Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Улучшенный протокол для лазерных микродиссекции человека панкреатических островков от хирургических образцах

doi: 10.3791/50231 Published: January 6, 2013

Summary

Лазерная микродиссекции является метод, который позволяет восстановление выделенных ячеек незначительное количество паренхимы. Здесь мы опишем протокол для приобретения человеческих панкреатических островков из операционного материала, который будет использоваться для транскриптомных исследований. Наш протокол улучшает внутреннее аутофлюоресценции человека бета-клетки, способствуя тем самым их коллекции.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Замораживание человеческих тканей поджелудочной железы

  1. Удалить жировой ткани, кровеносные сосуды, нервы и не паренхиматозной ткани с помощью скальпеля и пинцета, и сократить ткани поджелудочной железы на куски (~ 0.5-1 кубов см).
  2. Поместите один кусок ткани поджелудочной железы в центре Cryomold, и покроют его полностью с холодным Tissue-Tek соединение октября Положить Cryomold в банку, дно которой покрыто предварительно охлажденный 2-метилбутан и оснастки замораживание в жидком азоте. Хранить замороженные образцы при -80 ° C.

2. Подготовка замороженных срезов

  1. Надевайте перчатки во все меры, чтобы избежать денатурации РНК.
  2. Очистите криостата нож, держатель образца и кисть с холодными 100% этанола и РНКазы в гостях. Поместите замороженные ткани внутри криостата.
  3. Подождите, пока ткань, нож и щеточка достигают -20 ° C. Этикетка SuperFrost Plus слайдов и предварительно охладить их внутри криостата камере в ожиданиидля тканей достичь -20 ° C.
  4. Применить Tissue-Tek октября Соединение на держатель образца и поместить замороженной ткани на вершине.
  5. После того, Tissue-Tek октября Соединение заморожен обрезать cryoblock и удалите излишки Tissue-Tek соединение октября с лезвием бритвы.
  6. Вырезать в общей сложности 40 последовательных 10 мкм кусочки от блока ткани поджелудочной железы. Кроме того, мы рекомендуем резки начального и среднего среза должны быть сохранены для обзора рисунков поджелудочной железы раздел, который может способствовать выявлению островки в пределах ломтики во время микродиссекции процесса.
  7. Передача секций от лезвия ножа в центре SuperFrost Plus слайдов, нажав на обратной стороне слайда пальцем (покрытые перчатки), чтобы разогреться только региона, к которому разделе будем придерживаться.
  8. Высушите разделах 1-2 мин внутри криостата при температуре -20 ° C, после чего положить их в коробку слайдов размещены на сухом льду. Хранить разделахпри -80 ° C.
  9. Если необходимо, протрите лезвие ножа с бумажными полотенцами и холодным 100% этанола.

3. Обезвоживание замороженных срезов

  1. Подготовка реагентов: налить 30 мл свежеприготовленного 70% этанола, 30 мл DEPC обработанной воды, 2x30 мл 100% этанола и 30 мл ксилола в 50 мл пробирки Cellstar (Соколов); холод и держать все реагенты (за исключением ксилола) на льду.
  2. Очистите рабочее пространство под капотом со 100% этанола и RNaseZAP.
  3. Процесс две cryosections следующим образом: закрепить в ледяной 70% этанола в течение 30 сек, промыть 5-6 быстрых провалов в ледяную DEPC обработанной воды, обезвоживают в два раза в течение 1 мин в ледяной 100% этанола, инкубировать в течение 4 мин в ксилоле при комнатной температуре (25 ° C), и сухой воздух в течение 3-5 мин. Повторите этот шаг с другой парой cryosections.
  4. Вставьте две сушеные cryosections спина к спине в 50 мл Cellstar трубка обернута алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света и влаги.
<р = класса "jove_title"> 4. Лазерная Microdissection бета-клеток с PALM Microbeam, Zeiss

  1. Очистите микроскоп с RNaseZAP и смонтировать клей Cap в RoboMover.
  2. Установить следующие параметры: набор фильтров 09 (возбуждение: 450-490 нм, эмиссия> 515 нм), AutoLPC режиме, 50% лазерной энергии, 65% лазерного фокуса, 100% лазерная скорости, 5 мкм, расстояние между AutoLPC выстрелов, 6 мкм расстоянии к линии, рабочая высота: -10100.
  3. Вставьте один слайд на сцене.
  4. Найдите аутофлуоресцентной бета-клетки под микроскопом визуализации (5x или 10x объектив).
  5. Переключитесь на 40x объектив, выберите бета-клеток с "Freehand" Выбор инструмента и microdissect их с помощью лазера.
  6. Захват ткани из четырех обезвоженной cryosections в одном AdhesiveCap.
    Комментарий 1: время, чтобы рассекать бета-клеток одного обезвоженной cryosection не должна быть больше, чем 10-20 минут, чтобы избежать регидратации срезов тканей, которое может привести вДеградации РНК.
    Комментарий 2: проверить успешность процесса микродиссекции путем визуального осмотра после переезда на сцену, чтобы контрольно-пропускной пункт.

5. Лизис микродиссекции Beta Ткань сотовый Обогащенный

  1. Снимите AdhesiveCap от RoboMover.
  2. Внесите 10 мкл буфера для экстракции (ВБ, PicoPure выделения РНК Kit, Arcturus) в крышку AdhesiveCap и инкубировать ее вверх дном при 42 ° С в течение 30 мин.
  3. Спином вниз на 10000 XG и поставить лизат на сухом льду. Хранить при температуре -80 ° C до выделения РНК выполняют.
  4. Повторите шаги 3.) До 5.) Со всеми другими разделами.

6. Экстракция РНК

  1. Смешайте все десять 10 мкл лизатов
  2. Приступить к изоляции РНК, работая при комнатной температуре в соответствии с протоколом PicoPure выделения РНК Kit, Арктур, используя Добыча соотношении 1:1 Buffer (ВБ) до 70% этанола (в том числе лечение ДНКазой).

7. Анализ РНК

  1. Используйте 1 мкл РНК для анализа качества и количества использованием Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). Количественная оценка делается по отношению к стандартным РНК загружается параллельно на чипе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Как показано на рисунке 1, модифицированный протокол обезвоживания привели к улучшению бета автофлуоресценции клеток по сравнению с предыдущим опубликован протокол 6. Применение описанного протокола, каждый из 39 хирургических образцах поджелудочной железы был использован для создания 40 последовательных cryosections в среднем 31'544'704 мкм 3 ткани / поджелудочной железы образца (диапазон: 8'742'390 - 81'522'153 мкм 3) Как показано в таблице 1. Это представляет собой объем около 18 панкреатических островков 150 мкм в диаметре, или в 35000 β-клеток. Ткани возник в среднем от 38 различных островках / поджелудочной железы образца (диапазон: 19 - 80 островков), каждый из которых обычно наблюдается в двух или более последовательных секций. Большая изменчивость урожайности островки среди различных образцов отражает неоднородность ткани источника, либо головки поджелудочной железы или хвоста, а также постепенное улучшение операторов в обнаруживатьионный островков в течение 10 мин времени, затрачиваемого на проверку каждого раздела.

Всего РНК из каждого микродиссекции и лизису ткани очищают с Арктура PicoPure Frozen РНК изоляции Комплект Applied Biosystems и элюировали в 11 мкл, в соответствии с протоколом производителя. Впоследствии 1 мкл РНК каждого образца анализировали с помощью Agilent 2100 Bioanalyser. Мы получили в среднем 42 нг РНК / образца (диапазон: 5 - 229 нг / образца) со средним целостность РНК номер (РИН) от 5,8 (диапазон: 3,4 - 7,2). Рисунке 2 показан пример анализа РНК. Какой бы значения RIN всех проанализированных образцов РНК были успешно использованы для транскриптомных исследований. Мы не нашли прямой связи между количеством микродиссекции тканей и выход РНК. Различия в промежуток времени между уборке хирургов и замораживание поджелудочной железы образцов после его рассмотрения и освобождение от патологоанатом может составить в р Искусство для переменного количества и качества восстановленных РНК. Другие ключевые факторы, чтобы рассмотреть лазерная энергия применяется для микродиссекции, с меньшей энергией получая высшее РНК целостности, а также лазерный фокус и расстояние LPC пунктов. В центре внимания идеально расположен, когда небольшое "воздействие" лазера на поверхности стекла слайд, образуя маленькую черную точку, можно увидеть. В наших руках лучшие результаты достигаются при использовании лазерной энергии на 50%, лазерный фокус на 65%, хотя и адаптированы для компенсации разницы в толщине секций, а расстояние LPC пункта 5 мкм. Кроме того, количество РНК может быть оптимизирована за счет поддержания рабочей высоты RoboMover, т. е. расстояние между клеем крышку и раздела, как можно ниже, чтобы избежать потери микродиссекции ткани во время процесса захвата. В нашем создана рабочая высота при -10 100 условных единиц PALM.

LL "> образца <TD> 30
Количество островков / образца Объем собранной ткани / образца [мкм 3] RIN Концентрация [нг / мкл] общей РНК [нг]
DP002 34 24'947'696 5,2 1,149 10,34
DP003 30 41'141'488 5,5 1,677 15,09
DP005 23 27'024'264 3,5 8,259 66,07
DP006 25 45'900'848 3,4 7,399 59,19
DP007 23'936'048 6,5 0,595 4,76
DP008 22 68'248'432 6,2 1,559 14,03
DP010 34 33'156'752 5,6 1,750 19,25
DP011 29 31'339'152 6,0 1,365 15,02
DP012 34 57'594'360 6,3 3,025 33,28
DP017 35 28'212'256 6,0 1,292 14,21
DP030 35 48'007'530 5,6 2,180 23,98
DP013 36 34'371'045 6,9 1,350 14,85
DP014 35 21'360'060 7,2 1,270 13,97
DP015 33 20'923'488 4,1 4,000 44,00
DP019 40 35'431'704 7,0 1,670 18,37
DP025 19 15'329'844 6,6 0,496 5,46
DP034 19 81'522'153 6,4 4,260 46,86
DP039 32 19'074'410 6,5 1,270 13,97
DP040 44 31'565'630 5,4 2,300 25,30
DP042 52 40'333'840 7,0 2,510 27,61
DP021 65 33'996'260 6,3 2,830 31,13
DP023 19 19'513'310 5,6 8,250 90,75
DP024 32 24'125'140 6,3 20,780 228,58
DP038 23 18'306'040 6,6 11,700 128,70
DP045 35 36'345'620 6,3 1,100 12,10
DP033 42 26'078'550 6,5 15,380 169,18
DP022 49 33'535'460 6,8 7,590 83,49
DP041 56 34'899'830 5,7 3,350 36,85
DP049 38 18'521'230 6,8 1,020 11,22
DP028 32 16'410'670 5,6 1,720 18,92
DP056 36 19'737'580 5,7 1,130 12,43
DP059 52 23'376'180 3,6 7,880 86,68
DP047 41 20'658'370 6,4 1,040 11,44
DP036 23 8'742'390 3,5 0,950 10,45
DP027 42 29'150'480 5,1 3,410 37,51
DP046 54 16'800'070 5,3 8,210 90,31
DP055 57 32'340'270 6,2 1,280 14,08
DP064 74 41'896'460 6,5 2,440 26,84
DP067 80 46'388'540 6,3 5,200 57,20
средний 38 31'544'704 5,8 3,965 42,14
Количество островков / образца Объем собранной ткани / образца [мкм 3] RIN общей РНК [нг]
диапазон 19 - 80 8'742'390 - 81'522'153 3,4 - 7,2 4,76 - 228,58
средний 38 31'544'704 5,8 42,14

Таблица 1. Обзор количество микродиссекции ткани и качество и количество добываемой РНК. Образцов перечислены в хронологическом порядке. Собранные ткани объем рассчитывается следующим образом: толщина cryosection (10 мкм) х микродиссекции области [мкм 2]. 1 мкл РНК каждый образец был проанализирован на Agilent 2100 Bioanalyser PicoChip.

Рисунок 1. Внутренняя аутофлюоресценции человека бета-клетки аутофлуоресцентной бета-клеток после обезвоживания поджелудочной железы cryosections с реагентами, которые были либо храниться при комнатной температуре (A), или ледяного (B) (возбуждение 450 - 490 нм, эмиссия> 515 нм;. 400 х увеличение). Бета клетки появляются желтые, в то время как протоках поджелудочной железы, сосуды и коллаген отображения зеленый цвет. Шкала бар: 75 мкм.

Рисунок 2
Рисунок 2. Качество и количество добываемого островок РНК. Профиль человека островок РНК образца, полученного с этим LMD протокола (B) по сравнению со стандартным образцом РНК (A). 1 мкл РНК каждого образца наносят на PicoChip и анализировали на quantitу и качества с Agilent 2100 Bioanalyser. (A): RIN (РНК целостность числа) 7,7 [рРНК Ratio (28S/18S): 1,3)]; (B): RIN 7.2 [рРНК Ratio (28S/18S): 1,1)]. Концентрация островок РНК составляет 1,3 нг / мл, на общую сумму в 10,3 нг от 21'360'060 мкм 3 ткани поджелудочной железы. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мы описываем надежный подход для лазерных микродиссекции (LMD) человеческих островков от хирургического образца поджелудочной железы. При условии, что LMD микроскопа доступно, эта процедура может быть реализована в любой научно-исследовательского учреждения выполнения частичного pancreatectomies, тем самым увеличивая доступ к человеческому материалу островок из обоих, не страдающих диабетом и сахарным диабетом 2 типа субъектов. Это особенно актуально, учитывая недостаток pancreata предлагаемых для островок изоляции. Благоприятные аспекты LMD по сравнению с островком изоляции коллагеназы пищеварения являются сокращение времени между эксплантации тканей и обработки островки для выделения РНК 7, обогащение бета-клеток 7, а также во избежание жесткой механической и ферментативной манипуляций 8, 9,10, которая может изменить профиль экспрессии генов. В случае частичного pancreatectomized пациентов более клинических и метаболических информации, как правило, доступны, чем в случае органдонорами. С другой стороны, изоляция из островков от LMD дает меньше РНК с более низкими значениями RIN по сравнению с теми наблюдается после коллагеназы пищеварению и не дает жизни островки для функциональных исследований. Кроме того, заболевания поджелудочной железы, ведущие к операции может повлиять на островке профиль экспрессии. Сбалансированная оценка этих плюсов и минусов будет достижимо с помощью сравнительного исследования большого количества островков изоляции осуществляется коллагеназы пищеварения и LMD либо из доноров органов или частично pancreatectomized пациентов, таких как текущие в многоцентровых Инновационные инициативы медицины для Диабет (IMIDIA) с целью «улучшения бета-клеток и определение диагностических биомаркеров для контроля лечения при сахарном диабете" ( http://www.imidia.org ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы хотим поблагодарить всех наших коллег, которые предоставили помощь, советы и критические входа на различных этапах этого проекта. Производство этого видео статьи была поддержана за счет средств IMIDIA ( http://www.imidia.org ), немецкого министерства образования и научных исследований (BMBF) к немецким центром исследований диабета (DZD, http://www.dzd -ev.de ) и Университетской больницы Карл Густав Карус в Технологическом университете Дрездена. Работы, ведущей к данной публикации получило поддержку со стороны Инновационные инициативы лекарственных средств совместного проекта по гранту соглашения N ° 155005 (IMIDIA), ресурсы которого состоят из финансового вклада Седьмой рамочной Европейского Союза, Программы (FP7/2007-2013) и EFPIA компаний в натуральном выражении.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26, (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33, (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53, (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53, (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7, (1), e30415 (2012).
Улучшенный протокол для лазерных микродиссекции человека панкреатических островков от хирургических образцах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).More

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter