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Medicine

Protocole amélioré pour la microdissection laser d'îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

doi: 10.3791/50231 Published: January 6, 2013

Summary

Microdissection laser est une technique qui permet la récupération des cellules sélectionnées à partir des quantités infimes de parenchyme. Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques. Notre protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur collection.

Abstract

Microdissection laser (LMD) est une technique qui permet la récupération des cellules et des tissus sélectionnés à partir des quantités infimes de 1,2 parenchyme. Les cellules disséqués peut être utilisé pour une variété d'enquêtes, telles que les études de transcriptomique ou la protéomique, l'évaluation de l'ADN ou l'analyse chromosomique 2,3. Une application particulièrement difficile du LMD est l'analyse du transcriptome, qui, en raison de la labilité de l'ARN 4, peut être particulièrement importante lorsque les cellules sont disséqués à partir de tissus qui sont riches de RNases, comme le pancréas. Un protocole de microdissection qui permet une identification rapide et la collecte de cellules cibles est essentielle dans ce cadre afin de raccourcir le temps de traitement des tissus et, par conséquent, d'assurer la conservation d'ARN.

Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des cellules bêta pancréatiques à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques 5. De petits morceaux de pancréas de environ 0,5-1 cm 3 ont été découpés à partir des marges saines apparaissant de spécimens du pancréas réséqués, noyés dans du Tissue-Tek OCT, composé immédiatement congelés dans réfrigéré 2-méthylbutane, et conservés à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe. Quarante coupes sériées de 10 um d'épaisseur ont été coupées au cryostat dans un cadre de -20 ° C, transférés individuellement dans des lames de verre, séché à l'intérieur du cryostat pendant 1-2 min, et conservés à -80 ° C.

Immédiatement avant la procédure de microdissection laser, coupes ont été fixées dans le froid de la glace, fraîchement préparé l'éthanol à 70% pendant 30 sec, lavé par 5-6 plonge dans la glace froide eau traitée au DEPC, et déshydratée par deux incubations d'une minute dans la glace froide 100% l'éthanol suivie par le xylène (qui est utilisé pour la déshydratation des tissus) pendant 4 min; coupes de tissus ont ensuite été séchés à l'air pendant 3-5 min après. Surtout, toutes les mesures, à l'exception de l'incubation dans du xylène, ont été effectuées à l'aide glacées réactifs - une modification sur un protocole décrit précédemment 6. Utahilization de réactifs glacées entraîné une augmentation marquée de l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta, et de faciliter leur reconnaissance. Pour microdissection, quatre sections ont été déshydratées à chaque fois: deux ont été placés dans une feuille gainé de tube de 50 ml, pour protéger le tissu de l'humidité et de blanchiment, les deux autres ont été immédiatement microdisséqué. Cette procédure a été réalisée à l'aide d'un instrument PALM MicroBeam (Zeiss) en utilisant la pression Laser automatique Ejection (AutoLPC) mode. L'achèvement de la cellule bêta / dissection îlot de quatre cryosections requis ne dépasse pas 40-60 min. Les cellules ont été rassemblés dans un AdhesiveCap et lysées avec 10 ul de tampon de lyse. Chaque échantillon d'ARN unique pour l'analyse du transcriptome a été obtenue en combinant des échantillons de 10 cellules par microdissection, suivie d'une extraction d'ARN en utilisant le Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Ce protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur reconnaissance rapide et exacte, et collection. Poursuite de l'amélioration de cette procédure pourrait permettre la dissection des cellules bêta phénotypiquement différentes, avec des implications possibles pour mieux comprendre les changements liés à diabète de type 2.

Protocol

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1. La congélation des tissus pancréatiques humaines

  1. Retirer le tissu adipeux, les vaisseaux sanguins, les nerfs et les tissus parenchymateux non avec un scalpel et pince à épiler, et couper le tissu pancréatique en morceaux (~ 0,5 à 1 cm cubes).
  2. Placez un morceau de tissu pancréatique dans le centre d'une Cryomold, et le couvrir complètement avec le froid Tissue-Tek composé octobre Mettez le Cryomold dans un bocal dont le fond est recouvert de pré-refroidi 2-méthylbutane et snap-gel dans de l'azote liquide. Conserver l'échantillon congelé à -80 ° C.

2. Préparation des sections congelées

  1. Porter des gants pendant toutes les mesures nécessaires pour éviter la dénaturation de l'ARN.
  2. Nettoyez le couteau cryostat, porte-échantillon et le pinceau avec de l'éthanol 100% froid et RNase Away. Placez le tissu congelé à l'intérieur du cryostat.
  3. Attendez jusqu'à ce que le tissu, le couteau et pinceau atteindre -20 ° C. Étiquetez le SuperFrost Plus diapositives de pré-refroidir eux à l'intérieur de la chambre de cryostat en attendantpour atteindre le tissu à -20 ° C.
  4. Appliquer le Tissue-Tek OCT composés sur le porte-échantillon et placer le tissu congelé sur le dessus.
  5. Une fois que le composé Tissue-Tek OCT est gelé couper le cryoblock et enlever tout excès de composé Tissue-Tek OCT avec une lame de rasoir.
  6. Couper un total de 40 um 10 tranches consécutives à partir du bloc de tissu pancréatique. En outre, nous recommandons de couper une tranche prénom et d'être sauvés pour plans d'ensemble de la section du pancréas qui peut faciliter l'identification des îlots à l'intérieur des tranches au cours du processus de microdissection.
  7. Transférer les sections de la lame de couteau au centre d'un SuperFrost Plus diaporama en appuyant sur l'arrière de la lame avec votre doigt (recouvert d'un gant) pour se réchauffer que la région à laquelle la section doit se conformer.
  8. Sécher le min articles 1-2 à l'intérieur du cryostat à -20 ° C, après quoi vous les mettez dans une boîte à lames placés sur de la glace sèche. Stocker les sectionsà -80 ° C.
  9. Si nécessaire, nettoyer la lame du couteau avec du papier absorbant et froid d'éthanol à 100%.

3. Déshydratation des sections congelées

  1. Préparer les réactifs: versez 30 ml fraîchement préparée éthanol à 70%, 30 ml eau traitée au DEPC, 2x30 ml d'éthanol à 100% et 30 ml de xylène dans des tubes de 50 ml (CELLSTAR Falcons); froid et de conserver tous les réactifs (sauf le xylène) sur la glace.
  2. Nettoyez l'espace de travail sous le capot avec de l'éthanol à 100% et RNaseZAP.
  3. Processus en deux cryosections comme suit: fixer dans la glace froide d'éthanol à 70% pendant 30 sec, laver avec 5-6 trempettes dans la glace froide eau traitée au DEPC, déshydrater deux fois pendant 1 min dans la glace 100% d'éthanol froid, incuber pendant 4 min dans le xylène à la température ambiante (25 ° C), et de l'air sec pendant 3-5 min. Répétez cette étape avec une autre paire de cryosections.
  4. Insérez deux cryosections séchées dos à dos dans un tube de 50 ml Cellstar enveloppé d'une feuille d'aluminium pour les protéger de la lumière et de l'humidité.
<p class = "jove_title"> 4. La microdissection laser de bêta-cellules avec PALM MicroBeam, Zeiss

  1. Nettoyer le microscope avec RNaseZAP et montez le Cap adhésif dans le RoboMover.
  2. Définissez les paramètres suivants: Définir le filtre 09 (excitation: 450-490 nm, émission> 515 nm), AutoLPC mode, l'énergie du laser de 50%, 65% focalisation du laser, laser vitesse de 100%, une distance de 5 um entre les prises AutoLPC, une distance de 6 um à la ligne, hauteur de travail: -10.100.
  3. Insérer une diapositive dans le stade.
  4. Repérez les cellules bêta autofluorescentes sous visualisation microscopique (objectif 5x ou 10x).
  5. Passez à l'objectif 40x, sélectionnez les cellules bêta avec l'outil "main levée" de sélection et les microdissect utilisant le laser.
  6. Capturez le tissu de quatre cryosections déshydratés dans un AdhesiveCap.
    Remarque 1: le temps de disséquer les cellules bêta d'un cryosection déshydraté ne doit pas être plus long que 10-20 min pour éviter la réhydratation des coupes de tissus qui se traduirait parDégradation de l'ARN.
    Commentaire 2: vérifier procédé de microdissection succès par inspection visuelle après le déplacement de la scène au point de contrôle.

5. La lyse des cellules bêta des tissus microdisséqués enrichi

  1. Retirez le AdhesiveCap de la RoboMover.
  2. Pipeter 10 ul de tampon d'extraction (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) dans le couvercle de la AdhesiveCap et incuber à l'envers à 42 ° C pendant 30 min.
  3. Centrifuger à 10000 xg et mettre le lysat sur glace sèche. Stocker à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN est réalisée.
  4. Répétez les étapes 3.) À 5.) Avec toutes les autres sections.

6. Extraction de l'ARN

  1. Mélanger tous les 10 dix lysats pi
  2. Procéder à l'isolement de l'ARN en travaillant à la température ambiante selon le protocole du kit PicoPure RNA Isolation, Arcturus, à l'aide d'un tampon d'extraction 01h01 ratio (XB) à l'éthanol 70% (y compris le traitement DNase).

7. Analyse des ARN

  1. Utilisez 1 ul d'ARN pour l'analyse de la qualité et de la quantité à l'aide d'un Agilent 2100 Bioanalyser (picoChip). L'évaluation quantitative est faite en référence à un ARN standard chargées en parallèle sur la puce.

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Representative Results

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Comme le montre la figure 1, le protocole modifié déshydratation conduit à une amélioration de l'autofluorescence des cellules bêta par rapport à la précédente protocole publié 6. En appliquant le protocole décrit, chacun des 39 spécimens chirurgicaux pancréatiques a été utilisé pour produire 40 cryosections série pour une moyenne de 3 um 31'544'704 tissu / pancréas spécimen (plage: 8'742'390 - 81'522'153 um 3) comme le montre le tableau 1. Ceci représente le volume d'environ 18 îlots pancréatiques de 150 pm de diamètre, ou des β-35.000 cellules. Le tissu provient d'une moyenne de 38 îlots différents spécimens / pancréatique (plage: 19 à 80 îlots), dont chacun a été généralement observé dans deux ou plusieurs segments. La grande variabilité du rendement d'îlots parmi les différents spécimens reflète l'hétérogénéité de la source de tissu, soit la tête du pancréas ou de la queue, ainsi que l'amélioration progressive des opérateurs dans le détecterion des îlots dans le temps 10 min consacré à l'inspection de chaque section.

L'ARN total de chaque tissu microdissection et lysées a été purifié avec le kit Arcturus PicoPure Frozen isolement d'ARN Applied Biosystems et élue dans 11 ul, selon le protocole du fabricant. Par la suite 1 RNA ul de chaque échantillon a été analysé par le Agilent 2100 Bioanalyser. Nous avons obtenu en moyenne 42 ng d'ARN / prélèvement (plage: de 5 à 229 ng / échantillon) avec un certain nombre d'ARN intégrité moyenne (RIN) de 5,8 (intervalle: 3,4 - 7,2). Figure 2 montre un exemple de l'analyse de l'ARN. Quelle que soit la valeur de RIN tous les échantillons analysés ARN ont été utilisés avec succès pour des études transcriptomiques. Nous n'avons pas trouvé de relation directe entre la quantité de tissu microdissection et le rendement en ARN. Les différences dans l'intervalle de temps entre la récolte par les chirurgiens et le gel des échantillons pancréatiques après l'examen et la libération par le pathologiste peut expliquer en p art pour la qualité variable et la quantité d'ARN récupérées. D'autres facteurs essentiels à prendre en compte sont l'énergie laser appliquée pour microdissection, avec le moins d'énergie produisant le plus élevé de l'intégrité d'ARN, ainsi que le foyer du laser et la distance des points de LPC. L'accent est idéalement situé quand un léger "impact" du laser sur la surface du verre de la lame, formant un petit point noir, peut être vu. Dans nos mains les meilleurs résultats sont obtenus avec une énergie laser de 50%, une focalisation du laser de 65%, bien adaptés pour compenser les différences d'épaisseur des sections, et une distance de points LPC de 5 um. En outre, la quantité d'ARN peut être optimisé en gardant la hauteur de travail de l'RoboMover, c'est à dire la distance entre le couvercle et la partie adhésive, aussi bas que possible pour éviter la perte de tissu microdissection au cours du processus de capture. Dans notre série sur toute la hauteur de travail est à -10.100 unités PALM arbitraires.

ll "> spécimen <td> 30
nombre d'îlots / échantillons volume de tissu prélevé / échantillon [um 3] RIN concentration [ng / ul] ARN total [ng]
DP002 34 24'947'696 5,2 1,149 10,34
DP003 30 41'141'488 5,5 1,677 15,09
DP005 23 27'024'264 3,5 8,259 66,07
DP006 25 45'900'848 3,4 7,399 59,19
DP007 23'936'048 6,5 0,595 4,76
DP008 22 68'248'432 6,2 1,559 14,03
DP010 34 33'156'752 5,6 1,750 19,25
DP011 29 31'339'152 6.0 1,365 15,02
DP012 34 57'594'360 6,3 3,025 33,28
DP017 35 28'212'256 6.0 1,292 14,21
DP030 35 48'007'530 5,6 2,180 23,98
DP013 36 34'371'045 6,9 1,350 14,85
DP014 35 21'360'060 7,2 1,270 13,97
DP015 33 20'923'488 4,1 4,000 44,00
DP019 40 35'431'704 7.0 1,670 18,37
DP025 19 15'329'844 6,6 0,496 5,46
DP034 19 81'522'153 6,4 4,260 46,86
DP039 32 19'074'410 6,5 1,270 13,97
DP040 44 31'565'630 5,4 2,300 25,30
DP042 52 40'333'840 7.0 2,510 27,61
DP021 65 33'996'260 6,3 2,830 31,13
DP023 19 19'513'310 5,6 8,250 90,75
DP024 32 24'125'140 6,3 20,780 228,58
DP038 23 18'306'040 6,6 11,700 128,70
DP045 35 36'345'620 6,3 1,100 12,10
DP033 42 26'078'550 6,5 15,380 169,18
DP022 49 33'535'460 6,8 7,590 83,49
DP041 56 34'899'830 5,7 3,350 36,85
DP049 38 18'521'230 6,8 1,020 11,22
DP028 32 16'410'670 5,6 1,720 18,92
DP056 36 19'737'580 5,7 1,130 12,43
DP059 52 23'376'180 3,6 7,880 86,68
DP047 41 20'658'370 6,4 1,040 11,44
DP036 23 8'742'390 3,5 0,950 10,45
DP027 42 29'150'480 5,1 3,410 37,51
DP046 54 16'800'070 5,3 8,210 90,31
DP055 57 32'340'270 6,2 1,280 14,08
DP064 74 41'896'460 6,5 2,440 26,84
DP067 80 46'388'540 6,3 5,200 57,20
moyenne 38 31'544'704 5,8 3,965 42,14
nombre d'îlots / échantillons volume de tissu prélevé / échantillon [um 3] RIN ARN total [ng]
gamme 19 à 80 8'742'390 - 81'522'153 3,4 à 7,2 4,76 à 228,58
moyenne 38 31'544'704 5,8 42,14

Tableau 1. Vue d'ensemble de la quantité de tissu microdissection et la qualité et la quantité de l'ARN extrait. Les échantillons sont classés par ordre chronologique. Le volume de tissu prélevé est calculé comme suit: épaisseur de cryosection (10 um) x surface microdisséquées [um 2]. 1 ARN ul de chaque échantillon a été analysé sur la picoChip Agilent Bioanalyser 2100.

"Figure Figure 1. Autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines autofluorescence des cellules bêta après déshydratation de cryosections pancréatiques avec des réactifs qui ont été soit maintenues à température ambiante (A) ou glacée (B) (excitation 450 à 490 nm, émission> 515 nm;. 400 x grossissement). Les cellules bêta apparaissent en jaune, tandis que les canaux pancréatiques, des navires et du collagène afficher une couleur verte. Barre d'échelle: 75 um.

Figure 2
Figure 2. Qualité et quantité de l'ARN extrait îlot. Profil d'un échantillon humain îlot ARN obtenu avec ce protocole LMD (B) par rapport à un échantillon standard ARN (A). 1 ARN ul de chaque échantillon a été appliqué sur une picoChip et analysés pour quantity et de qualité avec le Agilent 2100 Bioanalyser. (A): RIN (nombre intégrité de l'ARN) 7,7 [ARNr Ratio (28S/18S): 1,3)], (B): RIN 7.2 [Ratio d'ARNr (28S/18S): 1.1)]. La concentration de l'ARN îlot était de 1,3 ng / ul, pour un montant total de 10,3 ng de 21'360'060 tissu pancréatique um 3. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

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Nous décrivons une approche fiable pour la microdissection laser (LMD) des îlots pancréatiques humains à partir spécimen chirurgical. À condition qu'un microscope LMD est disponible, cette procédure pourrait être appliquée à tout établissement de recherche effectuant pancréatectomies partielles, augmentant ainsi l'accès au matériel îlots humains à partir de deux 2 non-diabétiques et les sujets diabétiques de type. Ceci est particulièrement pertinent étant donné la rareté de pancréas offert pour l'isolement des îlots. Les avantages de LMD aspects par rapport à l'isolement des îlots par digestion par la collagénase sont la diminution du temps entre l'explantation du tissu et le traitement des îlots pour l'extraction d'ARN 7, l'enrichissement des cellules bêta 7, ainsi que l'évitement de rudes manipulations mécaniques et enzymatiques 8, 9,10, ce qui pourrait modifier le profil d'expression génique. Dans le cas des patients partiellement pancréatectomisés plus d'information clinique et métabolique est généralement disponible que dans le cas d'un organeles bailleurs de fonds. D'autre part, l'isolement des îlots par des rendements moins LMD ARN avec des valeurs RIN inférieurs par rapport à ceux observés après digestion par la collagénase et ne fournit pas îlots de vie pour des études fonctionnelles. En outre, la maladie du pancréas conduisant à la chirurgie peuvent affecter le profil d'expression des îlots. Une évaluation équilibrée de ces avantages et les inconvénients seront réalisables grâce à des études comparatives sur un grand nombre d'isolements d'îlots réalisée par digestion à la collagénase et LMD soit à partir de donneurs d'organes ou de patients partiellement pancréatectomisés, tels que ceux en cours dans l'Initiative de médecine multicentrique innovante pour Diabète (IMIDIA) dans le but de «L'amélioration de la fonction des cellules bêta et l'identification de biomarqueurs de diagnostic pour le suivi des traitements pour le diabète" ( http://www.imidia.org ).

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier tous nos collègues qui ont fourni de l'aide, des conseils et des intrants essentiels à différentes étapes de ce projet. La production de cet article vidéo a été appuyée par des fonds IMIDIA ( http://www.imidia.org ), le ministère allemand de l'Education et de la Recherche (BMBF) pour le Centre allemand de recherche sur le diabète (DZD, http://www.dzd -ev.de ) et l'hôpital universitaire Carl Gustav Carus de l'Université de technologie de Dresde. Les travaux menant à cette publication a reçu le soutien de l'entreprise Initiative médicaments innovants conjoint en vertu de convention de subvention n ° 155005 (IMIDIA), les ressources qui sont composées de la contribution financière du Programme de l'Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et l'EFPIA entreprises «contribution en nature.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cite this Article

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).More

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).

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