Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Förbättrad protokoll för laser mikrodissektion av humana pankreasöar från kirurgiska prover

doi: 10.3791/50231 Published: January 6, 2013

Summary

Laser mikrodissektion är en teknik som gör det möjligt att återvinna utvalda celler från små mängder av parenkym. Här beskriver vi ett protokoll för att förvärva mänskliga pankreasöar från kirurgiska prover som skall användas för transcriptomic studier. Vår protokoll förbättrar inneboende autofluorescens av humana betaceller, vilket underlättar deras samling.

Abstract

Laser mikrodissektion (LMD) är en teknik som gör det möjligt att återvinna markerade celler och vävnader från små mängder av parenkymet 1,2. De dissekerade celler kan användas för en mängd olika undersökningar, såsom transcriptomic eller proteomik studier, DNA bedömning eller kromosomanalys 2,3. En särskilt utmanande tillämpning av LMD är transkriptom analys, vilket, beroende på labiliteten hos RNA 4, kan vara särskilt framträdande när cellerna dissekeras från vävnader som är rika av RNaser, såsom bukspottkörteln. En mikrodissektion protokoll som möjliggör snabb identifiering och insamling av målceller är viktigt i den här inställningen för att förkorta tiden vävnad hantering och därmed för att säkerställa RNA-bevarande.

Här beskriver vi ett protokoll för att förvärva mänskliga betaceller i bukspottkörteln från kirurgiska prover som skall användas för transcriptomic studier 5. Små bitar av pankreas av ca 0,5-1 cm 3 skars från de friska visas marginaler resekterade pankreas exemplar, inbäddade i Tissue-Tek OCT-förening, frystes omedelbart i kyld 2-metylbutan, och lagrades vid -80 ° C tills snittning. Fyrtio seriella sektioner av 10 | im tjocklek skars på en kryostat enligt en -20 ° C inställning, överförs individuellt till objektglas, torkades inuti kryostaten i 1-2 minuter, och lagrades vid -80 ° C.

Omedelbart före laser mikrodissektion förfarandet har sektioner fixerades i iskall, nyberedd 70% etanol under 30 sekunder, tvättas med 5-6 dopp i iskall DEPC-behandlat vatten och avvattnas genom två en minut inkubationer i iskall 100% etanol följt av xylen (som används för vävnad dehydratisering) under 4 min, vävnadssnitt var därefter lufttorkades därefter under 3-5 minuter. Viktigt är alla steg utom inkubation i xylen, utfördes med användning av iskalla reagens - en modifiering över en tidigare beskrivna protokoll 6. Utilization iskall reagens resulterade i en markant ökning av den inneboende autofluorescens av betaceller, och underlättade deras erkännande. För mikrodissektion var fyra sektioner uttorkad varje gång: två placerades i en folie-inslaget 50 ml tub, för att skydda vävnaden mot fukt och blekning, resterande två var omedelbart microdissected. Detta förfarande utfördes med hjälp av en PALM Microbeam instrument (Zeiss) användning av tryck Auto Laser Catapulting (AutoLPC) läge. Slutförandet av betaceller / holme dissektion från fyra kryosnitt krävs längre än 40-60 minuter. Celler uppsamlades i en AdhesiveCap och lyserades med 10 | il lysbuffert. Varje enskild RNA prov för transcriptomic analys erhölls genom att kombinera 10 cell microdissected prover, följt av RNA-extraktion med Pico Ren RNA Isolation Kit (Arcturus). Detta protokoll förbättrar inneboende autofluorescens av humana betaceller, vilket underlättar deras snabba och korrekta erkännande och collection. Ytterligare förbättringar av detta förfarande kan möjliggöra dissektion av fenotypiskt olika betacellerna, med eventuella konsekvenser för bättre förståelse av förändringar i samband med typ 2-diabetes.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Frysning av mänskliga pankreasvävnad

  1. Ta fettvävnad, blodkärl, nerver och icke-parenkymal vävnad med en skalpell och pincett och skär den pankreatiska vävnaden i bitar (~ 0,5-1 cm kuber).
  2. Placera en bit pankreatisk vävnad i mitten av en Cryomold, och täck den helt med kallt Tissue-Tek oktober Förening. Sätt Cryomold i en burk vars botten är täckt med förkyld 2-metylbutan och snap-frysa i flytande kväve. Förvara frysta provet vid -80 ° C.

2. Beredning av frysta snitt

  1. Använd handskar under alla åtgärder för att undvika denaturering av RNA.
  2. Rengör kryostaten kniv, preparathållare och pensel med kall 100% etanol och RNas bort. Placera frysta vävnaden inuti kryostaten.
  3. Vänta tills vävnaden, kniv och borste nå -20 ° C. Märk SuperFrost Plus diabilder och pre-cool dem inuti kryostaten kammaren väntanför vävnaden att nå -20 ° C.
  4. Applicera Tissue-Tek oktober föreningen på preparathållaren och placera den frysta vävnaden på toppen.
  5. När Tissue-Tek OCT-förening fryses trimma cryoblock och avlägsna eventuellt överskott av Tissue-Tek OCT-förening med ett rakblad.
  6. Skär totalt 40 konsekutiva 10 um skivor från bukspottkörtelvävnad blocket. Dessutom rekommenderar vi att skära ett första och mellersta skiva som ska sparas för översikt ritningar av bukspottskörteln avsnitt som kan underlätta identifieringen av öar inom skivorna under mikrodissektion processen.
  7. Överför avsnitten från knivbladet till mitten av en SuperFrost Plus bild genom att trycka på baksidan av bilden med fingret (täckt med en handske) att värma upp bara den region som sektionen ska följa.
  8. Torka delarna 1-2 min inuti kryostaten vid -20 ° C, varefter du lägger dem i en bild som placeras på torris. Förvara sektionernavid -80 ° C.
  9. Om nödvändigt, rengör knivbladet med hushållspapper och kall 100% etanol.

3. Uttorkning av frysta snitt

  1. Förbered Reagens: Häll 30 ml nyberedd 70% etanol, 30 ml DEPC-behandlat vatten, 2x30 ml 100% etanol och 30 ml xylen i 50 ml Cellstar rör (Falcons), kyla och hålla alla reagenser (utom xylen) på is.
  2. Rengör arbetsområdet under huven med 100% etanol och RNaseZAP.
  3. Process två kryosnitt enligt följande: fixa i iskall 70% etanol under 30 sekunder, tvätta med 5-6 snabba dopp i iskall DEPC-behandlat vatten, torkar två gånger under 1 minut i iskall 100% etanol, inkubera under 4 min i xylen vid rumstemperatur (25 ° C), och lufttorka under 3-5 minuter. Upprepa detta steg med ett annat par kryosnitt.
  4. Sätt två torkade kryosnitt rygg mot rygg i en 50 ml Cellstar rör svept med aluminiumfolie för att skydda dem från ljus och fukt.
<p class = "jove_title"> 4. Laser mikrodissektion av Beta-celler med PALM Microbeam, Zeiss

  1. Rengör mikroskop med RNaseZAP och montera självhäftande Cap i RoboMover.
  2. Ange följande inställningar: Filter set 09 (excitation: 450-490 nm, emission> 515 nm), AutoLPC läge, 50% laserenergi, 65% laser fokus, 100% laser hastighet, 5 um avstånd mellan AutoLPC skott, 6 um avstånd till rad, arbetshöjd: -10.100.
  3. Sätt en bild till scenen.
  4. Leta reda på autofluorescerande betacellerna i mikroskopisk visualisering (5x eller 10x objektiv).
  5. Växla till 40x objektivet markerar betacellerna med "Freehand" markeringsverktyg och microdissect dem med hjälp av laser.
  6. Fånga vävnad fyra torkade kryosnitt i en AdhesiveCap.
    Kommentar 1: tid att dissekera betacellerna hos en uttorkad kryosnittet bör inte vara längre än 10-20 minuter för att undvika rehydrering av vävnadssnitt vilket skulle resultera iRNA nedbrytning.
    Kommentar 2: Kontrollera framgångsrik mikrodissektion processen genom visuell inspektion efter att ha flyttat scenen till Checkpoint.

5. Lys av Microdissected Beta Cell Anrikat Tissue

  1. Ta bort AdhesiveCap från RoboMover.
  2. Pipettera 10 pl extraktionsbuffert (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) i locket av AdhesiveCap och inkubera den upp och ned vid 42 ° C under 30 minuter.
  3. Centrifugera ner vid 10.000 x g och sätta lysatet på torr is. Förvara den vid -80 ° C tills RNA-extraktion utförs.
  4. Upprepa steg 3.) Till 5.) Med alla andra sektioner.

6. RNA-extraktion

  1. Kombinera alla tio 10 pl lysat
  2. Fortsätt med RNA isolering genom att arbeta vid rumstemperatur enligt protokollet av PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus, med ett 1:1 buffert förhållande Extraction (XB) till 70% etanol (inklusive DNas behandling).

7. RNA-analys

  1. Använd 1 pl RNA för analys av kvalitet och kvantitet med en Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). Kvantitativ utvärdering görs med hänvisning till en standard-RNA lastade parallellt på chipet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som visas i figur 1, ledde den modifierade dehydrerande protokollet till en förbättring av betaceller autofluorescens jämfört med föregående publicerade protokollet 6. Tillämpa den beskrivna protokollet, varje av 39 kirurgiska pankreas prover för att generera 40 seriella kryosnitt för i genomsnitt 31'544'704 um 3 vävnad / pankreas prov (intervall: 8'742'390 - 81'522'153 um 3) såsom visas i tabell 1. Detta representerar volym på ca 18 pankreasöar av 150 ^ m diameter, eller på 35.000 β-celler. Vävnaden kommer från ett genomsnitt på 38 olika öar / pankreas prov (intervall: 19 till 80 öar), har var och en normalt observeras i två eller flera på varandra följande sektioner. Den stora variationen i utbytet av öar mellan olika prover speglar heterogeniteten av vävnaden källan, antingen bukspottkörteln huvud eller svans, liksom en gradvis förbättring av operatörerna i upptäckajon av öarna inom 10 minuter tid som ägnas åt kontroll av varje avsnitt.

Total RNA från varje microdissected och lyserades vävnad renades med Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit för Applied Biosystems och eluerades i 11 pl, i enlighet med protokollet från tillverkaren. Därefter 1 il RNA från varje prov analyserades med Agilent 2100 Bioanalyser. Vi erhöll i genomsnitt 42 ng RNA / prov (intervall: 5 till 229 ng / prov) med ett medelvärde RNA-integritet nummer (RIN) av 5,8 (intervall: 3,4 till 7,2). Figur 2 visar ett exempel på RNA-analys. Oavsett vilken RIN värdet alla analyserade RNA-prover framgångsrikt använts för transcriptomic studier. Vi hittade inte ett direkt samband mellan mängden microdissected vävnad och RNA avkastning. Skillnader i tidsintervallet mellan skörd av kirurger och frysning av pankreas exemplar efter sin granskning och frisättning av patologen kunde stå i p konst för varierande kvalitet och kvantitet av återvunnet RNA. Andra viktiga faktorer att beakta är laserenergi ansökt om mikrodissektion med lägre energi ger högre RNA integritet, liksom lasern fokus och avståndet LPC punkterna. Fokus är idealiskt beläget när en liten "konsekvenserna" av lasern på glasytan på bilden, bildar en liten svart prick, kan ses. I våra händer de bästa resultaten uppnås med en laserenergi av 50%, en laser fokus 65%, även anpassat för att kompensera för skillnader i tjockleken av sektionerna, och ett avstånd av LPC punkter av 5 pm. Dessutom kan RNA kvantiteten optimeras genom att hålla den arbetande höjd RoboMover, dvs avståndet mellan den vidhäftande locket och sektionen, så lågt som möjligt för att undvika förlust av microdissected vävnad under fånga processen. I vår uppsättning upp arbetshöjden är -10.100 godtyckliga PALM enheter.

LL "> prov <td> 30
Antalet öar / prov insamlade vävnadsvolym / prov [xm 3] RIN koncentration [ng / ul] totalt RNA [ng]
DP002 34 24'947'696 5,2 1,149 10,34
DP003 30 41'141'488 5,5 1,677 15,09
DP005 23 27'024'264 3,5 8,259 66,07
DP006 25 45'900'848 3,4 7,399 59,19
DP007 23'936'048 6,5 0,595 4,76
DP008 22 68'248'432 6,2 1,559 14,03
DP010 34 33'156'752 5,6 1,750 19,25
DP011 29 31'339'152 6,0 1,365 15,02
DP012 34 57'594'360 6,3 3,025 33,28
DP017 35 28'212'256 6,0 1,292 14,21
DP030 35 48'007'530 5,6 2,180 23,98
DP013 36 34'371'045 6,9 1,350 14,85
DP014 35 21'360'060 7,2 1,270 13,97
DP015 33 20'923'488 4,1 4,000 44,00
DP019 40 35'431'704 7,0 1,670 18,37
DP025 19 15'329'844 6,6 0,496 5,46
DP034 19 81'522'153 6,4 4,260 46,86
DP039 32 19'074'410 6,5 1,270 13,97
DP040 44 31'565'630 5,4 2,300 25,30
DP042 52 40'333'840 7,0 2,510 27,61
DP021 65 33'996'260 6,3 2,830 31,13
DP023 19 19'513'310 5,6 8,250 90,75
DP024 32 24'125'140 6,3 20,780 228,58
DP038 23 18'306'040 6,6 11,700 128,70
DP045 35 36'345'620 6,3 1,100 12,10
DP033 42 26'078'550 6,5 15,380 169,18
DP022 49 33'535'460 6,8 7,590 83,49
DP041 56 34'899'830 5,7 3,350 36,85
DP049 38 18'521'230 6,8 1,020 11,22
DP028 32 16'410'670 5,6 1,720 18,92
DP056 36 19'737'580 5,7 1,130 12,43
DP059 52 23'376'180 3,6 7,880 86,68
DP047 41 20'658'370 6,4 1,040 11,44
DP036 23 8'742'390 3,5 0,950 10,45
DP027 42 29'150'480 5,1 3,410 37,51
DP046 54 16'800'070 5,3 8,210 90,31
DP055 57 32'340'270 6,2 1,280 14,08
DP064 74 41'896'460 6,5 2,440 26,84
DP067 80 46'388'540 6,3 5,200 57,20
genomsnitt 38 31'544'704 5,8 3,965 42,14
Antalet öar / prov insamlade vävnadsvolym / prov [xm 3] RIN totalt RNA [ng]
område 19 till 80 8'742'390 - 81'522'153 3,4 till 7,2 4,76 till 228,58
genomsnitt 38 31'544'704 5,8 42,14

Tabell 1. Översikt av mängden microdissected vävnad och kvalitet och kvantitet av de extraherade RNA. Proverna listas kronologiskt. Den uppsamlade vävnadsvolym beräknas enligt följande: tjocklek kryosnittet (10 | im) x microdissected yta [xm 2]. 1 pl RNA av varje prov analyserades på Agilent 2100 Bioanalyser PicoChip.

"Figur Figur 1. Inneboende autofluorescens av humana betaceller autofluorescens av betaceller efter uttorkning av bukspottkörteln kryosnitt med reagens som antingen hölls vid rumstemperatur (A), eller iskall (B) (excitation 450 till 490 nm, emission> 515 nm,. 400 x förstoring). Betacellerna verkar gul, medan pankreas kanaler, fartyg och kollagen visar en grön färg. Skala bar: 75 pm.

Figur 2
Figur 2. Kvalitet och kvantitet av extraherat ö-RNA. Profil av en human ö RNA-prov som erhållits med denna LMD protokoll (B) jämfört med en vanlig RNA-prov (A). 1 il RNA i varje prov applicerades på en PicoChip och analyserades för quantity och kvalitet med Agilent 2100 Bioanalyser. (A): RIN (RNA integritet nummer) 7,7 [rRNA Ratio (28S/18S): 1,3)], (B): RIN 7,2 [rRNA Ratio (28S/18S): 1,1)]. Koncentrationen av den lilla ön RNA var 1,3 ng / ul, till ett totalt belopp av 10,3 ng från 21'360'060 um 3 pankreas vävnad. Klicka här för att se större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi beskriver en pålitlig metod för laser mikrodissektion (LMD) mänskliga öar från kirurgisk bukspottkörteln prov. Förutsatt att en ljusmätare mikroskop är tillgängligt, kan detta förfarande genomföras på varje forskningsinstitution utför partiella pancreatectomies och därmed öka tillgången till mänskliga holme material från både icke-diabetiker och typ 2 diabetiker. Detta är särskilt relevant med tanke på bristen på pankreata erbjuds för holme isolering. Gynnsamma aspekter LMD jämfört med ö isolering genom kollagenasdigerering är den reducerade tiden mellan explantation av vävnaden och behandling av öarna för RNA-extraktion 7, anrikningen av betaceller 7, liksom undvikande av hårda mekaniska och enzymatiska manipulationer 8, 9,10, vilket kan förändra profilen genuttryck. I fallet med partiellt pancreatectomized patienter mer klinisk och metabolisk information är typiskt tillgänglig än i fallet av organgivare. Å andra sidan, isolering av öar av LMD avkastning minus RNA med lägre RIN-värden jämfört med de som observerats efter kollagenasdigerering och ger inte levande öar för funktionella studier. Vidare kan pankreatisk sjukdom som leder till operation påverkar ö uttrycksprofilen. En balanserad utvärdering av dessa fördelar och nackdelar kan uppnås genom jämförande studier på ett stort antal ö isoleringar som utförs av kollagenasdigestion och LMD antingen från organdonatorer eller delvis pancreatectomized patienter, t.ex. de pågående i multicenter initiativet för innovativa läkemedel för Diabetes (IMIDIA) med målet att "förbättra betacellfunktion och identifiering av diagnostiska biomarkörer för behandling övervakning i diabetes" ( http://www.imidia.org ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi vill tacka alla våra kolleger som tillhandahålls hjälp, råd och kritisk ingång vid olika steg i detta projekt. Produktion av den här videon artikel stöddes med medel från IMIDIA ( http://www.imidia.org ), det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) till den tyska Centrum för diabetesforskning (DZD, http://www.dzd -ev.de ) och Universitetssjukhuset Carl Gustav Carus vid Tekniska högskolan Dresden. Arbetet ledde till denna publikation har fått stöd från initiativet för innovativa läkemedel gemensamt företag enligt bidragsavtal nr 155.005 (IMIDIA), resurser som består av ekonomiska bidrag från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) och EFPIA företagens "i natura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (isopentane) ROTH 3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 210 261 with support skirt
Cellstar Tubes (50 ml) greiner bio-one 227.261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) SIGMA D 5758
Dry ice
Ethanol absolute VWR 20821.310
Liquid nitrogen
Paint brush
PALM MicroBeam ZEISS
Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top internal 22x22 mm, depth 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Plastic clamp
Razor
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel / surgical blade Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura 4583 or 0807000022
Tweezers BRAUN BD168R
Xylene VWR 28975.291

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26, (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33, (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53, (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53, (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7, (1), e30415 (2012).
Förbättrad protokoll för laser mikrodissektion av humana pankreasöar från kirurgiska prover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).More

Sturm, D., Marselli, L., Ehehalt, F., Richter, D., Distler, M., Kersting, S., Grützmann, R., Bokvist, K., Froguel, P., Liechti, R., Jörns, A., Meda, P., Baretton, G. B., Saeger, H. D., Schulte, A. M., Marchetti, P., Solimena, M. Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (71), e50231, doi:10.3791/50231 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter