Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج من اسماك الزرد مرض السكري والأيض الذاكرة

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

الذاكرة هي ظاهرة التمثيل الغذائي التي تستمر مضاعفات السكري والتقدم دون عوائق حتى بعد تحقيق سوائية سكر الدم صيدلي. نحن هنا وصفا لنموذج السكري داء الزرد التي هي فريدة من نوعها من حيث أنه يسمح لفحص مكونات جينية تنتقل من الذاكرة الأيض ميتوتيكلي]

Abstract

داء السكري يؤثر حاليا 346،000،000 الأفراد، ومن المتوقع أن ترتفع إلى 400 مليون نسمة بحلول عام 2030. وقد كشفت الأدلة من المختبر على حد سواء والكبيرة الحجم التجارب السريرية أن السكري مضاعفات التقدم دون عوائق عبر ظاهرة التمثيل الغذائي الذاكرة حتى عندما يتم تحقيق السيطرة صيدلي نسبة السكر في الدم. ويمكن التعبير الجيني من خلال تغيير ثابت تغييرات جينية والتي لا تسمح للخلايا والكائنات الحية على الاستجابة بسرعة للتغيير المحفزات البيئية ولكن أيضا تمنح قدرة الخلية على "حفظ" هذه اللقاءات مرة واحدة تتم إزالة الحافز. على هذا النحو، يتم حاليا الأدوار التي تلعب في هذه الآليات ظاهرة الذاكرة الأيض محل دراسة.

وقد أبلغنا مؤخرا وضع نموذج الزرد من مرض السكري من النوع الأول ويتميز هذا النموذج لإظهار أن مرضى السكري ليس فقط الزرد عرض المضاعفات المعروفة الثانوية بما في ذلك التغييرات المرتبطةمع اعتلال الشبكية السكري، اعتلال الكلية السكري وضعف التئام الجروح ولكن أيضا يحمل ضعاف تجديد الزعنفة الذيلية. هذا النموذج هي فريدة من نوعها في أن الزرد قادرة على التجدد في البنكرياس التالفة واستعادة دولة سوي سكر الدم على غرار ما هو متوقع في مرحلة ما بعد زرع المرضى من البشر. وعلاوة على ذلك، جولات متعددة من بتر الزعنفة الذيلية تسمح لفصل ودراسة آثار جينية نقية في الجسم الحي في النظام دون تعقيد العوامل المحتملة من الدولة السكري السابقة. على الرغم من تحقيق سوائية سكر الدم بعد تجديد البنكرياس، ومضاعفات السكري الثانوي لتجديد الجلد والزعانف التئام الجروح استمرت إلى ما لا نهاية. في حالة تجديد زعنفة ضعف، يتم الاحتفاظ هذه الحالة المرضية حتى بعد جولات متعددة من تجديد زعنفة في الأنسجة زعنفة ابنته. هذه الملاحظات تشير إلى عملية جينية الكامنة الموجودة في ولاية الذاكرة الأيض. هنا نقدم الأساليب اللازمة لجنرال بنجاحerate الجماعات الذاكرة السكري والتمثيل الغذائي من الأسماك ومناقشة مزايا هذا الطراز.

Introduction

داء السكري (DM) هو مشكلة صحية خطيرة ومتزايدة على أن النتائج انخفاض في متوسط ​​العمر المتوقع بسبب مرض الاوعية الدموية الدقيقة محددة (اعتلال الشبكية، اعتلال الكلية، اعتلال الأعصاب، ضعف التئام الجروح) والأوعية الكبيرة (أمراض القلب والسكتة الدماغية) المضاعفات 1. بدأت مرة واحدة، ومضاعفات السكري مواصلة التقدم دون انقطاع حتى عندما يتم تحقيق السيطرة على سكر الدم و2،3 اصطلح على تسميته هذه الظاهرة ذاكرة التمثيل الغذائي أو تأثير الإرث. وجرى الاعتراف بوجود هذه الظاهرة سريريا خلال 1990s في وقت مبكر باسم "مكافحة داء السكري والمضاعفات الابتدائية و(DCCT)" تقدمت وتمت بدعم من التجارب منذ عدة سريرية إضافية 4،5،6،7،8،9،10، 11،12،13،14. وكانت النماذج الحيوانية من DM الحرجة للاكتشافات علم وظائف الأعضاء المتعلقة patho-من مضاعفات السكري والتمثيل الغذائي الذاكرة. في الواقع، وقد تم توثيق أولا استمرار مضاعفات السكري في الكلاب نموذجا من السكريومنذ ذلك الحين اعتلال الشبكية التي تدعمها خطوط العديد من الأدلة التجريبية باستخدام مجموعة متنوعة من نظم الاستزراع في المختبر، والنماذج الحيوانية 15،16،17،18،19،20،21. هذه الدراسات تبين بوضوح أن فترة فرط سكر الدم الأولي في نتائج تشوهات دائمة (بما في ذلك التعبير الجيني الشاذة) من الأعضاء المستهدفة / ميكانيكي الخلايا ويقترح إشراك epigenome.

Epigenomes تتكون من لونين جميع التعديلات لإعطاء نوع من الخلايا وتكون مسؤولة عن الخلية الجينات الفريدة الملف التعبير. التعديلات كروموسوم الحيوية خلال والتطوير والدعم تمايز الخلايا، تستجيب للمؤثرات الخارجية، ورثت ستابلي ميتوتيكلي] 22،23 ويمكن تغييرها في مرض 24،25،26. وتشمل هذه الآليات جينية: آخر التعديلات هيستون متعدية، غير الكنسي إدراج متغير هيستون في octomers، والتغيرات من خلال الوصول لونين الحامض النووي، والجيناتالسيطرة من خلال التعبير الترميز غير الرناوات الصغيرة 27،28،29،30. تماما، وعمليات جينية تسمح خلية / الكائنات الحية على الاستجابة بسرعة للتغيير المحفزات البيئية 31،32،33، فإنها تمنح أيضا القدرة للخلية إلى "حفظ" هذه اللقاءات مرة واحدة تتم إزالة الحافز 23،22. لذلك، وتغيير ملامح التعبير الجيني الناتجة عن عمليات جينية مستقرة في حالة عدم وجود إشارة (ق) التي شرع لهم وراثية من خلال انقسام الخلايا، لاقت اهتماما كبيرا والآليات الجزيئية الكامنة وراء من الأمراض بما في ذلك الذاكرة البشرية الأيض. النتائج التي تظهر في سياق DM وعلم التخلق التطورات الموازية في أمراض أخرى في هذا عدد كبير من التغييرات الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم جينية تسبب تغيرات ملحوظة في الشبكات الثابتة الترانسكربتي من الخلايا (34،35،36،37،38 مشاركة في).

كان الزرد طويلة كائن نموذج رئيس الوزراء لستودى الفقاريات التنمية ومع ذلك شهدت السنوات ال 15 الماضية نموا متزايدا في استخدام هذا الكائن الحي لدراسة الأمراض التي تصيب البشر 39. وقد وضعت نماذج من الأمراض التي تصيب البشر الزرد تغطي مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك الاضطرابات الوراثية البشرية والأمراض المكتسبة 40،41،42. العديد من المزايا من الزرد على غيرها من الكائنات الفقارية تشمل نموذج الخصوبة العالية، في وقت قصير جيل والشفافية من خلال مرحلة البلوغ المبكر، وتخفيض تكاليف السكن ومجموعة من الأدوات للتلاعب الجيني. وعلاوة على ذلك، ونظرا لحفظ مسارات واسعة من علم وظائف الأعضاء والوراثية الخلوية بين الفقاريات والقدرة على أداء عالية الإنتاجية عروض المخدرات، تم الزرد استخدمت بنجاح لاكتشاف الأدوية.

