Summary
レーザーマイクロダイセクションでは、実質の微量から選択された細胞の回復を可能にする技術です。ここでは、トランスクリプトーム研究のために使用される手術標本からヒト膵島を取得するためのプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、このように彼らのコレクションを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を向上させます。
Abstract
レーザーマイクロダイセクション（LMD）は実質1,2分の金額から選択した細胞や組織の回復を可能にする技術です。解剖した細胞は、トランスクリプトームやプロテオーム研究は、DNAや染色体分析評価2,3として調査、種々の用途に使用することができます。 LMDの特に困難なアプリケーションは、RNA 4の不安定性に起因して、細胞は、膵臓などのRNaseの豊富な組織から解剖される場合に特に顕著であることができ、トランスクリプトーム解析、です。標的細胞の迅速な識別と収集を可能に顕微解剖プロトコルは組織の処理時間を短くすると、その結果、RNAの保全性を確保するためには、この設定には不可欠です。
ここでは、トランスクリプトーム研究5に使用する手術標本からヒト膵β細胞を取得するためのプロトコルを記述します。約0.5〜cの膵臓の小片m 3をティッシュテックOCTコンパウンド、直ちに2 -メチルブタンチルドで凍結し、-80℃で保存しセクショニングまで、Cに埋め込 ま摘出膵臓標本の健康現れるマージン、から切り出した。 10μmの厚さの四連続切片1〜2分間クライオスタット内部に乾燥したガラススライドに個別に転送-20℃設定、、、下のクライオスタットでカットし、-80℃で保存した
直ちにレーザーマイクロダイセクションの手順の前に、切片を氷冷100％の2つの1分インキュベーションすることにより、氷の寒さの中に固定されたばかりの30秒間、70％エタノールを調製し、氷冷DEPC処理水で5月6日ディップで洗浄し、脱水したエタノールは4分間キシレン（組織の脱水に使用される）に続いて、組織切片を3〜5分間、その後、風乾した。重要なことは、すべての手順は、キシレン中でのインキュベーションを除いて、氷のように冷たいの試薬 を用いて行った-以前に記述されたプロトコル6以上修正。 UT氷冷試薬のilizationは、ベータ細胞の内因自家蛍光の顕著な増加をもたらした、との認識を容易にした。顕微解剖のために、4つのセクションでは、各時間脱水した：2、ホイル·ラップに入れた50 mlチューブ、湿気や漂白から組織を保護するために、残りの2は直ちに顕微解剖された。この手順は、（AutoLPC）モードに突入させた自動レーザ圧接を採用PALMマイクロビーム装置（Zeiss）を用いて行った。 40-60分よりもはや不要4凍結切片からベータ細胞/小島清の完成。細胞は1 AdhesiveCapに集め、10μlの溶解緩衝液で溶解した。トランスクリプトーム解析のために、それぞれの単一のRNA試料がピコ純粋なRNA単離キット（アルクトゥルス）を用いてRNAを抽出し、10セル顕微サンプルを結合することにより得た。このプロトコルは、このように彼らの迅速かつ正確な認識とcを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を改善ollection。この手順のさらなる改善は、2型糖尿病に伴う変化を理解するためのより良い可能性のある影響で、表現型が異なるβ細胞の解剖を可能にするかもしれません。
Protocol
1。ヒト膵臓組織の凍結
- メスとピンセットで脂肪組織、血管、神経、非実質組織を削除し、ピース（〜0.5〜1センチメートルキューブ）に膵組織を切断。
- Cryomoldの中央に1膵組織片を置き、冷たいティッシュテックOCTコンパウンドで完全にそれをカバーしています。その底液体窒素で予め冷却2 - メチルブタンとスナップ凍結で覆われている瓶にCryomoldを置く。 -80℃で凍結したサンプルを保存
2。凍結切片の作製
- RNAの変性を避けるために、すべてのステップを通して手袋を着用してください。
- アウェイ冷たい100％エタノールおよびRNaseのクライオスタットナイフ、試料ホルダーと絵筆を清掃してください。クライオスタット内部の凍結組織を置きます。
- 組織、ナイフとブラシが-20℃に到達するまで待つ待っている間にクライオスタット室の内部SuperFrostプラススライドやプレクールそれらをラベル組織は-20℃に到達するための
- 試料ホルダー上のティッシュ - Tek社のOCTコンパウンドを塗布し、上に凍結組織を置く。
- ティッシュテックOCT化合物が凍結されたらcryoblockをトリミングして、カミソリの刃で組織 - Tek社のOCT化合物の任意の過剰を取り除く。
- 膵組織ブロックから連続4010μmのスライスの合計をカット。さらに我々は、顕微解剖プロセス中にスライス内の膵島の識別を容易にすることができ膵臓セクションの概要図面用に保存される最初と中間スライスを切ることをお勧めします。
- セクションでは、厳守しなければならないための唯一の地域を暖めるために指でスライドの裏面を（手袋で覆われて）に触れることによりSuperFrostプラススライドの中央にナイフの刃からセクションを転送します。
