Summary
Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.
Abstract
Microdissecção a laser (LMD) é uma técnica que permite a recuperação de células e tecidos seleccionados a partir de quantidades diminutas de parênquima 1,2. As células dissecadas pode ser usado para uma variedade de investigações, como estudos transcriptomic ou proteômica, avaliação ou análise de ADN cromossómico 2,3. Uma aplicação especialmente difícil de LMD é a análise de transcriptoma, o qual, devido à instabilidade do ARN 4, pode ser particularmente importante quando as células são dissecados a partir de tecidos que são ricos de RNases, tais como o pâncreas. Um protocolo de microdissecção que permite a identificação rápida e recolha de células-alvo é essencial nesta configuração, a fim de encurtar o tempo de tratamento do tecido e, consequentemente, para assegurar a preservação do RNA.
Aqui descrevemos um protocolo para a obtenção de células beta pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic 5. Pequenos pedaços de pâncreas de cerca de 0,5-1 cm 3 foram cortados a partir das margens saudáveis constantes de espécimes pâncreas extirpado, embebidos em composto Tissue-Tek OCT, imediatamente congelados em 2-metilbutano, refrigerada e armazenado a -80 ° C até que o corte. Quarenta secções seriadas de 10 um de espessura foram cortadas num criostato com uma configuração de -20 ° C, transferidas individualmente para lâminas de vidro, secou-se no interior do criostato durante 1-2 min e armazenado a -80 ° C.
Imediatamente antes do procedimento de microdissecção a laser, as secções foram fixadas em frio de gelo, preparada de fresco de etanol a 70% durante 30 segundos, lavou-se por 5-6 depressões em gelo água tratada com DEPC a frio, e desidratado por duas incubações de um minuto em gelo 100% frio etanol seguido de xileno (que é utilizado para a desidratação do tecido) durante 4 min; secções de tecido foram então secos ao ar depois de 3-5 min. Mais importante ainda, todos os passos, excepto a incubação em xileno, foram realizadas utilizando geladas reagentes - uma modificação ao longo de um protocolo previamente descrito 6. Utilization de reagentes geladas resultou num aumento acentuado da autofluorescência intrínseca das células beta, e facilitado o seu reconhecimento. Por microdissecção, quatro secções foram desidratadas de cada vez: dois foram colocados em um tubo de ml embrulhado em papel alumínio 50, para proteger o tecido da humidade e de branqueamento, os dois restantes foram imediatamente microdissecados. Este procedimento foi realizado utilizando um instrumento PALM MicroBeam (Zeiss) empregando a pressão Laser Auto Catapulting (AutoLPC) de modo. A conclusão da célula beta / dissecção ilhota a partir de quatro criocortes necessários não mais do que 40-60 min. As células foram recolhidas para um AdhesiveCap e lisadas com 10 ul de tampão de lise. Cada amostra de RNA simples para análise transcriptomic foi obtida através da combinação de 10 amostras de células microdissecadas, seguido por extracção de ARN usando o Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Este protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim o seu reconhecimento rápido e preciso e collection. Melhorar ainda mais este procedimento poderia permitir que a dissecção das células beta fenotipicamente diferentes, com possíveis implicações para uma melhor compreensão das mudanças associadas com o diabetes tipo 2.
Protocol
1. Congelamento de tecido pancreático humano
- Remover o tecido adiposo, vasos sanguíneos, nervos e não-parenquimatosa tecido com um bisturi e pinças, e cortar o tecido pancreático em pedaços (cubos de ~ 0,5-1 cm).
- Coloque um pedaço de tecido pancreático, no centro de uma Cryomold e cobri-lo completamente com frio Composto outubro Tissue-Tek. Coloque a Cryomold em um frasco cujo fundo está coberto com pré-arrefecida 2-metilbutano e de encaixe por congelação em azoto líquido. Armazenar a amostra congelada a -80 ° C.
2. Preparação de cortes congelados
- Usar luvas durante todo todas as medidas para evitar a desnaturação do RNA.
- Limpe a faca criostato, porta-amostra e pincel com 100% de etanol frio e RNase Fora. Colocar o tecido congelado dentro do criostato.
- Aguarde até que o tecido faca, e escova alcançar -20 ° C. Rotular o SuperFrost Além disso slides e pré-cool-los dentro da câmara do criostato enquanto esperapara o tecido para chegar a -20 ° C.
- Aplicar o Tissue-Tek Composto outubro no suporte de amostra e colocar o tecido congelado em cima.
- Uma vez que o Tissue-Tek Composto outubro está congelado cortar o cryoblock e remover qualquer excesso de Composto Tissue-Tek outubro com uma lâmina de barbear.
- Corte um total de 40 uM consecutivos 10 fatias a partir do bloco de tecido pancreático. Além disso, recomendamos o corte de uma primeira fatia e meio para ser salvo para desenhos visão geral da seção de pâncreas que pode facilitar a identificação de ilhotas dentro das fatias durante o processo de microdissecção.
- Transferir as secções da lâmina da faca para o centro de uma SuperFrost Além slides tocando a parte de trás da lâmina com o seu dedo (coberta com uma luva) para aquecer apenas a região em que a secção deve aderir.
- Seca-se a 1-2 min secções dentro do criostato a -20 ° C, após o que os colocar dentro de uma caixa corrediça colocada em gelo seco. Armazenar as seçõesa -80 ° C.
- Se necessário, limpe a lâmina da faca com toalhas de papel e álcool 100% frio.
3. Desidratação de cortes congelados
- Preparar os Reagentes: verter 30 ml de etanol preparada de fresco de 70%, 30 ml de água tratada com DEPC, 2x30 ml de etanol a 100% e 30 ml de xileno em tubos de 50 ml (Falcon Cellstar); frio e manter todos os reagentes (excepto o xileno) em gelo.
- Limpe o espaço de trabalho sob o capô, com 100% de etanol e RNaseZAP.
- Processo de duas criocortes como se segue: fixar em gelo de etanol 70% frio durante 30 s, lava-se com 5-6 mergulhos rápidos em gelo de água tratada com DEPC a frio, duas vezes desidratar durante 1 min em etanol a 100% arrefecido em gelo, incubar durante 4 min em xileno à temperatura ambiente (25 ° C), e secar ao ar durante 3-5 min. Repita este passo com outro par de criosseções.
- Coloque duas criosseções secas volta para trás em um tubo de 50 ml Cellstar envolvido com folha de alumínio para protegê-los da luz e da umidade.
- Limpar o microscópio com RNaseZAP e montar o tampão adesiva no RoboMover.
- Defina as seguintes configurações: SET FILTER 09 (excitação: 450-490 nm, 515 nm de emissão>), AutoLPC modo, a energia do laser de 50%, o foco do laser de 65%, 100% de velocidade a laser, 5 mM distância entre os disparos AutoLPC, 6 mM distância a linha, altura de trabalho: -10.100.
- Insira um slide no palco.
- Localize as células beta autofluorescente sob visualização microscópica (objetiva de 5x ou 10x).
- Mudar para a lente de 40x, selecione as células beta com a ferramenta de seleção "Freehand" e microdissect-los utilizando o laser.
- Capturar o tecido de quatro criocortes desidratados numa AdhesiveCap.
Comentário 1: o tempo necessário para dissecar as células beta de um criocorte desidratado não deve ser superior a 10-20 min para evitar a re-hidratação das secções de tecido que resultaria emRNA degradação.
Comentário 2: verificar processo microdissecção sucesso por inspeção visual depois de mover o palco para o ponto de verificação.
5. A lise das células do tecido microdissecado Beta Enriched
- Remover o AdhesiveCap do RoboMover.
- Pipetar 10 ul de tampão de extracção (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) na tampa do AdhesiveCap e incubar de cabeça para baixo, a 42 ° C durante 30 min.
- Girar a 10.000 xg e colocar o lisado em gelo seco. Armazená-lo a -80 ° C até a extracção de ARN é efectuada.
- Repita os passos 3.) A 5.) Com todas as outras seções.
6. Extração de RNA
- Misture todos os 10 lisados 10 uL
- Prosseguir com o isolamento de ARN através do trabalho à temperatura ambiente de acordo com o protocolo do RNA PicoPure Isolation Kit, Arcturus, utilizando um rácio de 01:01 Tampão de Extracção (XB) a etanol a 70% (incluindo o tratamento de DNase).
7. RNA Análise
- Use um RNA uL para análise da qualidade e quantidade usando um Agilent 2100 Bioanalyzer (Picochip). Avaliação quantitativa é feita em referência a um padrão de RNA carregadas em paralelo sobre o chip.
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Representative Results
Como mostrado na Figura 1, o protocolo modificado de desidratação levou a uma melhoria da autofluorescência células beta em relação ao protocolo anterior, publicado 6. Aplicando o protocolo descrito, cada um dos 39 espécimes cirúrgicos pancreáticos foi usado para gerar 40 criocortes de série para uma média de 3 uM 31'544'704 espécime de tecido / pancreático (intervalo: 8'742'390 - 81'522'153 uM 3) como mostrado na Tabela 1. Isto representa o volume de cerca de 18 ilhéus pancreáticos de 150 um de diâmetro, ou de 35000 β-pilhas. O tecido originada a partir de uma média de 38 ilhéus pancreáticos de amostras diferentes / (intervalo: 19-80 ilhotas), cada um dos quais foi tipicamente observado em duas ou mais secções consecutivas. A grande variabilidade na produção das ilhotas entre amostras diferentes reflecte a heterogeneidade da fonte de tecido, ou cabeça do pâncreas ou da cauda, bem como a melhoria progressiva dos operadores no detectarion das ilhotas dentro do tempo de 10 minutos dedicados para a inspecção de cada secção.
RNA total de cada tecido microdissecado e lisadas foi purificado com o kit de Arcturus congelado PicoPure Isolation ARN de Applied Biosystems e eluída em 11 ul, de acordo com o protocolo do fabricante. Subsequentemente, um RNA uL de cada amostra foi analisada pela Agilent 2100 Bioanalyzer. Foram obtidos em média de 42 ng de RNA / amostra (variação: 5-229 ng / amostra) com um número médio de integridade do RNA (RIN) de 5,8 (intervalo: 3,4 - 7,2). A Figura 2 mostra um exemplo da análise do RNA. Qualquer que seja o valor de todas as amostras analisadas RIN RNA foram utilizados com sucesso em estudos transcriptomic. Nós não encontrou uma relação direta entre a quantidade de tecido microdissectados eo rendimento RNA. Diferenças no intervalo de tempo entre a colheita pelos cirurgiões e congelamento das amostras de pâncreas após seu exame e liberação pelo patologista poderia explicar em p arte para a qualidade e quantidade variável de RNA recuperado. Outros factores chave a considerar são a energia laser aplicada por microdissecção, com a energia mais baixa dando origem a maior integridade de ARN, bem como o foco do laser e da distância dos pontos de LPC. O foco está idealmente situado quando um "impacto" ligeira do laser na superfície do vidro da lâmina, formando um pequeno ponto preto, pode ser visto. Nas nossas mãos os melhores resultados são obtidos com uma energia de laser de 50%, um foco do laser de 65%, embora adaptado para compensar diferenças na espessura das secções, e uma distância de pontos de LPC de 5 um. Além disso, a quantidade de RNA podem ser optimizados, mantendo a altura de trabalho do RoboMover, ou seja, a distância entre a tampa e a secção de adesivo, o mais baixo possível para evitar a perda de tecido microdissecado, durante o processo de captura. Em nosso conjunto até a altura de trabalho é a -10.100 unidades arbitrárias PALM.
| número de ilhotas / espécime | volume de tecido recolhidos / espécime [mM 3] | RIN | concentração [ng / ul] | ARN total [ng] | |
| DP002 | 34 | 24'947'696 | 5,2 | 1,149 | 10,34 |
| DP003 | 30 | 41'141'488 | 5,5 | 1,677 | 15,09 |
| DP005 | 23 | 27'024'264 | 3,5 | 8,259 | 66,07 |
| DP006 | 25 | 45'900'848 | 3,4 | 7,399 | 59,19 |
| DP007 | <td> 3023'936'048 | 6,5 | 0,595 | 4,76 | |
| DP008 | 22 | 68'248'432 | 6,2 | 1,559 | 14,03 |
| DP010 | 34 | 33'156'752 | 5,6 | 1,750 | 19,25 |
| DP011 | 29 | 31'339'152 | 6 | 1,365 | 15,02 |
| DP012 | 34 | 57'594'360 | 6,3 | 3,025 | 33,28 |
| DP017 | 35 | 28'212'256 | 6 | 1,292 | 14,21 |
| DP030 | 35 | 48'007'530 | 5,6 | 2,180 | 23,98 |
| DP013 | 36 | 34'371'045 | 6,9 | 1,350 | 14,85 |
| DP014 | 35 | 21'360'060 | 7,2 | 1,270 | 13,97 |
| DP015 | 33 | 20'923'488 | 4,1 | 4,000 | 44,00 |
| DP019 | 40 | 35'431'704 | 7 | 1,670 | 18,37 |
| DP025 | 19 | 15'329'844 | 6,6 | 0,496 | 5,46 |
| DP034 | 19 | 81'522'153 | 6,4 | 4,260 | 46,86 |
| DP039 | 32 | 19'074'410 | 6,5 | 1,270 | 13,97 |
| DP040 | 44 | 31'565'630 | 5,4 | 2,300 | 25,30 |
| DP042 | 52 | 40'333'840 | 7 | 2,510 27,61 | |
| DP021 | 65 | 33'996'260 | 6,3 | 2,830 | 31,13 |
| DP023 | 19 | 19'513'310 | 5,6 | 8,250 | 90,75 |
| DP024 | 32 | 24'125'140 | 6,3 | 20,780 | 228,58 |
| DP038 | 23 | 18'306'040 | 6,6 | 11,700 | 128,70 |
| DP045 | 35 | 36'345'620 | 6,3 | 1,100 | 12,10 |
| DP033 | 42 | 26'078'550 | 6,5 | 15,380 | 169,18 |
| DP022 | 49 | 33'535'460 | 6,8 | 7,590 | 83,49 |
| DP041 | 56 | 34'899'830 | 5,7 | 3,350 | 36,85 |
| DP049 | 38 | 18'521'230 | 6,8 | 1,020 | 11,22 |
| DP028 | 32 | 16'410'670 | 5,6 | 1,720 | 18,92 |
| DP056 | 36 | 19'737'580 | 5,7 | 1,130 | 12,43 |
| DP059 | 52 | 23'376'180 | 3,6 | 7,880 | 86,68 |
| DP047 | 41 | 20'658'370 | 6,4 | 1,040 | 11,44 |
| DP036 | 23 | 8'742'390 | 3,5 | 0,950 | 10,45 |
| DP027 | 42 | 29'150'480 | 5,1 | 3,410 | 37,51 |
| DP046 | 54 | 16'800'070 | 5,3 | 8,210 | 90,31 |
| DP055 | 57 | 32'340'270 | 6,2 | 1,280 | 14,08 |
| DP064 | 74 | 41'896'460 | 6,5 | 2,440 | 26,84 |
| DP067 | 80 | 46'388'540 | 6,3 | 5,200 | 57,20 |
| média | 38 | 31'544'704 | 5,8 | 3,965 | 42,14 |
| número de ilhotas / espécime | volume de tecido recolhidos / espécime [mM 3] | RIN | ARN total [ng] | ||
| alcance | 19-80 | 8'742'390 - 81'522'153 | 3,4-7,2 | 4,76-228,58 | |
| média | 38 | 31'544'704 | 5,8 | 42,14 | |
Tabela 1. Visão Geral da quantidade de tecido microdissecado e a qualidade e quantidade do RNA extraído. Os espécimes são listados por ordem cronológica. O volume de tecido recolhido é calculada como se segue: Espessura de criocorte (10 mm) x área microdissecados [iM 2]. Um RNA uL de cada amostra foi analisada na Picochip Bioanalyzer Agilent 2100.
Figura 1. Autofluorescência intrínseca das células beta humanas autofluorescência das células beta, após a desidratação de criocortes pancreáticos com os reagentes que foram ambos mantidos a temperatura ambiente (A), ou com gelo (B) (excitação 450-490 nm, emissão 515 nm>,. 400 x ampliação). As células beta aparecer amarelo, enquanto ductos pancreáticos, vasos e colágeno exibir uma cor verde. Barra de escala: 75 ^ m.
Figura 2. Qualidade e quantidade de ARN extraído de ilhotas de perfil. De uma amostra de RNA humano ilhota obtida com este protocolo LMD (B) em comparação com uma amostra de RNA padrão (A). Um RNA uL de cada amostra foi aplicada numa Picochip e analisadas para quantity e qualidade com o Agilent 2100 Bioanalyzer. (A): RIN (RNA número integridade) 7.7 [rRNA Ratio (28S/18S): 1,3)], (B): RIN 7.2 [Proporção de rRNA (28S/18S): 1,1)]. A concentração do RNA ilhota foi de 1,3 ng / ul, para um montante total de 10,3 ng de 21'360'060 tecido pancreático mM 3. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Nós descrevemos uma abordagem confiável para a microdissecção a laser (LMD) de ilhotas de pâncreas humanos de uma amostra cirúrgica. Desde que um microscópio LMD está disponível, este procedimento poderia ser implementado em qualquer instituição de pesquisa realizando pancreatectomies parciais, aumentando assim o acesso ao material ilhota humana de ambos os não-diabéticos e diabéticos tipo 2. Isto é especialmente relevante dada a escassez de pâncreas oferecido para isolamento de ilhotas. Aspectos favoráveis de LMD comparada com o isolamento de ilhotas por digestão com colagenase são a redução do tempo entre o explante do tecido e processamento das ilhotas de extração de RNA 7, o enriquecimento de células beta 7, bem como a prevenção de manipulações mecânicas severas e enzimática 8, 9,10, o que poderia alterar o perfil de expressão do gene. No caso de pacientes parcialmente pancreatectomizado mais informação clínica e metabólica está tipicamente disponível do que no caso do órgãodoadores. Por outro lado, o isolamento de ilhotas por rendimentos LMD menos RNA com valores mais baixos RIN comparadas com as observadas após a digestão com colagenase e não fornece ilhotas de vida para os estudos funcionais. Além disso, a doença pancreática levando a cirurgia pode afectar o perfil de expressão das ilhotas. Uma avaliação equilibrada dos prós e contras será possível através de estudos comparativos sobre um grande número de isolamentos de ilhotas realizada por digestão colagenase e LMD quer a partir de doadores de órgãos ou pacientes parcialmente pancreatectomizado, tais como aqueles em andamento na Iniciativa de Medicina multicêntrico inovadora para Diabetes (IMIDIA) com o objetivo de "melhorar a função das células beta e identificação de biomarcadores de diagnóstico para monitoramento do tratamento em Diabetes" ( http://www.imidia.org ).
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Queremos agradecer a todos os nossos colegas que prestaram ajuda, conselhos e críticas de entrada em várias etapas deste projeto. Produção de vídeo deste artigo foi apoiado com recursos do IMIDIA ( http://www.imidia.org ), o Ministério alemão da Educação e Pesquisa (BMBF) para o Centro Alemão de Pesquisa do Diabetes (DZD, http://www.dzd -ev.de ) e do Hospital Universitário Carl Gustav Carus, da Universidade de Tecnologia de Dresden. Os trabalhos que conduziram a esta publicação recebeu o apoio da empresa Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores comum ao abrigo do acordo de subvenção n ° 155005 (IMIDIA), os recursos de que são compostos de contribuição financeira do Programa da União Europeia Quadro (FP7/2007-2013) e EFPIA empresas "contribuição em espécie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22x22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