وقد وضعنا نموذجا الزرد الكبار من داء السكري من النوع الأول باستخدام المخدرات سكري، streptozocin. اتسمت نحن هذا النموذج لإظهار أن مرضى السكري لا الزردر فقط عرض المعروفة المضاعفات الثانوية الإنسان، ولكن بالإضافة إلى ذلك، تظهر ضعف التجدد أطرافهم (الذيلية تجديد FIN) نتيجة لفرط سكر الدم البيئة. وبالإضافة إلى ذلك، فقد أبلغنا أن فرط سكر الدم الزرد العودة إلى سكر الدم العادي في حدود 2 أسابيع من إزالة المخدرات بسبب تجديد خلايا بيتا في البنكرياس الذاتية مما أدى إلى حالة طبيعية من الناحية الفسيولوجية نسبة السكر في الدم. لكن، في المقابل، تجديد أطرافه في هذه الأسماك لا يزال ضعاف بنفس القدر كما في حالة السكري الحاد تشير إلى هذا التعقيد واستمرت هو عرضة للذاكرة الأيض. وكان الدافع الرئيسي لتوليد هذا النموذج إلى توفير نظام لدراسة مكونات جينية مستقرة ميتوتيكلي] التي تدعم الذاكرة ظاهرة التمثيل الغذائي في حالة عدم وجود ضوضاء خلفية البيئة فرط سكر الدم السابقة. في ختام البروتوكول المقدمة هنا يمكن معالجة الأنسجة والزرد أو انتقائية من قبل أي فحص مناسبة للresearchers يحتاجها. وقد استخدمنا بنجاح هذا الإجراء لتحديد التغييرات الجينوم على نطاق المستمرة في الحامض النووي الناجم عن ارتفاع السكر في الدم التي يتم الاحتفاظ بها في حالة الذاكرة الأيض 21.

ونحن نرى أن هذا النموذج من الزرد مرض السكري من النوع الأول ومزايا مبتكرة عدة على الأنظمة نموذج آخر لفحص الذاكرة الأيض. 1) من الممكن إجراء جميع الدراسات لدينا في الجسم الحي وكما الأسماك السابقة العودة إلى فرط سكر الدم من خلال تجديد سوائية سكر الدم انتاج الانسولين الذاتية، أنها لا تحتاج إلى حقن الأنسولين الخارجية. لذلك، هذا يتجنب تعقيد المسامير والوديان في السيطرة على سكر الدم التي قد تحدث في الحيوانات التي تتطلب الأنسولين الخارجية. 2) كما هو موضح أعلاه، يتم استبعاد تحفيز خلفية عن الدولة السابقة السكري (أي استمرار وجود glycation المتقدمة المنتجات النهائية وعلى رد الفعل علامات أنواع الاكسجين)، وبالتالي يمكن للمرء أن دراسة epig بحتةenetic العوامل الأيضية من الذاكرة. يمكن 3) أن يتم تنفيذ التجارب وبسرعة حيث يستغرق حوالي 80 يوما من تحريض السكري فحص الذاكرة حتى الأيض. 4) الذيل الزعنفة هو تجديد ودود جدا وتجريبيا يسمح لسهولة التلاعب الجيني والتجريبية التي هناك مجموعة واسعة من الأدوات. 5) الذيل الزعنفة تجديد يوفر طريقة بسيطة جدا وقابلة للقياس الكمي لتقييم الذاكرة التمثيل الغذائي، وبالتالي سيسمح لاكتشاف المخدرات في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم تنفيذ كافة الإجراءات التالية الإرشادات الموضحة في "مبادئ رعاية الحيوان المعملية" (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح 1985) وافقت جامعة روزاليند فرانكلين رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة الحيوان بروتوكول 08-19.

هناك 2 الاختصارات الهامة التي يتم استخدامها في هذا المخطوط. 1) DM: يشير إلى الأسماك التي هي في حالة فرط سكر الدم الحادة (300 ملغ / دل)، وكانت مدة لا تقل عن 3 أسابيع. 2) MM: يشير إلى الأسماك التي كانت 21 يوما (انظر البروتوكول) DM الأسماك ويسمح لنسبة السكر في الدم من خلال استعادة السيطرة تجديد البنكرياس. ويتحقق ذلك في غضون (14) يوما من إزالة المخدرات. تعتبر أسماك MM من هذه النقطة فصاعدا. من المهم أيضا أن نلاحظ أن الأسماك التي يتم يشار إلى السيطرة تعامل مماثل كما DM الأسماك أو MM من حيث عدد الحقن (المالحة فقط)، والحضانة مرة عند درجات الحرارة المختلفة وعدد وتوقيتمن بتر الزعنفة الذيلية.

1. جيل من اسماك الزرد مع داء السكري، السمك DM

  1. إعداد كل من الانتعاش وخزانات المياه مخدر. المياه الانتعاش أمر طبيعي أسماك المياه. لمخدر المياه إضافة كافية 2-فينوكسييثانول بحيث يتم التوصل إلى التخفيف 1:1،000 في أسماك المياه العادية.
  2. إعداد الحل 0.3٪ (في غطاء الدخان) من streptozocin (STZ) وذلك بإضافة 6 ملغ من STZ إلى 2 مل من كلوريد الصوديوم 0.09٪ وعلى الفور وضع الحل على الجليد. وسوف توفر ما يكفي من هذا الحل لحقن حقن حوالي 20 الأسماك في 20 دقيقة. إذا كنت يتجاوز علامة 20 دقيقة، ووقف، وجعل حل STZ جديدة قبل الشروع. في محلول ملحي أنبوب منفصل قسامة ما يكفي للأسماك السيطرة. وبمجرد solubilized STZ جميع الخطوات اللاحقة لا تتطلب استخدام الدخان غطاء محرك السيارة.
  3. ملء حقنة سم مكعب ½ مجهزة إبرة قياس 27 1/2 مع حلول STZ أو ضمان السيطرة ليس هناك فقاعات الهواء.
  4. Anesthetize كل على حدة الأسماك عن طريق وضع الأسماك في المياه مخدر، وانتظر حتى يتوقف حركتهم السباحة (1-2 دقائق).
  5. مرة واحدة لفترة وجيزة تخدير وضع السمك على منشفة ورقية لامتصاص الماء الزائد أي، ضع السمك في وزن القارب وقياس كتلة الأسماك.
  6. ضع السمك على سطح ثابت (بيتري غطاء الطبق) للحقن.
  7. حقن محلول STZ أو في التجويف البريتوني من الأسماك عن طريق إدراج إبرة الماضي شطبة في الجانب الخلفي من الصفاق البطني.
  8. 0،35 ملغ / ز ينبغي تسليم (350 ملغ / كغ) من STZ إلى كل الأسماك وحجم الحل 0.3٪ المطلوبة ويمكن حساب ذلك على النحو التالي.
    1. تتكاثر الأسماك كتلة (ز) بنسبة 0.35 لانتاج كمية STZ في ملغ المطلوبة.
    2. تقسيم المنتج ولدت قبل 3 أعلاه لانتاج حجم الحل اللازم ل0.3٪ في حقن ميكرولتر.
      عينة: للحصول على الأسماك ز 0.5: أ) 0.5 × 0.35 = 0.175 ب) .0175 / 3 = 0،058 مل= 58 ميكرولتر.
      سيتم حقن نفس الحجم من دون STZ لسمكة السيطرة. يجب أن يكون إنشاء وحدات التخزين هي ورقة لحقن الشامل في الأسماك وتستخدم للإشارة سريعة.
  9. حقن التالية وضع الأسماك في الانتعاش خزان المياه ومراقبتها للنشاط السباحة العادية. يتم نقل مرة واحدة وقد تحقق هذا السمك إلى خزان الحياة الطبيعية التي يتم الاحتفاظ في نطاق درجات الحرارة المخفضة من 22 ° C - 24 ° C. هذا أمر بالغ الأهمية خفض درجة الحرارة لتحريض كفاءة ارتفاع السكر في الدم (داء السكري، DM).
  10. على الرغم من ارتفاع السكر في الدم يتم الكشف في غضون 24 ساعة من الحقن الأولى، من أجل إحداث حالة ارتفاع السكر في الدم لفترات طويلة من عالية جدا في الزرد تتطلب حقن متكررة الحث تليها مرحلة الحقن الصيانة الأسبوعية كما هو مبين أدناه.

الأسبوع 1: 3 حقن (يوم 1، 3، 5)، الأسبوع 2: 1 حقن (يوم 12)، الأسبوع 3: 1 حقن (يوم 19)،
الأسبوع 4: (يوم 21) نفذمقايسة المصالح.

عند هذه النقطة تعتبر الزرد أنها كانت في حالة ارتفاع السكر في الدم لفترات طويلة من ويحمل مضاعفات السكري اعتلال الكلية من واعتلال الشبكية وضعاف أيضا تجديد زعنفة. ويشار إلى أنه هذه الأسماك DM. بالإضافة إلى ذلك إذا رغبت في الحفاظ على الأسماك في ولاية فرط سكر الدم مع حقن الصيانة الأسبوعية. ينبغي أن يتوقع ما يقرب من 5٪ الموت أثناء هذه العملية.

2. جمع الدم ومستوى السكر في الدم الصيام (FBGL) تقدير

  1. يجب على كل مجموعة من الأسماك ومراقبة DM تشمل الأسماك بما فيه الكفاية لتحديد بدقة FBGL المتوسط ​​للمجموعة كما يتطلب هذا الفحص لا بد من التضحية هذه الأسماك.
  2. إعداد أنبوب PCR صفت لكل عينة دم تحتوي على 5 ميكرولتر من محلول ملحي معقم طبيعي.
  3. لجمع الدم، تخدير الأسماك على النحو الوارد أعلاه، قم بإزالة كافة المياه، ضع السمك على شريحة المجهر وباستخدام مشرط، وإزالة الرأس من الأسماكفي قاعدة الوصاد.
  4. جمع الدم (لتصل إلى 2 ميكرولتر) التي يتم تحريرها من الأسماك على الشريحة وبسرعة إضافة إلى ميكرولتر 5 من ملحي معقم pipetting صعودا وهبوطا للتأكد من أن الدم لا تسد. وضع العينة على الفور على الجليد.
  5. تحديد حجم عينة من الدم عن طريق قياس الحجم الكلي للسائل (المالحة + الدم) ومن ثم طرح خارج ميكرولتر 5 من المالحة.
  6. نقل 5 ميكرولتر من الدم المخفف من كل أنبوب PCR في أنبوب 1.5 مل microfuge وتحديد تركيز السكر في الدم باستخدام الجلوكوز الفحص QuantiChrome كيت. يتم تنفيذ هذا عن طريق اتباع بروتوكول الشركة المصنعة دون استثناء. النتائج المتوقعة: عادي الأسماك التحكم / 60 ملغ / دل وDM 310 الأسماك ملغ / دل.

3. الذيلية مؤشرات مالية التجديد الدراسات

  1. تخدير الأسماك كما هو موضح في 1،0-1،4.
  2. الأسماك على مكان غطاء طبق بتري وبتر الزعنفة الذيلية في خط مستقيم باستخدام حجم العقيمة10 مشرط الأقرب إلى النقطة الأولى المتفرعة lepidotrichia أثناء عرض زعنفة من خلال المجهر تشريح.
  3. السماح للأسماك لاسترداد كما هو الحال في وضع 1،10 ولكن الأسماك في C ° 33 للمرحلة النمو التجديدي للمقايسة. هذا هو درجة الحرارة التي أنشئت لتسريع زعنفة تحليل التجدد.
  4. ولا يمكن تصوير الزعانف في أي وقت آخر إلا بتر ندرس بشكل روتيني نمو التجدد في 28 و 24 و 72 ساعة بعد القسم العابر.
  5. تخدير الأسماك كما كان من قبل (انظر 1،0-1،4)، ضع السمك تحت المجهر تشريح مجهزة الكاميرا (نيكون نستخدم SMZ-1500 كاميرا مجهزة Q-التصوير) وجمع كل الصور زعنفة على التكبير مع برنامج 1X عناصر NIS . وينبغي نشر زعنفة للتصوير بحيث يتم توسيع بالكامل دون الإضرار أو تمتد الأنسجة ويجب أن تكون خالية من أي قطرات الماء. من أجل التناسق دائما مكان على الجانب الظهري إلى اليمين.
  6. طباعة الصور وقياس غرو التجددمنطقة وث باستخدام برنامج J صورة واستخدام لوحة الرسم. تتبع في جميع أنحاء منطقة كاملة من النمو الجديدة وتحديد المنطقة. وينبغي بذل كل قياس خمس مرات وبلغ متوسط ​​لضمان دقة التتبع. من المهم أن الصور المستخدمة لم يكن لديك الظلال أو قطرات الماء حيث أن هذه المساهمة إلى أخطاء في قياس مساحة ثمرة.
  7. قياس طول الموقع بتر على طول المحور الظهري البطني و-تقسيم المنطقة تحدد في 3.6 بواسطة هذا القياس. هذا يسمح بالمقارنة الأسماك من مختلف الأحجام مباشرة.

4. جيل من اسماك الزرد الأيض (MM) الذاكرة

  1. بدء مجموعة من الأسماك وضوابطها DM المناسبة كما هو موضح في القسم 1.
  2. في 21 يوما لتحديد FBGL مجموعة فرعية من مجموعة وتقسيم الأسماك DM إلى 2 مجموعات فرعية. تواصل الأسبوعية STZ الحقن لإحدى المجموعات كعناصر تحكم DM لمدة التجربة. وقف STZ الحقن للمجموعة الثانية وincubatه الأسماك في درجة الحرارة العادية. في غضون 14 يوما وهذه الزرد استعادة العادي الأنسولين والسكر في الدم عن طريق التحكم تجديد البنكرياس. وتسمى هذه الأسماك الآن MM (التمثيل الغذائي الأسماك الذاكرة).
  3. في 30 يوما إزالة المخدرات آخر بتر الزعانف الذيلية عن نطاق السيطرة، وDM MM الأسماك عن طريق الطريقة الموضحة في 3.2.
  4. العودة الأسماك لظروف المياه الطبيعية على التجدد زعنفة لمدة 30 يوما. وهذا يسمح للنمو ما نسميه والأنسجة الذاكرة الأيض.
  5. لمدة 60 يوما في إجراء بتر الثانية (كما هو موضح في 3.2) داخل الأنسجة التي تم تجديدها في الفترة من 30-60 يوما وتنفيذ أعمال التجديد الزعنفة الذيلية مقايسة (3،1-3،7) الشكل 1.
  6. عزل الأنسجة وأداء الفحص من الفائدة. انظر الجدول 1 للاطلاع على ملخص البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النوع الأول الزرد السكري ليس فقط عرض المضاعفات المعروفة الثانوية من اعتلال الشبكية واعتلال الكلية، ولكن أيضا، تظهر خاصية تعقيد إضافي: ضعف التجدد الزعنفة الذيلية. هذا التعقيد في وقت لاحق نظرا لاستمرار الذاكرة التمثيل الغذائي في الأسماك التي استعادة السيطرة على مستويات الجلوكوز العادي بعد فترة فرط سكر الدم. في الشكل 2A (التحكم) والشكل 2B (الذاكرة الأيض) صور ممثل زعانف تجديد التي تم التقاطها في 72 ساعة بعد بتر ترد. يمكن كميا العجز وكما هو مبين في الشكل 2C DM والزرد MM يحمل عجزا قدره حوالي 40٪ في 72 ساعة بالمقارنة مع السيطرة الأسماك. على الرغم من أن البيانات الواردة في الشكل 2C تنتهي في 90 يوما وقد لوحظ هذا الانخفاض نفسه لمسافة تصل الى 150 يوما.

الجدول 1. ملخص بروتوكول.

الشكل 1
الشكل 1. الكرتون التي تصور المواقع بتر الذاكرة للتجارب التمثيل الغذائي. واللون الأزرق يمثل الأنسجة التي تعرضت للدولة فرط سكر الدم السابقة. اللون الأخضر يشير إلى الأنسجة التي كانت تزرع 30-60 يوما آخر ارتفاع السكر في الدم. خط منقط السوداء يشير إلى موقع بتر أجريت في 1 لمدة 30 يوما والأحمر يشير إلى موقع بتر المحتملة التي يمكن أن تحدث في 60 يوما.

الشكل 2
الشكل 2. يتم تقليل الذيلية التجديد في مؤشرات مالية السكري (DM) والذاكرة الأيض (MM) الزرد. A. A حقن ممثل صورة الزعنفة الذيلية من عنصر تحكم الأسماك تظهر الكمية المعتادة من ريجenerative النمو آخر ساعة 72 البتر. الخط الأبيض المنقط يمثل بتر الطائرة والخط الوردي الصلبة demarks ثمرة التجدد. يتم تحديد مبلغ التجديد عن طريق تتبع منطقة الواردة في خطوط وردية وبيضاء مقسوما على طول الخط الأبيض لتطبيع حجم الخلافات زعنفة. B. A ممثل صورة من الزعنفة الذيلية إما DM أو MM توضح كمية انخفاض النمو التجديدي 72 بتر آخر ساعة. خطوط وقياسات منطقة هي نفس لوحة العرض C. A. الجرافيك من معدل التجدد النسبية للالزرد وDM MM بالمقارنة مع الضوابط. ويرد النسبي (لضوابط وضعت في 100٪) من ثمرة الزرد وDM MM التجدد في 72 ساعة. الوقت في أيام صورت نسبة إلى حين توقفت STZ الإدارة لمجموعة الذاكرة الأيض. هذه البيانات من قبل الباحثين حيث تولد عدة وإدراج أكثر من 1،000 الأسماك لكل مجموعة. <تم تكييف STRONG> الشكل 2A و 2B الشكل بإذن من أولسن وآخرون 43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

داء السكري هو مرض استقلابي من التقلبات، في البداية تشخيص باسم فرط سكر الدم، وهذا يؤدي في النهاية إلى ضرر الأوعية الدموية مما يؤدي إلى مضاعفات كثيرة التي لا تزال قائمة حتى بعد كل ويتحقق سوائية سكر الدم على الرغم من تدخل الصيدلانية. هذا ويشار إلى مضاعفات استمرار كذاكرة التمثيل الغذائي وعدة دراسات حديثة قد بحثت الدور الذي تضطلع به في آليات جينية هذه الظاهرة. ونحن هنا بالتفصيل البروتوكول الذي يسمح لتوليد كل من السكري الحاد والذاكرة الأيض (استعادة السيطرة على مستويات الجلوكوز) الزرد. وصفناها كذلك المنهجية التي يمكن استخدامها لفصل المساهمات جينية من مكونات تعقيد يحتمل الدولة السكري السابقة. نود أن نؤكد أنه يمكن فحص الأسماك في أي لحظة مع أي مقايسة التي تهم الباحث خاصة وبالتالي فإن تطبيقات المصب لاكتشاف المستقبل لا حصر لها.

THERه العديد من الخطوات في البروتوكول الذي تضمن بعض مزيد من المناقشة والتركيز. في تجربتنا STZ 0.3٪ في محلول تدهور ويفقد فعاليته بعد حوالي 20 دقيقة. ولذلك نقترح أن يتم استخدام جهاز توقيت ويتم حل الطازجة في 20 دقائق. خلال محاولاتنا الأولية لتوليد الزرد السكري كنا باستخدام حقنة واحدة فقط في الأسبوع الأول، وكانت ناجحة مع ما يقرب من 40٪ من الأسماك. على هذا النحو، وليس هناك شرط صارم لمدة ثلاث حقن، ولكن عندما يتم تنفيذ ثلاثة معدل نجاح يفوق 95٪. ثانيا، عندما حقن STZ في الزرد من المهم أن يتم إدراج إبرة بحيث شطبة من الإبرة تماما داخل الأسماك للسماح لتركيب السليم من الحل، ومع ذلك، يجب اتخاذ الحذر أنه لا تخترق بعيدا جدا إلى منع الضرر الداخلي. مرة واحدة تدار STZ أو السيطرة الحل يتم تحضين الأسماك في انخفاض درجة حرارة (22 ° C - 24 والتطويرعلى سبيل المثال؛ C). لا يمكننا التأكيد على أهمية درجة الحرارة وانخفاض بدونه سوف الزرد تجديد خلاياها لا يمكن بيتا (STZ حقن) وارتفاع السكر في الدم يكون ذلك حافزا كفاءة. وأخيرا، في دمائنا الزرد أيدي جلطات بسرعة كبيرة مما يمنع الإجراءات اللازمة الشعرية المطلوبة للاستخدام غلوكمتر كفاءة، وبالتالي فإننا لا ندافع عن استخدامها. لقد وجدنا أن الفحص QuantiChrome وصف ليست فقط ولكن الأكثر موثوقية وأسهل لأداء وتعليم العاملين في المختبرات. بشكل جماعي التقنيات الموضحة في البروتوكول وليس من الصعب وإذا اتخذت الاحتياطات المناسبة مع الخطوات المذكورة أعلاه توليد الزرد السكري هو جميع ولكن مضمونة.

هناك قيود قليلة جدا داخل الإجراء الموضح في هذه المخطوطة، ولكن كل النماذج المخدرات التي يسببها المرض دائما انتقادات من الآثار الهدف من وجهت له. نشير للقارئ أن detailin لدينا مخطوطة الأوليةز هذا النموذج وقدمنا ​​5 خطوط مستقلة من الأدلة (بما في ذلك حقن المباشر في STZ زعانف) توثيق عدم وجود أي آثار الهدف الخروج من STZ 43. ومن أوجه القصور المحتملة لا يأتي من الإجراء نفسه ولكن من حقيقة أن الكواشف للبحوث الزرد ليست بعد على مستوى الكائنات الحية الأخرى مثل نموذج الفئران. لحسن الحظ، كما يجري في الزرد تستخدم بشكل متزايد باعتبارها النموذج الحي لمرض الإنسان يجري هذا النقص معالجته سريعا.

وخلاصة القول، على النحو المفصل في المقدمة، نموذج الزرد من داء السكري وصفها هنا ديها العديد من المزايا أكثر من غيرها من الكائنات نموذج. الأهم من ذلك، أنها تسمح لفحص مكونات جينية بحتة التي تدعم الذاكرة ظاهرة التمثيل الغذائي. كما من المتوقع أن يتم تعاني 400 مليون شخص يعانون من هذا الاضطراب نرى أن مساهمة من الدراسات باستخدام هذا النموذج يمكن أن يكون لها تأثير كبير على صحة الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال منحة بحثية من مؤسسة أسرة ايوكوكا جامعة روزاليند فرانكلين بدء الأموال، والمعاهد الوطنية للصحة منح DK092721 (لRVI). الكتاب أود أن أشكر نيكي Intine للحصول على مساعدات في إعداد مخطوطة.

Materials

DAY PROCEDURE
1
3 DM = STZ حقن (350 ملغ / دل)، نظام حقن المياه المالحة =
5 DM = STZ حقن (350 ملغ / دل)، نظام حقن المياه المالحة =
12 DM = STZ حقن (350 ملغ / دل)، نظام حقن المياه المالحة =
19 DM = STZ حقن (350 ملغ / دل)، نظام حقن المياه المالحة =
21 إما إجراء فحص الأسماك التي تهم DM أو المضي قدما لجعل مجموعات MM عن طريق إزالة الضغط STZ.
51 بتر زعانف 30 يوما بعد الحقن STZ الأخير من الضوابط، والجماعات DM STZ من أجل توليد الأنسجة MM.
81 إعادة بتر زعانف من جميع الفئات في الأنسجة التي كانت تزرع بين يوم 51 و 81 إلى دراسة أداء التجدد. وبدلا من علاج الأسماك / الأنسجة مع مقايسة المصالح.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
  3. Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).
  4. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
  5. Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281, 2005-2012 (1999).
  6. Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. The Steno-2 study. Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).
  7. Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).
  8. Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).
  9. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).
  10. Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet. 376, 419-430 (2010).
  11. Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial. Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).
  12. Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association. Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).
  13. Riddle, M. C. Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial. Circulation. 122, 844-846 (2010).
  14. Patel, A., Macmahon, S., et al. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).
  15. Engerman, R. L., Kern, T. S. Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes. 36, 808-812 (1987).
  16. Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).
  17. Kowluru, R. A. Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes. 52, 818-823 (2003).
  18. Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina. Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).
  19. Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).
  20. Li, S. L., Reddy, M. A., et al. Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice. Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).
  21. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. , (2012).
  22. Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).
  23. Morgan, D. K., Whitelaw, E. The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans. Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).
  24. Ho, L., Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature. 463, 474-484 (2010).
  25. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  26. Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. Genomic imprinting and environmental disease susceptibility. Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).
  27. Blomen, V. A., Boonstra, J. Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell Mol. Life Sci. , (2010).
  28. Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, 549-565 (2009).
  29. Mosammaparast, N., Shi, Y. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases. Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).
  30. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  31. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk. Bioessays. 29, 145-154 (2007).
  32. Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease. Trends Genet. 20, 350-358 (2004).
  33. Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).
  34. Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications. Cardiovasc. Res. , (2011).
  35. Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).
  36. Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. Epigenetic phenomena linked to diabetic complications. Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).
  37. Cooper, M. E., El-Osta, A. Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications. Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).
  38. Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms. Curr. Diab. Rep. , (2012).
  39. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  40. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  41. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).
  42. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  43. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus. Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).

Tags

الطب، العدد 72، علم الوراثة، علم الجينوم، علم وظائف الأعضاء، علم التشريح، والهندسة الطبية الحيوية، الايض، اسماك الزرد، والسكري، والذاكرة الأيض، وترميم الأنسجة، streptozocin، علم التخلق،
نموذج من اسماك الزرد مرض السكري والأيض الذاكرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras… More

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter