Summary
激光显微切割是一种技术，使选定单元格的恢复微量的实质。在这里，我们描述了一个协议，收购手术标本用于转录组研究人类胰岛。我们的协议提高了内在的自发荧光的人类β细胞，从而有利于他们的收藏。
Abstract
激光显微切割（LMD）是一种技术，它允许微量的实质1,2选定的细胞和组织的恢复。解剖的细胞可以用于各种调查，如转录或蛋白质组的研究中，DNA的评估或染色体分析2,3。尤其是具有挑战性的应用LMD转录组分析，由于4 RNA的不稳定性，可以表现尤为突出，有丰富的核糖核酸酶，如胰腺组织细胞解剖时。一个显微切割技术协议，能够快速识别和收集的靶细胞，在此设置中是必不可少的，以组织处理时间缩短，因此，为确保RNA保存。
在这里，我们描述了一种协议，用于获取要用于转录研究5从手术标本的人胰岛β细胞。小件胰腺约0.5-1Çm 3的被切断从健康出现边缘切除胰腺标本，嵌入在Tissue-Tek OCT化合物中，立即冷冻冷藏2 -甲基丁烷，并保存在-80℃下，直到切片。 40连续切片厚度为10μm的低温恒温器上切下在-20°C的设置，传送单独的载玻片，在低温恒温器内干燥1-2分钟，并储存于-80℃。
紧随激光显微切割过程之前，在冰冷的固定切片，新鲜制备的70％乙醇中30秒，由冰冷DEPC-处理水的5-6蘸洗涤，并脱水，在冰冷的100％由两个一分钟的孵育乙醇后跟二甲苯（这是用于组织脱水）4分钟，组织切片，然后空气干燥，之后为3-5分钟。更重要的是，所有的步骤，但在二甲苯的潜伏期，进行使用冰冷试剂-一个修改过先前描述的协议6。 UTilization冰冷的试剂导致β细胞的内在自发荧光的显着增长，促进了他们的认可。显微切割，四个部分脱水，每次放入一个用箔纸包裹50毫升管，以保护组织的水分和漂白;，立即显微剩下的两个人。使用PALM微束仪器（蔡司）采用自动激光压力弹射模式（AutoLPC）的程序进行。的完成四个冰冻切片不再需要40-60分钟的β细胞/胰岛夹层。将细胞成一个AdhesiveCap收集，并与10μl的裂解缓冲液中裂解。每个单个RNA转录组分析用试样，得到通过组合10个细胞显微切割的样品，随后使用的Pico纯RNA分离试剂盒（大角星）RNA提取。该协议提高了内在的自发荧光的人类β细胞，从而促进他们的快速，准确识别和collection。进一步改进这个程序可以使β细胞的表型不同的解剖，更好地理解与2型糖尿病有关的变化可能产生的影响。
Protocol
1。冻结的人类胰腺组织
- 取出脂肪组织，血管，神经和非实质组织，用手术刀和镊子，并切断胰腺组织成片（约0.5-1厘米立方体）。
- 胰腺组织一块在中心，一个Cryomold，并覆盖它完全用冷水组织康OCT复合。将Cryomold成一个jar的底部覆盖有预冷却的2 - 甲基丁烷和管理单元在液氮中冷冻。在-80℃下冷冻样品存放
2。冰冻切片的制备
- 戴上手套，在所有步骤，以避免变性的RNA。
- 清洁用冷水100％的乙醇和RNase客场刀低温恒温器，样品架和画笔。将冰冻组织内的低温恒温器。
- 等待，直到组织，刀，刷子达到-20°C。标签的Superfrost Plus幻灯片和预冷却，低温恒温器内室，而等待组织达到-20℃。
- 应用组织康OCT化合物的试样架和将冰冻组织之上。
- ，组织康OCT复合一旦被冻结修剪cryoblock和删除任何多余的组织康OCT复合用刀片。
- 剪下共连续40 10μm的切片，从胰腺组织块。此外，我们还建议要保存图纸，可以方便的识别切片的显微切割过程中的胰岛细胞内的胰腺部分概述第一和中间片切割。
- 传送部从刀片的中心通过触摸的背面侧的滑动用手指（覆盖的手套箱）只升温到的区域的部分，应当坚持一个的Superfrost Plus滑动。
- 干燥的部分1-2分钟内的低温恒温器在-20°C，之后，你把它们放到一个滑动箱置于干冰上。存储的部分在-80℃下
- 如有必要，请用纸巾和100％冷乙醇刀。
3。冰冻切片脱水
- 准备试剂：倒入30毫升新鲜制备的70％的乙醇，30毫升DEPC-处理水，2×30毫升100％的乙醇和30毫升二甲苯入50ml蜂星管（猎鹰）;寒意所有试剂（除二甲苯）并保持在冰上。
- 用100％乙醇和RNaseZAP清洁引擎盖下的工作空间。
- 过程2冷冻切片如下：固定在冰冷的70％乙醇中30秒，用5-6快速蘸冰冷DEPC-处理水，脱水两次冰冷的100％乙醇中的1分钟，在二甲苯中孵育4分钟在室温下（25℃），并空气干燥3-5分钟。重复此步骤，与另一对冰冻切片。
- 将两个干冰冻切片，背靠背用锡纸包裹，以保护他们免受光照和水分到50毫升蜂星管。
- 清洁的显微镜，RNaseZAP，并安装胶盖在RoboMover。
- 进行以下设置：过滤器设置09（激发波长450-490 nm，发射515 nm处），AutoLPC模式，50％的激光能量，65％的激光焦点，100％的激光测速，5微米之间的距离AutoLPC拍摄，6微米的距离线，工作高度：-10,100。
- 一张幻灯片插入到舞台。
- 找到β细胞的自体荧光显微镜下可视（5倍或10倍镜头）。
- 切换到40倍的镜头，与“写意”选择工具选择的β细胞，他们利用激光显微切割。
- 捕捉四个脱水冰冻切片组织到一个AdhesiveCap。
注释1：解剖一个脱水冷冻切片的β细胞的时间不应该超过10-20分钟，以避免补液的组织切片，这将导致RNA的降解。
注释2：验证成功后，通过目测显微切割过程阶段的检查点。
5。裂解染色体富含β细胞的组织
- 删除从RoboMover AdhesiveCap。
- 吸取10μL提取缓冲液（XB，PicoPure RNA提取试剂盒，大角星）到的AdhesiveCap盖下培养倒挂在42°C 30分钟。
- 自旋向下在10,000 xg和把裂解干冰。将它存储在-80℃，直至进行RNA提取。
- 重复步骤3）〜5）。与所有其他部分。
6。 RNA提取
- 将所有10个10微升裂解液
- 继续进行，通过在室温下工作根据协议的RNA分离试剂盒，大角PicoPure，使用以1:1的比例至70％乙醇（包括DNA酶处理）的提取缓冲液（XB）的RNA分离。
7。 RNA分析
- 使用1微升RNA的质量和数量，使用Agilent 2100 Bioanalyser（PicoChip公司）进行分析。定量评价是参照装在芯片上的平行的标准RNA。
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Representative Results
正如图1中所示，修改后的脱水协议导致的β细胞的自发荧光的改进相比，以前的发布的协议6。应用所描述的协议，每个39手术胰腺标本被用来生成40串行冰冻切片的平均31'544'704微米3组织/胰腺试样（范围：8'742'390 - 81'522'153微米3）如表1中所示。这表示大约18个胰岛的直径为150μm，或35,000β-细胞的体积。从38个不同的胰岛/胰腺试样的平均（范围：19 - 80胰岛）起源的组织，其中每一个典型地观察到在两个或多个连续的部分。在不同的样品中胰岛的产量很大的变化反映了异质性的组织来源，无论是胰腺头部或尾部，以及不断改善的经营者在检测离子的小岛专门的检查每节10分钟的时间内。
从每个显微切割并裂解组织的总RNA进行纯化，Applied Biosystems公司的大角PicoPure冷冻RNA提取试剂盒，并在11微升洗脱，根据制造商的协议。接着1微升各样品的RNA分析由安捷伦2100 Bioanalyser。我们获得平均42纳克的RNA /试样（范围：5 - 229纳克/试样）与RNA的完整性的平均数目（RIN）为5.8（范围：3.4 - 7.2）， 图2示出了一个例子的RNA分析。无论RIN值分析RNA样品被成功地用于转录组研究。我们没有发现的显微组织和RNA的产量有直接的关系。在收获的外科医生和冻结的胰腺标本后，检验及放行由病理学家之间的时间间隔的差异可以解释在p艺术的可变回收的RNA的数量和质量。其他关键因素要考虑的是应用显微切割，激光能量较低的能量得到较高的RNA的完整性，以及激光焦点和距离的LPC点。重点时可以看到轻微的“影响力”的激光在玻璃表面上的幻灯片，形成一个黑色的小点，是理想的。在我们的手中，最好的结果是取得的激光的能量的50％，65％的激光的焦点，尽管适于补偿的部分的厚度的差异，和的LPC点的距离为5μm。此外，RNA的数量可以优化的保持工作的RoboMover高度， 即在捕获过程中的距离之间的粘接剂的帽和部分，尽可能的低，以避免丢失的微切割组织。在我们的集合，在工作高度是在-10,100任意PALM单位。
| 胰岛数/样本 | 收集到的组织体积/样品[微米] | RIN | 浓度[ng /μl的] | 总RNA [NG] | |
| DP002 | 34 | 24'947'696 | 5.2 | 1.149 | 10.34 |
| DP003 | 30 | 41'141'488 | 5.5 | 1.677 | 15.09 |
| DP005 | 23 | 27'024'264 | 3.5 | 82.59 | 66.07 |
| DP006 | 25 | 45'900'848 | 3.4 | 7.399 | 59.19 |
| DP007 | <TD> 3023'936'048 | 6.5 | 0.595 | 4.76 | |
| DP008 | 22 | 68'248'432 | 6.2 | 1.559 | 14.03 |
| DP010 | 34 | 33'156'752 | 5.6 | 1.750 | 19.25 |
| DP011 | 29 | 31'339'152 | 6 | 1.365 | 15.02 |
| DP012 | 34 | 57'594'360 | 6.3 | 3.025 | 33.28 |
| DP017 | 35 | 28'212'256 | 6 | 1.292 | 14.21 |
| DP030 | 35 | 48'007'530 | 5.6 | 2.180 | 23.98 |
| DP013 | 36 | 34'371'045 | 6.9 | 1.350 | 14.85 |
| DP014 | 35 | 21'360'060 | 7.2 | 1.270 | 13.97 |
| DP015 | 33 | 20'923'488 | 4.1 | 4.000 | 44.00 |
| DP019 | 40 | 35'431'704 | 7 | 1.670 | 18.37 |
| DP025 | 19 | 15'329'844 | 6.6 | 0.496 | 5.46 |
| DP034 | 19 | 81'522'153 | 6.4 | 4.260 | 46.86 |
| DP039 | 32 | 19'074'410 | 6.5 | 1.270 | 13.97 |
| DP040 | 44 | 31'565'630 | 5.4 | 2.300 | 25.30 |
| DP042 | 52 | 40'333'840 | 7 | 2.510 27.61 | |
| DP021 | 65 | 33'996'260 | 6.3 | 2.830 | 31.13 |
| DP023 | 19 | 19'513'310 | 5.6 | 8.250 | 90.75 |
| DP024 | 32 | 24'125'140 | 6.3 | 20.780 | 228.58 |
| DP038 | 23 | 18'306'040 | 6.6 | 11.700 | 128.70 |
| DP045 | 35 | 36'345'620 | 6.3 | 1.100 | 12.10 |
| DP033 | 42 | 26'078'550 | 6.5 | 15.380 | 169.18 |
| DP022 | 49 | 33'535'460 | 6.8 | 7.590 | 83.49 |
| DP041 | 56 | 34'899'830 | 5.7 | 3.350 | 36.85 |
| DP049 | 38 | 18'521'230 | 6.8 | 1.020 | 11.22 |
| DP028 | 32 | 16'410'670 | 5.6 | 1.720 | 18.92 |
| DP056 | 36 | 19'737'580 | 5.7 | 1.130 | 12.43 |
| DP059 | 52 | 23'376'180 | 3.6 | 7.880 | 86.68 |
| DP047 | 41 | 20'658'370 | 6.4 | 1.040 | 11.44 |
| DP036 | 23 | 8'742'390 | 3.5 | 0.950 | 10.45 |
| DP027 | 42 | 29'150'480 | 5.1 | 3.410 | 37.51 |
| DP046 | 54 | 16'800'070 | 5.3 | 8.210 | 90.31 |
| DP055 | 57 | 32'340'270 | 6.2 | 1.280 | 14.08 |
| DP064 | 74 | 41'896'460 | 6.5 | 2.440 | 26.84 |
| DP067 | 80 | 46'388'540 | 6.3 | 5.200 | 57.20 |
| 平均 | 38 | 31'544'704 | 5.8 | 3.965 | 42.14 |
| 胰岛数/样本 | 收集到的组织体积/样品[微米] | RIN | 总RNA [NG] | ||
| 范围 | 19 - 80 | 8'742'390 - 81'522'153 | 3.4 - 7.2 | 4.76 - 228.58 | |
| 平均 | 38 | 31'544'704 | 5.8 | 42.14 | |
表1中。概述标本的显微组织和提取的RNA的质量和数量。按时间顺序排列。将收集的组织体积的计算方法如下：冰冻切片的厚度（10微米）×显微切割面积[μm2的 ]。分析每个样品的1μlRNA提取在Agilent 2100 Bioanalyser PicoChip公司。
图1。内在的自发荧光的人类β细胞的自体荧光的β细胞脱水后胰腺癌冷冻切片与试剂被保持在室温下（A），或（B）的冰冷的（激发450 - 490nm处，发射> 515毫微米; 400所述放大倍率）。 β细胞出现黄色，，而胰腺导管，血管及胶原蛋白显示一个绿色的颜色。比例尺：75微米。
图2。提取的胰岛RNA。简介了人类胰岛RNA样品相比，一个标准的RNA样品（A）获得本：LMD协议（B）的数量和质量 。施加在每个样品的1μlRNA提取PicoChip公司并和分析quantity和质量与Agilent 2100 Bioanalyser的。 （A）：RIN（RNA的完整性号码）7.7 [（28S/18S rRNA的比率）：1.3）]，（B）：RIN 7.2 [rRNA的比率（28S/18S）：1.1）]。胰岛RNA的浓度为1.3纳克/微升，总金额为10.3纳克21'360'060微米3胰腺组织。 点击这里查看大图 。
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Discussion
我们描述了一种可靠的方法，激光显微切割（LMD）的人类胰岛，胰腺手术标本。 ，一个LMD显微镜的，这个程序可以在任何研究机构进行部分胰脏，从而提高了进入人体胰岛材料从非糖尿病和2型糖尿病患者。缺乏所提供的胰腺的胰岛分离，这一点尤其重要。有利的方面，LMD通过胶原酶消化胰岛分离相比是减少外植的组织之间的时间和处理的胰岛的β细胞的富集7，以及避免苛刻的机械和酶操作8 7，提取RNA， 9,10，这可能会改变基因的表达谱。在更多的临床和代谢信息部分pancreatectomized的患者的情况下通常是使用比在箱子器官捐助者。另一方面，隔离的胰岛LMD产量较少RNA具有较低的RIN值胶原酶消化后所观察到的相比，并不提供生活胰岛功能研究。此外，胰腺疾病，导致手术可能会影响胰岛的表达谱。一个平衡的评估，是可以实现的，通过这些利弊进行了胶原酶消化器官捐赠者或部分pancreatectomized的的患者，如持续多的创新药物倡议和LMD一个大量的胰岛隔离的比较研究糖尿病（IMIDIA）目标“改善β细胞功能和鉴别诊断的生物标志物用于治疗糖尿病监测”（ http://www.imidia.org ）。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢我们的同事提供帮助，建议和重要的投入在这个项目的各个步骤。生产视频文章从IMIDIA（ http://www.imidia.org ），德国联邦教育和研究部（BMBF）德国糖尿病研究中心（， http://www.dzd DZD的资金支持ev.de ）和大学医院的卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯在德累斯顿技术大学。导致本出版物的工作已获得创新药物计划联合执行体的支持下赠款协议N°155005（IMIDIA），资源的财政贡献，这是由欧盟的第七框架计划（FP7/2007-2013）和EFPIA公司的实物捐助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22x22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
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