Summary
लेजर microdissection एक तकनीक है कि पैरेन्काइमा की मात्रा मिनट से चयनित कक्षों की वसूली की अनुमति देता है. यहाँ हम शल्य transcriptomic अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा नमूनों से मानव अग्नाशय islets प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हमारा प्रोटोकॉल मानव बीटा कोशिकाओं की आंतरिक autofluorescence, इस प्रकार उनके संग्रह की सुविधा में सुधार.
Protocol
1. मानव अग्नाशय के ऊतकों की ठंड
- वसा ऊतकों, रक्त वाहिकाओं, नसों और गैर parenchymal एक स्केलपेल और चिमटी के साथ ऊतक निकालें, और टुकड़े (~ 0.5-1 सेमी cubes) में अग्नाशय के ऊतकों में कटौती.
- एक Cryomold के केंद्र में एक अग्नाशय के ऊतकों टुकड़ा प्लेस, और यह ठंड ऊतक टेक अक्टूबर यौगिक के साथ पूरी तरह से कवर. नीचे पूर्व ठंडा और तरल नाइट्रोजन में तस्वीर फ्रीज दो Methylbutane के साथ कवर किया जाता है जिसका एक जार में Cryomold रखो. -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए नमूना स्टोर
2. जमे हुए धारा की तैयारी
- शाही सेना के विकृतीकरण से बचने के लिए सभी कदम भर में दस्ताने पहनें.
- साफ cryostat चाकू, नमूना धारक और ठंड 100% इथेनॉल और RNase दूर के साथ तूलिका. Cryostat अंदर जमे हुए ऊतक रखें.
- रुको जब तक ऊतक, चाकू, और ब्रश -20 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच Cryostat कक्ष के अंदर SuperFrost प्लस स्लाइड और उन्हें पूर्व शांत लेबल देर इंतज़ारके लिए ऊतक -20 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए
- टिशू टेक नमूना धारक पर अक्टूबर यौगिक लागू करते हैं और शीर्ष पर जमे हुए ऊतक जगह.
- एक बार ऊतक टेक अक्टूबर यौगिक जमे हुए है cryoblock ट्रिम और एक रेजर ब्लेड के साथ ऊतक टेक अक्टूबर परिसर के किसी भी अधिक दूर है.
- अग्नाशय के ऊतकों ब्लॉक से 40 लगातार 10 सुक्ष्ममापी स्लाइस की एक कुल कट. इसके अलावा हम एक पहली और मध्यम अग्नाशय अनुभाग कि स्लाइस भीतर microdissection प्रक्रिया के दौरान islets की पहचान कर सकते हैं सुविधा का अवलोकन चित्र के लिए बचाया जा टुकड़ा काटने की सलाह देते हैं.
- चाकू ब्लेड से प्लस एक दस्ताने के साथ कवर उंगली केवल क्षेत्र के लिए जो अनुभाग पालन करना होगा गर्म के साथ स्लाइड की पीठ को छू द्वारा SuperFrost स्लाइड के केंद्र वर्गों स्थानांतरण.
- सूखी वर्गों cryostat अंदर -20 में 1-2 मिनट डिग्री सेल्सियस, जिसके बाद आप उन्हें एक स्लाइड सूखी बर्फ पर रखा बॉक्स में डाल दिया. वर्गों स्टोर-80 डिग्री सेल्सियस
- यदि आवश्यक हो, कागज तौलिए और ठंड 100% इथेनॉल के साथ चाकू ब्लेड साफ.
3. जमे हुए अनुभागों का निर्जलीकरण
- अभिकर्मकों तैयार: 30 मिलीलीटर हौसले से तैयार 70% इथेनॉल, 30 मिलीलीटर पानी DEPC इलाज मिलीलीटर 2x30, 100% इथेनॉल और 50 मिलीलीटर Cellstar ट्यूब (फाल्कस्) में 30 मिलीलीटर xylene डालना, सर्द और बर्फ पर सभी अभिकर्मकों (xylene छोड़कर) रखना.
- 100% इथेनॉल और RNaseZAP साथ हुड के तहत काम करने की जगह साफ.
- प्रक्रिया निम्नानुसार दो cryosections: ठंड 70% इथेनॉल के बर्फ में 30 सेकंड के लिए ठीक करने के लिए, बर्फ के ठंडे पानी DEPC का इलाज में 5-6 जल्दी dips के साथ धोने, बर्फ के ठंडे 100% इथेनॉल में 1 मिनट के लिए दो बार निर्जलीकरण, xylene में 4 मिनट के लिए सेते हैं कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस), और 3-5 मिनट के लिए शुष्क हवा. Cryosections की एक और जोड़ी के साथ इस चरण को दोहराएँ.
- दो सूखे cryosections वापस सम्मिलित करने के लिए एक 50 मिलीलीटर Cellstar उन्हें प्रकाश और नमी से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे ट्यूब में वापस.
- माइक्रोस्कोप RNaseZAP साथ साफ और RoboMover में चिपकने वाला कैप माउंट.
- फ़िल्टर सेट 09 (उत्तेजना:: 450-490 एनएम, उत्सर्जन> 515 एनएम), AutoLPC मोड, 50% लेजर ऊर्जा, 65% लेजर ध्यान केंद्रित, 100% लेजर गति, 5 AutoLPC शॉट्स के बीच में दूरी सुक्ष्ममापी, 6 मीटर दूरी निम्नलिखित सेटिंग्स सेट -10,100: लाइन, ऊंचाई काम कर रहा है.
- मंच में एक स्लाइड डालें.
- सूक्ष्म दृश्य (5x या 10x लेंस) के तहत autofluorescent बीटा कोशिकाओं का पता लगाएँ.
- 40x लेंस करने के लिए स्विच, "मुक्तहस्त चयन उपकरण के साथ बीटा कोशिकाओं का चयन करें और उन्हें microdissect लेसर का उपयोग कर.
- एक AdhesiveCap में चार निर्जलित cryosections के ऊतक पर कब्जा.
टिप्पणी 1: करने के लिए एक निर्जलित cryosection के बीटा कोशिकाओं टुकड़े करना समय 10-20 मिनट से अधिक नहीं हो ऊतक वर्गों में जो नतीजा होगा पुनर्जलीकरण से बचना चाहिएगिरावट आरएनए.
2 टिप्पणी: दृश्य निरीक्षण से जांच की चौकी चरण चलती के बाद सफल microdissection प्रक्रिया को सत्यापित करने के लिए.
5. बीटा सेल microdissected समृद्ध ऊतक के lysis
- RoboMover से AdhesiveCap निकालें.
- Pipet 10 AdhesiveCap के ढक्कन और यह उल्टा 42 डिग्री पर 30 मिनट के लिए सी सेते हैं में μl निष्कर्षण बफर (XB, PicoPure शाही सेना अलगाव किट, Arcturus).
- 10,000 XG पर नीचे स्पिन और सूखी बर्फ पर lysate डाल दिया. स्टोर यह -80 डिग्री सेल्सियस तक शाही सेना निष्कर्षण प्रदर्शन किया है.
- दोहराएँ 3 कदम) 5. अन्य सभी वर्गों के साथ).
6. शाही सेना निष्कर्षण
- सभी दस 10 μl lysates जुडा
- आरएनए अलगाव के साथ PicoPure शाही सेना अलगाव किट, Arcturus के प्रोटोकॉल के अनुसार कमरे के तापमान पर काम कर रहे हैं, 70% इथेनॉल (DNase उपचार सहित) के लिए एक 1:1 अनुपात निष्कर्षण बफर (XB) का उपयोग करके आगे बढ़ें.
7. शाही सेना विश्लेषण
- गुणवत्ता और मात्रा का विश्लेषण एक Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip) का उपयोग करने के लिए 1 μl शाही सेना का प्रयोग करें. मात्रात्मक मूल्यांकन के संदर्भ में एक मानक चिप पर समानांतर में भरी हुई शाही सेना के लिए किया जाता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, dehydrating संशोधित प्रोटोकॉल पिछले प्रकाशित 6 प्रोटोकॉल की तुलना में बीटा कोशिकाओं autofluorescence के एक सुधार के लिए नेतृत्व किया. वर्णित प्रोटोकॉल लागू, 39 शल्य अग्नाशय नमूनों में से प्रत्येक 31'544'704 सुक्ष्ममापी 3 नमूना / ऊतक अग्नाशय के एक औसत (रेंज: 8'742'390 81'522'153 सुक्ष्ममापी 3) के लिए 40 धारावाहिक cryosections उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है. यह 18 के बारे में 150 मीटर व्यास के, या 35,000 β कोशिकाओं के अग्नाशय islets की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है. 38 अलग islets / अग्नाशय नमूना (सीमा: 19 - 80 islets) के एक औसत से उत्पन्न ऊतकों, जिनमें से प्रत्येक आम तौर पर दो या दो से अधिक लगातार वर्गों में मनाया गया. विभिन्न नमूनों के बीच islets की उपज में बड़ी परिवर्तनशीलता का पता लगाने में ऊतक स्रोत, या तो अग्नाशय के सिर या पूंछ, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऑपरेटरों के प्रगतिशील सुधार की विविधता को दर्शाता है10 मिनट समय के भीतर प्रत्येक अनुभाग के निरीक्षण के लिए समर्पित islets के आयन.
प्रत्येक microdissected और lysed ऊतक से कुल शाही सेना Arcturus PicoPure एप्लाइड Biosystems जमे हुए शाही सेना अलगाव किट के साथ शुद्ध किया गया था और 11 μl में eluted निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार,. प्रत्येक नमूने की 1 इसके बाद μl आरएनए Agilent 2100 Bioanalyser द्वारा विश्लेषण किया गया था. : 5.8 का एक मतलब आरएनए अखंडता (Rin) संख्या (रेंज: 3.4 - 7.2) के साथ - हम औसत 42 एनजी शाही सेना / नमूना (229 एनजी / नमूना सीमा 5) को प्राप्त चित्रा 2 शाही सेना के विश्लेषण के एक उदाहरण से पता चलता है. जो भी RIN मूल्य सभी का विश्लेषण शाही सेना के नमूने सफलतापूर्वक transcriptomic अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया. हम microdissected ऊतक की राशि और आरएनए उपज के बीच एक सीधा संबंध नहीं मिला. सर्जन द्वारा कटाई और इसकी परीक्षा और रोगविज्ञानी द्वारा रिहाई के बाद अग्नाशय नमूनों की ठंड के बीच समय अंतराल में अंतर पी में खाते सकता है चर और बरामद शाही सेना की गुणवत्ता और मात्रा के लिए कला. अन्य महत्वपूर्ण कारकों पर विचार करने के लिए लेजर ऊर्जा microdissection के लिए कम ऊर्जा उपज उच्च आरएनए अखंडता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लेजर ध्यान केंद्रित और LPC अंक की दूरी के साथ लागू कर रहे हैं. ध्यान केंद्रित आदर्श जब स्लाइड के कांच की सतह पर लेजर की एक मामूली प्रभाव ", एक छोटे से काले डॉट बनाने, देखा जा सकता है सेट कर दिया जाता है. 50% की एक लेजर ऊर्जा, 65% की एक लेजर ध्यान केंद्रित है, यद्यपि वर्गों की मोटाई में अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अनुकूलित, और 5 सुक्ष्ममापी की LPC अंक की दूरी के साथ हमारे हाथ में सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, आरएनए मात्रा रखने RoboMover का काम कर रहे ऊंचाई से अनुकूलित किया जा सकता है, यानी चिपकने वाला टोपी और अनुभाग, जितना संभव हो कम के बीच की दूरी पर कब्जा करने की प्रक्रिया के दौरान microdissected ऊतक के नुकसान से बचने के. हमारे सेट में काम ऊंचाई को -10,100 मनमाना पाम इकाइयों पर है.