- -20℃クライオスタット内のセクション1-2分℃、あなたがドライアイス上に置かれたスライドの箱に入れた後、乾燥させてください。セクションを保存-80℃
- 必要に応じて、紙タオルと冷たい100％エタノールでナイフの刃を清掃してください。
3。凍結切片の脱水
- 試薬の準備：30ミリリットル作りたての70％エタノール、30ミリリットルDEPC処理水、2x30ミリリットルの100％エタノールと50ミリリットルCellstarチューブ（ファルコン）に30mlのキシレンを注ぎ、寒さと氷の上に全ての試薬を（キシレンを除く）を保持します。
- 100％エタノールとRNaseZAPとボンネットの下に作業スペースを清掃してください。
- 次のようにプロセス2凍結切片は：氷冷DEPC処理水で5月6日クイックディップで洗浄し、30秒間氷冷70％エタノールで固定し、キシレン中で4分間インキュベートし、氷冷100％エタノールで1分間ずつ2回脱水室温（25℃）、3〜5分間乾燥した空気で。凍結切片の別のペアを使用してこの手順を繰り返します。
- 光や湿気から守るためにアルミホイルで包まれた50ミリリットルCellstarチューブに背中合わせに2乾燥した凍結切片を挿入します。
- RNaseZAPと顕微鏡を清掃し、RoboMoverにおける接着剤キャップを取り付けます。
- フィルタセット09（励起：450から490 nmの発光> 515 nm）を、AutoLPCモード、50％のレーザーエネルギー、65％のレーザー焦点、100％のレーザー速度、AutoLPCショット間5μmの距離、6μmの距離が次のように設定します。 -10100：行に、高さを働く。
- ステージに1スライドを挿入します。
- 顕微鏡可視化（5倍または10倍レンズ）の下で自家β細胞を見つけます。
- 40倍のレンズに切り替えて、 "フリーハンド"選択ツールを使ってβ細胞を選択し、レーザーを使用してそれらを顕微解剖。
- 1 AdhesiveCapに4脱水凍結切片の組織をキャプチャします。
コメント1：1脱水凍結切片のベータ細胞を分析する時間がもたらすであろう組織切片の水分補給を避けるために10〜20分より長くするべきではありませんRNAの分解。
コメント2：チェックポイントにステージを移動させた後、目視検査によって成功した顕微解剖プロセスを確認します。
5。マイクロダイセクションβ細胞濃縮組織の溶解
- RoboMoverからAdhesiveCapを削除します。
- AdhesiveCapの蓋と42でそれを逆さまインキュベート℃を30分間にピペットで10μlの抽出緩衝液（XB、PicoPure RNA単離キット、アークトゥルス）。
- 10,000 xgでスピンダウンし、ドライアイス上でライセートを置く。 RNA抽出が実行されるまで、それは、-80℃で保管してください。
- 手順3を繰り返します。）〜5）。他のすべてのセクションで。
6。 RNA抽出
- 全1010μlの溶解物を組み合わせる
- 70％エタノール（DNase処理を含む）に1:1の比率の抽出バッファー（XB）を使用して、PicoPure RNA単離キット、アルクトゥルスのプロトコルに応じて室温で働くことによってRNAの単離を進めてください。
7。 RNA分析
- アジレント2100 Bioanalyser（ピコチップ社）を使用して質と量の分析のために1μlのRNAを使用します。定量的評価は、チップ上で並列にロードされた標準RNAを基準に行われます。
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Representative Results
図1に示すように、修正された脱水プロトコルは、以前公表されたプロトコール6に比べてβ細胞の自家蛍光の改善につながった。記述されたプロトコルを適用すると、39外科膵臓標本のそれぞれが31'544'704μmの3組織/膵臓標本（： - 81'522'153μmの3 8'742'390範囲）の平均のための40のシリアル凍結切片を生成するために使用された表1に示すように。これは、150μmの直径の、または35000β-細胞の約18膵島のボリュームを表します。 38種類の膵島/膵臓標本の平均（範囲：19から80の小島）に由来する組織は、その各々は、通常、2つ以上の連続するセクションで観察された。異なる試料間の膵島の収量に大きなばらつきが検出における組織源、膵頭部やテールのどちらかだけでなく、オペレータの漸進的改善の不均一性を反映している各セクションの検査に専念し、10分の時間内膵島のイオン。
各顕微解剖し、溶解した組織からの全RNAを、製造業者のプロトコルに従って、アプライド·バイオシステムズのアルクトゥルスPicoPure冷凍RNA Isolation Kitで精製し、11μlの溶出した。その後、各サンプル1μlのRNAをAgilent 2100 Bioanalyserによって分析した。 5.8の平均RNA完全数（RIN）（範囲：3.4から7.2）を用いて- ：私たちは平均42 ngの/ RNA試料（229 ngの/試料5の範囲）で得られた図2は、RNA分析の例を示しています。どちらRIN値分析されたすべてのRNAサンプルが正常にトランスクリプトーム研究に使用した。我々は、顕微解剖組織の量とRNA収量との間に直接的な関係を見つけることができませんでした。外科医による収穫と病理医による検査とそのリリース後に膵臓標本の凍結の間の時間間隔の違いはpに占める可能性がある回収されたRNAの変数質と量のための芸術。考慮すべき他の重要な要因は、より高いRNAの完全性をもたらし、より低いエネルギーだけでなく、レーザー焦点とLPC点間の距離と、マイクロダイセクションに適用されるレーザーエネルギーです。小さな黒いドットを形成するスライドガラス表面上のレーザのわずかな "衝撃"は、見ることができたときにフォーカスが理想的に設定されています。セクションの厚さの違い、および5μmのLPCの点の距離を補償するように適合さにもかかわらず、我々の手で最良の結果は、50％のレーザーエネルギー、65％のレーザー焦点で達成される。さらに、RNA量がRoboMoverの作業高さを維持することによって最適化することができ、キャプチャ処理中に顕微組織の損失を避けるために、できるだけ低い接着剤のキャップと節の間の距離、 すなわち 。作業高さアップ私たちのセットで-10100任意PALMユニットである。
| 小島/標本数 | 採取した組織のボリューム/標本〔μm3] | RIN | 濃度[ng /μLの] | 全RNA [NG] | |
| DP002 | 34 | 24'947'696 | 5.2 | 1.149 | 10.34 |
| DP003 | 30 | 41'141'488 | 5.5 | 1.677 | 15.09 |
| DP005 | 23 | 27'024'264 | 3.5 | 8.259 | 66.07 |
| DP006 | 25 | 45'900'848 | 3.4 | 7.399 | 59.19 |
| DP007 | <TD> 3023'936'048 | 6.5 | 0.595 | 4.76 | |
| DP008 | 22 | 68'248'432 | 6.2 | 1.559 | 14.03 |
| DP010 | 34 | 33'156'752 | 5.6 | 1.750 | 19.25 |
| DP011 | 29 | 31'339'152 | 6.0 | 1.365 | 15.02 |
| DP012 | 34 | 57'594'360 | 6.3 | 3.025 | 33.28 |
| DP017 | 35 | 28'212'256 | 6.0 | 1.292 | 14.21 |
| DP030 | 35 | 48'007'530 | 5.6 | 2.180 | 23.98 |
| DP013 | 36 | 34'371'045 | 6.9 | 1.350 | 14.85 |
| DP014 | 35 | 21'360'060 | 7.2 | 1.270 | 13.97 |
| DP015 | 33 | 20'923'488 | 4.1 | 4.000 | 44.00 |
| DP019 | 40 | 35'431'704 | 7.0 | 1.670 | 18.37 |
| DP025 | 19 | 15'329'844 | 6.6 | 0.496 | 5.46 |
| DP034 | 19 | 81'522'153 | 6.4 | 4.260 | 46.86 |
| DP039 | 32 | 19'074'410 | 6.5 | 1.270 | 13.97 |
| DP040 | 44 | 31'565'630 | 5.4 | 2.300 | 25.30 |
| DP042 | 52 | 40'333'840 | 7.0 | 2.510 27.61 | |
| DP021 | 65 | 33'996'260 | 6.3 | 2.830 | 31.13 |
| DP023 | 19 | 19'513'310 | 5.6 | 8.250 | 90.75 |
| DP024 | 32 | 24'125'140 | 6.3 | 20.780 | 228.58 |
| DP038 | 23 | 18'306'040 | 6.6 | 11.700 | 128.70 |
| DP045 | 35 | 36'345'620 | 6.3 | 1.100 | 12.10 |
| DP033 | 42 | 26'078'550 | 6.5 | 15.380 | 169.18 |
| DP022 | 49 | 33'535'460 | 6.8 | 7.590 | 83.49 |
| DP041 | 56 | 34'899'830 | 5.7 | 3.350 | 36.85 |
| DP049 | 38 | 18'521'230 | 6.8 | 1.020 | 11.22 |
| DP028 | 32 | 16'410'670 | 5.6 | 1.720 | 18.92 |
| DP056 | 36 | 19'737'580 | 5.7 | 1.130 | 12.43 |
| DP059 | 52 | 23'376'180 | 3.6 | 7.880 | 86.68 |
| DP047 | 41 | 20'658'370 | 6.4 | 1.040 | 11.44 |
| DP036 | 23 | 8'742'390 | 3.5 | 0.950 | 10.45 |
| DP027 | 42 | 29'150'480 | 5.1 | 3.410 | 37.51 |
| DP046 | 54 | 16'800'070 | 5.3 | 8.210 | 90.31 |
| DP055 | 57 | 32'340'270 | 6.2 | 1.280 | 14.08 |
| DP064 | 74 | 41'896'460 | 6.5 | 2.440 | 26.84 |
| DP067 | 80 | 46'388'540 | 6.3 | 5.200 | 57.20 |
| 平均 | 38 | 31'544'704 | 5.8 | 3.965 | 42.14 |
| 小島/標本数 | 採取した組織のボリューム/標本〔μm3] | RIN | 全RNA [NG] | ||
| 範囲 | 19から80 | 8'742'390 - 81'522'153 | 3.4から7.2 | 4.76から228.58 | |
| 平均 | 38 | 31'544'704 | 5.8 | 42.14 | |
表1。顕微組織の量と抽出されたRNAの質と量の概要。標本は順に表示されます。採取した組織の体積は次のように計算されます凍結切片の厚さ（10ミクロン）×顕微面積〔μm2]。各サンプル1μlのRNAはAgilentの2100 Bioanalyserのピコチップ上で分析した。
図1。ヒトβ細胞の内因自家蛍光どちら室温（）、または氷のように冷たい（B）（励起450で保持した試薬を用いた膵臓凍結切片の脱水後のβ細胞の自己蛍光- 490 nmの発光> 515 nmで、400 X倍率）。膵管、血管やコラーゲンが緑の色を表示するのに対し、ベータ細胞は、黄色に見える。スケールバー：75μmである。
図2。標準RNA試料（）に比べて、このLMDプロトコル（B）で得られたヒト膵島RNAサンプルの抽出されたRNAの小島。プロフィールの質と量 。各サンプル1μlのRNAがピコチップ上に塗布し、quantitについて分析したAgilentの2100 Bioanalyserとyと品質。 （）：RIN（RNAの完全数）7.7 [rRNAの比（28S/18S）：1.3）]、（B）：RIN 7.2 [rRNAの比（28S/18S）：1.1）]。膵島RNAの濃度は21'360'060μmの3膵組織から10.3 ngの総量に対して、1.3 ng /μlにしました。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
我々は外科膵臓検体からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクション（LMD）のための信頼できるアプローチについて説明します。 LMD顕微鏡が利用可能な場合、この手順は、これにより、両方の非糖尿病と2型糖尿病患者からのヒト膵島材料へのアクセスを増加させる、部分的pancreatectomiesを実行する任意の研究機関で実施されることができる。これは、膵島単離のために提供膵臓の不足与えられた特に関連している。の有利な側面がコラゲナーゼ消化によって膵島単離に比べLMDは組織の外植及びRNA抽出7、β細胞の濃縮7と同様、過酷な機械的および酵素的操作、8の回避のための膵島の処理との間に時間が短縮され、遺伝子発現プロファイルを変えることができる9,10、。部分的に膵臓を摘出された患者の場合にはより多くの臨床と代謝情報は、臓器の場合よりも一般的に利用可能ですドナー。一方、下RIN値とLMD利回り少ないRNAによる膵島の単離は、コラゲナーゼ消化後に観察されたものと比較して機能的な研究のための生きている島を提供していません。また、手術に至る膵臓病、膵島発現プロファイルに影響を及ぼす可能性があります。これらの長所と短所のバランスの取れた評価は、コラゲナーゼ消化によって行わ膵島の単離、多数の比較研究を通して達成可能と臓器提供者またはそのようなために多施設共同革新的医学イニシアティブで継続しているもののような部分的に膵臓を摘出された患者は、いずれかからLMDます（ "糖尿病の治療のモニタリングのための診断バイオマーカーの改善β細胞機能と識別"することを目的とした糖尿病（IMIDIA） http://www.imidia.org ）。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々はこのプロジェクトのさまざまな段階でのヘルプ·アドバイス·クリティカルな入力を提供したすべての仲間たちに感謝したいと思います。このビデオ物品の生産はIMIDIA（からの資金でサポートされていましたhttp://www.imidia.org ）、教育と研究のためのドイツ語省（BMBF）は糖尿病研究（DZD、のためのドイツ語センターへhttp://www.dzd -ev.de ）技術ドレスデン大学の大学病院カール·グスタフ·カールス。本書につながる仕事は助成合意N°155005（IMIDIA）、欧州連合（EU）の第7次フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）とEFPIAから財政的な貢献で構成されているそのうちの資源の下で革新的な医薬品·イニシアティブの共同事業からの支援を受けている企業の現物出資インチ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22x22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
