כירורגית. ובלבד שמיקרוסקופ LMD זמין, הליך זה יכול להיות מיושם בכל מוסד מחקר ביצוע pancreatectomies החלקי, וכך להגדיל את הגישה לחומר איון אנושי משני 2 חולי הסוכרת שאינם סוכרתיים וסוג. זה רלוונטי במיוחד לאור מיעוט pancreata הציע לבידוד איון. היבטי Favourable של LMD השוואה לבידוד איון על ידי עיכול collagenase הן הזמן המופחת בין explantation של הרקמה והעיבוד של האיים לרנ"א 7 חילוץ, העשרת התאים בטאו 7, כמו גם הימנעות ממניפולציות מכאניות והאנזימטית קשות 8, 9,10, אשר יכול לשנות את פרופיל ביטוי הגנים. במקרה של חולים באופן חלקי pancreatectomized מידע קליני וחילוף חומרים יותר הוא בדרך כלל זמין יותר מאשר במקרה של איברתורמים. מצד השני, בידוד של איים על ידי תשואות פחות RNA LMD עם ערכים נמוכים רין בהשוואה לאלו שנצפו לאחר עיכול collagenase ואינו מספק איוני חיים ללימודים פונקציונליים. יתר על כן, מחלת הלבלב מובילה לניתוח עלולה להשפיע על פרופיל ביטוי האיון. הערכה מאוזנת של יתרונות וחסרונות אלו תהיה ניתנות להשגה באמצעות מחקרים השוואתיים בין מספר גדול של בידודי איון בוצע על ידי עיכול collagenase וLMD אחד מתורמי איברים או חולי pancreatectomized באופן חלקי, כמו אלה שהולכים על ביוזמה החדשנית לרפואת multicenter סוכרת (IMIDIA) במטרה "שיפור תפקוד תא בטא וזיהוי של סמנים ביולוגיים לאבחון לניטור טיפול בסוכרת" (http://www.imidia.org).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

אנו רוצים להודות לכל עמיתינו שספקו עזרה, יעוץ וקלט קריטי בשלבים שונים של פרויקט זה. הפקה של מאמר וידאו זה הייתה נתמך בכספים IMIDIA (http://www.imidia.org), המשרד הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF) למרכז הגרמני לחקר סוכרת (DZD, http://www.dzd Ev.de-) ובית החולים האוניברסיטאי בקרל גוסטב Carus באוניברסיטה הטכנולוגית של דרזדן. העבודה שהובילה לפרסום זה קבלה תמיכה מהתחייבות היוזמה המשותפת החדשנית התרופות תחת הסכם מענק n ° 155005 (IMIDIA), משאבים של אשר מורכבים של תרומה כספית מהתכנית השביעית של האיחוד האירופי Framework (FP7/2007-2013) וEFPIA חברות 'בתרומה נדיבה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).

Tags

רפואה גיליון 71 פיזיולוגיה אנטומיה ביוכימיה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית אימונולוגיה כירורגיה סוכרת מסוג 2 microdissection ליזר נתיחה תאים בטאו אדם autofluorescence הפנימית לבלב כריתה חלקית סוכרת מסוג 2 מחקרי transcriptomic RNA ניתוח איון
פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt,… More

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter