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Medicine

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

doi: 10.3791/50231 Published: January 6, 2013

Summary

Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.

Abstract

Microdisección por láser (LMD) es una técnica que permite la recuperación de células y tejidos seleccionados de pequeñas cantidades de parénquima 1,2. Las células disecadas se puede utilizar para una variedad de investigaciones, tales como transcriptomic estudios o proteómica o análisis de evaluación de ADN cromosómico de 2,3. Una aplicación especialmente difícil de LMD es el análisis de transcriptoma, que, debido a la labilidad del ARN 4, puede ser particularmente importante cuando las células se disecan a partir de tejidos que son ricos de RNasas, tales como el páncreas. Un protocolo de microdisección que permite una rápida identificación y colección de las células diana es esencial en este contexto con el fin de acortar el tiempo de la manipulación de tejidos y, en consecuencia, para garantizar la conservación de ARN.

Aquí se describe un protocolo para la obtención humanos las células beta pancreáticas a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para los estudios de transcriptomic 5. Pequeños trozos de páncreas de aproximadamente 0.5-1 c3 m se cortaron de los márgenes sanos que aparecen de páncreas especímenes resecados, embebidos en Tissue-Tek compuesto OCT, se congeló inmediatamente en 2-metilbutano enfriado, y se almacenó a -80 ° C hasta el corte. Cuarenta secciones en serie de 10 m de espesor se cortaron en un criostato en virtud de un ajuste de -20 ° C, se transfirieron individualmente a portaobjetos de vidrio, se seca el interior del criostato durante 1-2 min, y se almacenaron a -80 ° C.

Inmediatamente antes de que el procedimiento de microdisección por láser, las secciones fueron fijadas en hielo frío, recién preparada 70% de etanol durante 30 segundos, se lavó por 5-6 inmersiones en hielo frío agua tratada con DEPC, y se deshidrató por dos incubaciones de un minuto en hielo frío 100% etanol seguido de xileno (que se utiliza para la deshidratación de los tejidos) durante 4 min; secciones de tejido fueron entonces secados al aire después de 3-5 min. Es importante destacar que todas las etapas, excepto la incubación en xileno, se realizaron con reactivos de agua helada - una modificación más de un protocolo descrito previamente 6. Utahilization de reactivos de hielo frío resultó en un aumento pronunciado de la autofluorescencia intrínseca de las células beta, y facilitar su reconocimiento. Para la microdisección, cuatro secciones se deshidrataron cada vez: dos fueron colocados en un tubo de ml envueltas en papel aluminio 50, para proteger el tejido de la humedad y el blanqueo; los dos restantes se microdissected inmediatamente. Este procedimiento se realizó con un PALM MicroBeam instrumento (Zeiss) que utiliza el láser de presión automático Catapulting (AutoLPC) de modo. La finalización de las células beta / islotes disección a partir de cuatro secciones criogénicas requeridos no más de 40-60 min. Las células se recogen en una AdhesiveCap y se lisaron con 10 l de tampón de lisis. Cada espécimen único ARN para el análisis transcriptomic se obtuvo mediante la combinación de 10 muestras de células microdisecadas, seguido de extracción de ARN usando el Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Este protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su reconocimiento rápido y preciso y collection. Nuevas mejoras en este procedimiento podría permitir la disección de las células beta fenotípicamente diferentes, con posibles consecuencias para la mejor comprensión de los cambios asociados con la diabetes tipo 2.

Protocol

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1. La congelación de tejido pancreático humano

  1. Quitar el tejido adiposo, vasos sanguíneos, nervios y tejido no parenquimatoso con un bisturí y pinzas, y cortar el tejido pancreático en trozos (cubos ~ 0.5-1 cm).
  2. Colocar una pieza de tejido pancreático en el centro de un criomolde, y se cubre completamente con frío Tissue-Tek Compuesto octubre Ponga el criomolde en un frasco cuya parte inferior está cubierta con pre-enfriado 2-metilbutano y complemento de congelación en nitrógeno líquido. La tienda de la muestra congelada a -80 ° C.

2. Preparación de secciones congeladas

  1. Use guantes durante todas las medidas necesarias para evitar la desnaturalización del ARN.
  2. Limpie el cuchillo criostato, portamuestras y el pincel con etanol frío al 100% y RNasa Away. Coloque el tejido congelado dentro del criostato.
  3. Espere hasta que el tejido, un cuchillo y un cepillo llegar a -20 º C. Etiquetar el SuperFrost Plus diapositivas y preenfriar ellos dentro de la cámara del criostato a la esperapara el tejido para llegar a -20 ° C.
  4. Aplique el compuesto Tissue-Tek PTU en el soporte de la muestra y coloque el tejido congelado en la parte superior.
  5. Una vez que el compuesto Tissue-Tek OCT se congelaron recortar el cryoblock y eliminar cualquier exceso de compuesto Tissue-Tek OCT con una hoja de afeitar.
  6. Cortar un total de 40 consecutivos 10 rebanadas mu m del bloque de tejido pancreático. Adicionalmente se recomienda cortar una rebanada primer y segundo para ser salvo para los dibujos de vista general de la sección del páncreas que puede facilitar la identificación de islotes dentro de los cortes durante el proceso de microdisección.
  7. Transferir las secciones de la hoja del cuchillo en el centro de un SuperFrost Plus presentación al tocar la parte trasera de la corredera con el dedo (cubierta con un guante) para calentar sólo la región a la que la sección se adhieren.
  8. Seque el min secciones 1-2 dentro del criostato a -20 ° C, después de lo cual los pone en una caja de portaobjetos se colocaron en hielo seco. Almacene las seccionesa -80 º C.
  9. Si es necesario, limpie la hoja del cuchillo con toallas de papel y etanol frío al 100%.

3. Deshidratación de las secciones congeladas

  1. Preparar los reactivos: verter 30 ml de etanol recién preparada 70%, 30 ml de agua tratada con DEPC, 2x30 ml de etanol 100% y 30 ml de xileno en 50 ml tubos Cellstar (Falcons), frío y mantener todos los reactivos (excepto xileno) en hielo.
  2. Limpie el área de trabajo bajo el capó con 100% de etanol y RNaseZAP.
  3. Proceso de dos secciones criogénicas como sigue: fijar en hielo etanol frío al 70% durante 30 s, se lava con 5-6 inmersiones rápidas en hielo frío agua tratada con DEPC, se deshidrata dos veces durante 1 min en hielo frío etanol 100%, incubar durante 4 min en xileno a temperatura ambiente (25 ° C) y secar al aire durante 3-5 min. Repita este paso con otro par de secciones criogénicas.
  4. Insertar dos secciones criogénicas secas espalda con espalda en un tubo de 50 ml Cellstar envuelto con papel de aluminio para protegerlo de la luz y la humedad.
<p class = "jove_title"> 4. Microdisección láser de las células beta con PALM MicroBeam, Zeiss

  1. Limpie el microscopio con RNaseZAP y montar la tapa adhesiva en la RoboMover.
  2. Establezca los siguientes ajustes: conjunto de filtros 09 (excitación: 450-490 nm, emisión> 515 nm), el modo AutoLPC, el 50% de la energía láser, el 65% de enfoque láser, 100% de velocidad láser, 5 m distancia entre disparos AutoLPC, 6 m distancia a la línea, altura de trabajo: -10.100.
  3. Inserte una diapositiva en el escenario.
  4. Localizar las células beta autofluorescentes bajo visualización microscópica (5x o 10x).
  5. Cambie a la lente de 40x, seleccionar las células beta con la herramienta de selección "Mano alzada" y microdissect utilizando el láser.
  6. Capturar el tejido de cuatro secciones criogénicas deshidratados en una AdhesiveCap.
    Comentario 1: el tiempo necesario para analizar las células beta de un criosección deshidratada no deberá ser superior a 10-20 minutos para evitar la rehidratación de las secciones de tejido que daría lugar aLa degradación del ARN.
    Comentario 2: verificar exitoso proceso de microdisección mediante inspección visual después de mover el escenario para el punto de control.

5. La lisis de las células del tejido microdissected Beta enriquecido

  1. Retire el AdhesiveCap del RoboMover.
  2. Pipetear 10 l de tampón de extracción (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) en la tapa de la AdhesiveCap e incubar en posición invertida a 42 ° C durante 30 min.
  3. Centrifugue a 10.000 xg y poner el lisado en hielo seco. Almacénelo a -80 ° C hasta la extracción de ARN se lleva a cabo.
  4. Repita los pasos 3.) A 5.) Con todas las otras secciones.

6. La extracción de RNA

  1. Combine los diez lisados ​​10 mu l
  2. Proceder con el aislamiento de ARN, trabajando a temperatura ambiente de acuerdo con el protocolo de la PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus, usando una proporción de 1:1 tampón de extracción (XB) a 70% de etanol (incluyendo tratamiento con DNasa).

7. Análisis de ARN

  1. Utilice un ARN l durante el análisis de la calidad y cantidad por medio de un Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). La evaluación cuantitativa se realiza en referencia a un RNA estándar cargados en paralelo en el chip.

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Representative Results

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Como se muestra en la Figura 1, el protocolo modificado de deshidratación conduce a una mejora de la autofluorescencia células beta en comparación con el anterior protocolo publicado 6. Aplicando el protocolo descrito, cada una de 39 muestras pancreáticas quirúrgicas se utilizó para generar 40 criosecciones en serie para un promedio de 3 micras 31'544'704 tejido / muestra de páncreas (rango: 8'742'390 - 81'522'153 m 3) como se muestra en la Tabla 1. Esto representa el volumen de aproximadamente 18 islotes pancreáticos de 150 m de diámetro, o de 35.000 células β. El tejido se originó a partir de una media de 38 islotes / muestra diferentes pancreático (rango: 19 a 80 islotes), cada uno de los cuales se observó típicamente en dos o más secciones consecutivas. La gran variabilidad en el rendimiento de islotes entre los diferentes especímenes refleja la heterogeneidad de la fuente de tejidos, ya sea la cabeza o la cola del páncreas, así como el mejoramiento progresivo de los operadores en la detección deion de los islotes en el tiempo de 10 min dedicado a la inspección de cada sección.

El ARN total de cada tejido microdissected y lisadas se purificó con el Kit de Aislamiento Arcturus PicoPure Frozen ARN de Applied Biosystems y se eluyó en 11 l, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, el ARN 1 l de cada muestra fue analizada por el Agilent 2100 Bioanalyser. Se obtuvo una media de ARN 42 ng / muestra (rango: 5 a 229 ng / muestra) con un número promedio de integridad del ARN (RIN) de 5,8 (intervalo: 3,4 a 7,2). Figura 2 muestra un ejemplo del análisis de ARN. Cualquiera que sea el valor de todas las RIN analizaron muestras de ARN se utiliza con éxito para transcriptomic estudios. No se encontró una relación directa entre la cantidad de tejido microdissected y el rendimiento de ARN. Las diferencias en el intervalo de tiempo entre la recolección de los cirujanos y la congelación de las muestras de páncreas después de su examen y la liberación por parte del patólogo podría explicar en p arte para la calidad variable y la cantidad de ARN recuperado. Otros factores clave a considerar son la energía del láser aplicado para microdisección, con la menor energía produciendo la mayor integridad del ARN, así como el enfoque de láser y la distancia de los puntos de LPC. El foco está muy bien situado en un ligero "impacto" del láser sobre la superficie de cristal de la tapa, formando un pequeño punto negro, se pueden ver. En nuestras manos los mejores resultados se consiguen con una energía láser de 50%, un enfoque de láser de 65%, aunque adaptados para compensar las diferencias en el espesor de las secciones, y una distancia de puntos de LPC de 5 micras. Además, la cantidad de ARN se puede optimizar al mantener la altura de trabajo de la RoboMover, es decir, la distancia entre la tapa y la sección adhesiva, tan bajo como sea posible para evitar la pérdida de tejido microdiseccionado durante el proceso de captura. En nuestra serie hasta la altura de trabajo es de -10.100 unidades PALM arbitrarias.

ll "> espécimen <td> 30
número de islotes / espécimen tejido recolectado de volumen / ejemplar [m 3] RIN concentración [ng / l] ARN total [ng]
DP002 34 24'947'696 5,2 1,149 10,34
DP003 30 41'141'488 5,5 1,677 15,09
DP005 23 27'024'264 3,5 8,259 66,07
DP006 25 45'900'848 3,4 7,399 59,19
DP007 23'936'048 6,5 0,595 4,76
DP008 22 68'248'432 6,2 1,559 14,03
DP010 34 33'156'752 5,6 1,750 19,25
DP011 29 31'339'152 6.0 1,365 15,02
DP012 34 57'594'360 6,3 3,025 33,28
DP017 35 28'212'256 6.0 1,292 14,21
DP030 35 48'007'530 5,6 2,180 23,98
DP013 36 34'371'045 6,9 1,350 14,85
DP014 35 21'360'060 7,2 1,270 13,97
DP015 33 20'923'488 4,1 4,000 44,00
DP019 40 35'431'704 7.0 1,670 18,37
DP025 19 15'329'844 6,6 0,496 5,46
DP034 19 81'522'153 6,4 4,260 46,86
DP039 32 19'074'410 6,5 1,270 13,97
DP040 44 31'565'630 5,4 2,300 25,30
DP042 52 40'333'840 7.0 2,510 27,61
DP021 65 33'996'260 6,3 2,830 31,13
DP023 19 19'513'310 5,6 8,250 90,75
DP024 32 24'125'140 6,3 20,780 228,58
DP038 23 18'306'040 6,6 11,700 128,70
DP045 35 36'345'620 6,3 1,100 12,10
DP033 42 26'078'550 6,5 15,380 169,18
DP022 49 33'535'460 6,8 7,590 83,49
DP041 56 34'899'830 5,7 3,350 36,85
DP049 38 18'521'230 6,8 1,020 11,22
DP028 32 16'410'670 5,6 1,720 18,92
DP056 36 19'737'580 5,7 1,130 12,43
DP059 52 23'376'180 3,6 7,880 86,68
DP047 41 20'658'370 6,4 1,040 11,44
DP036 23 8'742'390 3,5 0,950 10,45
DP027 42 29'150'480 5,1 3,410 37,51
DP046 54 16'800'070 5,3 8,210 90,31
DP055 57 32'340'270 6,2 1,280 14,08
DP064 74 41'896'460 6,5 2,440 26,84
DP067 80 46'388'540 6,3 5,200 57,20
promedio 38 31'544'704 5,8 3,965 42,14
número de islotes / espécimen tejido recolectado de volumen / ejemplar [m 3] RIN ARN total [ng]
alcance 19 a 80 8'742'390 - 81'522'153 3,4 a 7,2 4,76 hasta 228,58
promedio 38 31'544'704 5,8 42,14

Tabla 1. Descripción general de la cantidad de tejido microdiseccionado y la calidad y cantidad del ARN extraído. Las muestras se enumeran cronológicamente. El volumen de tejido recogido se calcula como sigue: espesor de la sección criogénica (10 micras) x área microdissected [m 2]. 1 ARN l de cada muestra se analizó en la PicoChip Bioanalyser Agilent 2100.

"Figura Figura 1. Autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas autofluorescencia de las células beta después de la deshidratación de criosecciones pancreáticos con reactivos que se mantuvieron bien a temperatura ambiente (A), o frío hielo-(B) (excitación 450 a 490 nm, emisión> 515 nm;. 400 x aumentos). Las células beta se ven amarillos, mientras que los conductos pancreáticos, vasos y colágeno mostrar un color verde. Barra de escala: 75 m.

Figura 2
Figura 2. Calidad y la cantidad de ARN extraído de islotes. Perfil de una muestra humana islote ARN obtenido con este protocolo LMD (B) en comparación con un estándar de muestra de ARN (A). 1 ARN l de cada muestra se aplicó sobre un PicoChip y se analizaron para quantity la calidad y con el Agilent 2100 Bioanalyser. (A): RIN (número integridad del ARN) 7,7 [Porcentaje de rRNA (28S/18S): 1,3)], (B): RIN 7,2 [Relación de rRNA (28S/18S): 1,1)]. La concentración del RNA islote fue de 1,3 ng / l, por un importe total de 10,3 ng de 21'360'060 tejido pancreático m 3. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Discussion

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Se describe un método fiable para la microdisección láser (LMD) de los islotes de páncreas espécimen quirúrgico. Siempre que un microscopio LMD está disponible, este procedimiento podría aplicarse a cualquier institución de investigación la realización de pancreatectomías parciales, lo que aumenta el acceso a material de islotes humanos de ambos no diabéticos y diabéticos de tipo 2. Esto es especialmente relevante dada la escasez de páncreas ofrecido para el aislamiento de los islotes. Aspectos favorables de LMD en comparación con aislamiento de islotes por digestión con colagenasa son la reducción del tiempo entre la explantación del tejido y el procesamiento de los islotes para la extracción de RNA 7, el enriquecimiento de las células beta 7, así como la evitación de manipulaciones mecánicas y duras enzimática 8, 9,10, lo que podría alterar el perfil de la expresión génica. En el caso de pacientes parcialmente pancreatectomizados más información clínica y metabólica que normalmente está disponible en el caso de órganodonantes. Por otra parte, el aislamiento de islotes por rendimientos LMD menos RNA con valores más bajos RIN comparación con los observados después de la digestión con colagenasa y no proporciona islotes de vida para los estudios funcionales. Además, la enfermedad pancreática que conduce a la cirugía puede afectar al perfil de expresión de los islotes. Una evaluación equilibrada de estos pros y contras se podrá lograr a través de estudios comparativos de un gran número de aislamientos islotes realizada por digestión con colagenasa y LMD ya sea de donantes de órganos o pacientes parcialmente pancreatectomizados, como las que en curso de la Iniciativa de Medicamentos Innovadores multicéntrico para Diabetes (IMIDIA) con el objetivo de "Mejorar la función de células beta y la identificación de biomarcadores de diagnóstico para la monitorización del tratamiento en la diabetes" ( http://www.imidia.org ).

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Queremos agradecer a todos nuestros colegas que brindaron ayuda, consejo y aporte decisivo en diversas etapas de este proyecto. La producción de este artículo vídeo fue apoyado con fondos de IMIDIA ( http://www.imidia.org ), el Ministerio alemán de Educación e Investigación (BMBF) para el Centro Alemán para la Investigación de la Diabetes (DZD, http://www.dzd -ev.de ) y el Hospital Universitario Carl Gustav Carus en la Universidad de Tecnología de Dresde. El trabajo que lleva a esta publicación ha recibido apoyo de la Empresa iniciativa sobre medicamentos innovadores mixta de acuerdo con acuerdo de subvención n ° 155005 (IMIDIA), los recursos de los cuales están compuestos por la contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) y la EFPIA empresas "contribución en especie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

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References

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Cite this Article

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).More

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).

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