| islets / नमूना की संख्या | एकत्र ऊतक मात्रा / नमूना [3 सुक्ष्ममापी] | RIN | एकाग्रता [एनजी / μl] | कुल शाही सेना [एनजी] | |
| DP002 | 34 | 24'947'696 | 5.2 | 1.149 | 10.34 |
| DP003 | 30 | 41'141'488 | 5.5 | 1.677 | 15.09 |
| DP005 | 23 | 27'024'264 | 3.5 | 8.259 | 66.07 |
| DP006 | 25 | 45'900'848 | 3.4 | 7.399 | 59.19 |
| DP007 | <td> 3023'936'048 | 6.5 | 0.595 | 4.76 | |
| DP008 | 22 | 68'248'432 | 6.2 | 1.559 | 14.03 |
| DP010 | 34 | 33'156'752 | 5.6 | 1.750 | 19.25 |
| DP011 | 29 | 31'339'152 | 6.0 | 1.365 | 15.02 |
| DP012 | 34 | 57'594'360 | 6.3 | 3.025 | 33.28 |
| DP017 | 35 | 28'212'256 | 6.0 | 1.292 | 14.21 |
| DP030 | 35 | 48'007'530 | 5.6 | 2.180 | 23.98 |
| DP013 | 36 | 34'371'045 | 6.9 | 1.350 | 14.85 |
| DP014 | 35 | 21'360'060 | 7.2 | 1.270 | 13.97 |
| DP015 | 33 | 20'923'488 | 4.1 | 4.000 | 44.00 |
| DP019 | 40 | 35'431'704 | 7.0 | 1.670 | 18.37 |
| DP025 | 19 | 15'329'844 | 6.6 | 0.496 | 5.46 |
| DP034 | 19 | 81'522'153 | 6.4 | 4.260 | 46.86 |
| DP039 | 32 | 19'074'410 | 6.5 | 1.270 | 13.97 |
| DP040 | 44 | 31'565'630 | 5.4 | 2.300 | 25.30 |
| DP042 | 52 | 40'333'840 | 7.0 | 2.510 27.61 | |
| DP021 | 65 | 33'996'260 | 6.3 | 2.830 | 31.13 |
| DP023 | 19 | 19'513'310 | 5.6 | 8.250 | 90.75 |
| DP024 | 32 | 24'125'140 | 6.3 | 20.780 | 228.58 |
| DP038 | 23 | 18'306'040 | 6.6 | 11.700 | 128.70 |
| DP045 | 35 | 36'345'620 | 6.3 | 1.100 | 12.10 |
| DP033 | 42 | 26'078'550 | 6.5 | 15.380 | 169.18 |
| DP022 | 49 | 33'535'460 | 6.8 | 7.590 | 83.49 |
| DP041 | 56 | 34'899'830 | 5.7 | 3.350 | 36.85 |
| DP049 | 38 | 18'521'230 | 6.8 | 1.020 | 11.22 |
| DP028 | 32 | 16'410'670 | 5.6 | 1.720 | 18.92 |
| DP056 | 36 | 19'737'580 | 5.7 | 1.130 | 12.43 |
| DP059 | 52 | 23'376'180 | 3.6 | 7.880 | 86.68 |
| DP047 | 41 | 20'658'370 | 6.4 | 1.040 | 11.44 |
| DP036 | 23 | 8'742'390 | 3.5 | 0.950 | 10.45 |
| DP027 | 42 | 29'150'480 | 5.1 | 3.410 | 37.51 |
| DP046 | 54 | 16'800'070 | 5.3 | 8.210 | 90.31 |
| DP055 | 57 | 32'340'270 | 6.2 | 1.280 | 14.08 |
| DP064 | 74 | 41'896'460 | 6.5 | 2.440 | 26.84 |
| DP067 | 80 | 46'388'540 | 6.3 | 5.200 | 57.20 |
| औसत | 38 | 31'544'704 | 5.8 | 3.965 | 42.14 |
| islets / नमूना की संख्या | एकत्र ऊतक मात्रा / नमूना [3 सुक्ष्ममापी] | RIN | कुल शाही सेना [एनजी] | ||
| रेंज | 19 - 80 | 8'742'390 - 81'522'153 | 3.4-7.2 | 4.76-228.58 | |
| औसत | 38 | 31'544'704 | 5.8 | 42.14 | |
तालिका 1. Microdissected ऊतक की राशि और निकाले शाही सेना की गुणवत्ता और मात्रा के अवलोकन नमूनों. Chronologically सूचीबद्ध हैं. एकत्र ऊतक मात्रा की गणना निम्न प्रकार है: की मोटाई cryosection (10 सुक्ष्ममापी) x microdissected क्षेत्र [2 सुक्ष्ममापी]. प्रत्येक नमूने के 1 μl आरएनए Agilent 2100 Bioanalyser PicoChip पर विश्लेषण किया गया था.
चित्रा 1. मानव बीटा कोशिकाओं की आंतरिक autofluorescence अभिकर्मकों जो या तो कमरे के तापमान (ए), या ठंडा (बी) (450 उत्तेजना में रखा गया था के साथ अग्नाशय cryosections के निर्जलीकरण के बाद बीटा कोशिकाओं के Autofluorescence - 490 एनएम, उत्सर्जन> 515 एनएम, 400 x ) बढ़ाई. बीटा कोशिकाओं पीले दिखाई देते हैं, जबकि अग्नाशय नलिकाएं, जहाजों और कोलेजन एक हरे रंग का प्रदर्शन. स्केल बार: 75 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2. और निकाले एक मानव आइलेट आरएनए नमूना एक मानक आरएनए नमूना (ए) की तुलना में इस LMD प्रोटोकॉल (बी) के साथ प्राप्त की आइलेट आरएनए प्रोफ़ाइल. की गुणवत्ता और मात्रा. प्रत्येक नमूने के 1 μl शाही सेना एक PicoChip पर लागू किया गया था और quantit के लिए विश्लेषणऔर Agilent 2100 Bioanalyser के साथ y गुणवत्ता. (ए): RIN (आरएनए अखंडता संख्या) 7.7 [rRNA (28S/18S) अनुपात: 1.3)]; (बी): RIN 7.2 [rRNA (28S/18S) अनुपात: 1.1)] आइलेट आरएनए की एकाग्रता 1.3 एनजी / μl था, 21'360'060 सुक्ष्ममापी 3 अग्नाशय के ऊतकों से 10.3 एनजी की कुल राशि के लिए बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम मानव islets के लेजर (LMD) शल्य अग्नाशय नमूना से microdissection के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण का वर्णन. बशर्ते कि एक LMD माइक्रोस्कोप उपलब्ध है, इस प्रक्रिया में किसी भी शोध संस्थान में आंशिक pancreatectomies प्रदर्शन लागू किया जा सकता है, जिससे दोनों गैर मधुमेह और टाइप 2 मधुमेह के विषयों से मानव आइलेट सामग्री के लिए उपयोग में वृद्धि. यह pancreata आइलेट अलगाव के लिए पेशकश की कमी को देखते हुए विशेष रूप से प्रासंगिक है. के अनुकूल पहलुओं कोलैजिनेज पाचन द्वारा आइलेट अलगाव की तुलना LMD ऊतक के explantation और आरएनए निष्कर्षण 7, बीटा कोशिकाओं के संवर्धन 7, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कठोर यांत्रिक और enzymatic 8 जोड़तोड़ के परिहार के लिए islets के प्रसंस्करण के बीच कम समय कर रहे हैं, 9,10, जो जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को बदल सकता है. आंशिक रूप से pancreatectomized रोगियों के मामले में अधिक नैदानिक और चयापचय जानकारी आम तौर पर अंग के मामले की तुलना में उपलब्ध हैदाताओं. दूसरी ओर, LMD कम पैदावार कम RIN मूल्यों के साथ शाही सेना द्वारा islets के अलगाव कोलैजिनेज पाचन के बाद मनाया उन लोगों की तुलना में और कार्यात्मक अध्ययन के लिए रहने वाले islets प्रदान नहीं करता है. इसके अलावा, अग्नाशय सर्जरी करने के लिए अग्रणी रोग आइलेट अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को प्रभावित कर सकता है. इन पेशेवरों और विपक्ष के एक संतुलित मूल्यांकन आइलेट isolations कोलैजिनेज पाचन द्वारा बाहर किए गए और अंग दाताओं या उन लोगों के लिए multicenter अभिनव चिकित्सा पहल पर जा के रूप में आंशिक रूप से pancreatectomized रोगियों से भी LMD की एक बड़ी संख्या पर तुलनात्मक अध्ययन के माध्यम से प्राप्त हो जाएगा ("सुधार बीटा सेल और मधुमेह में उपचार की निगरानी के लिए नैदानिक biomarkers के समारोह की पहचान" के लक्ष्य के साथ मधुमेह (IMIDIA) http://www.imidia.org ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम हमारे सभी साथियों को, जो इस परियोजना के विभिन्न चरणों में मदद, सलाह और महत्वपूर्ण इनपुट प्रदान शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. इस वीडियो लेख उत्पादन (IMIDIA से धन के साथ समर्थित किया गया http://www.imidia.org ), जर्मन मधुमेह अनुसंधान के लिए केंद्र (DZD, शिक्षा और अनुसंधान (BMBF) के लिए जर्मन मंत्रालय http://www.dzd ev.de ) और विश्वविद्यालय अस्पताल प्रौद्योगिकी ड्रेसडेन विश्वविद्यालय में कार्ल गुस्ताव सन्यास. इस प्रकाशन के लिए अग्रणी काम अनुदान समझौते के n ° 155,005 (IMIDIA), जो वित्तीय योगदान के यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) और EFPIA से बना रहे हैं संसाधनों के तहत अभिनव दवाओं पहल संयुक्त उपक्रम से समर्थन प्राप्त हुआ है कंपनियों के तरह के योगदान में.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22x22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
